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1、中国微循环 2006 年 6 月第 10 卷第 3 期 基金项目： 国家自然科学基金 （30571838） 作者单位： 430022 湖北武汉， 华中科技大学同济医学院附属协 和医院心血管外科 （刘小斌， 张凯伦， 蒋雄刚） ； 湖北省十堰市人民医 院临床医学研究所 （王家宁， 黄永章） 第一作者简介： 刘小斌 （1969-） ， 男， 湖北十堰人， 汉族， 博士研究 生， 副主任医师。研究方向： 心血管外科术后抗凝治疗。 通讯作者 文章编号： 1007-8568 （2006） 03-0163-03论著 t-PA 基因新型真核表达载体的构建及鉴定 刘小斌， 张凯伦， 蒋雄刚， 王家宁， 黄永章
2、 【摘要】 目的 构建人组织型纤溶酶原激活因子 （t-PA） 基因的新型真核表达载体， 为血栓性疾病 的基因治疗奠定基础。方法 将 t-PA 基因克隆到真核表达载体 pcDNA3. 1-Myc-His B （-） 中， 进行酶切 鉴定及 DNA 测序分析， 并将携带有 t-PA 基因的该真核表达载体， 通过脂质体介导， 转染鼠血管平滑肌 细胞， 底物发色法测定转基因血管平滑肌细胞 t-PA 活性。结果 经双酶切鉴定和测序证实已将 t-PA 基因 DNA 片段正确插入到真核表达载体中， 并能在真核细胞中表达、 分泌有活性的 t-PA。结论 成功 构建 pcDNA3. 1-Myc-His B （-
3、） / t-PA 基因新型真核表达载体。 【关键词】 组织型纤溶酶原激活因子； 基因； 真核表达载体 中图分类号： Q344 + . 13 文献标识码： A Construction and Indentification of Human tissue-type Plasminogen Activator Gene Recombinant Eukaryotic Expressing Vector LIU Xiao-bin，ZHANG Kai-lun，JIANG Xiong-gang，et al. Department of Cardiovascular Surgery， Union Hosp
4、ital Affiliated to Tongji Medical College of Huazhong Science and Technology University，Wuhan 430022，China； Institute of Clinical Medicine Affiliated to Yunyang Medical Collage， Shiyan 442000， China 【Abstract】 Objective To construct a recombinant eukaryotic expressing vector pcDNA3. 1-Myc-His B ( -)
5、 / t-PA including functional region of human tissue-type plasminogen activator( t-PA) gene to provide a basis for further study on the therapy of thrombotic disease. Methods The t-PA gene fragment was obtained from PBS/ t-PA cloning vector by restricting enzyme digesting and cloning into pcDNA3. 1-M
6、yc-His B( -) eukaryotic expression vector. Analysis by restricting enzyme digesting and DNA sequencing was carried out to demonstrate the sequence of the plasmid, and pcDNA3. 1-Myc-His B( -) / t-PA was then transfected into VSMC mediated by Lipfectin2000TM. Results It was comfirmed that t-PAcDNA was
7、 inserted into the eukaryotic expression vec- tor correctly by using digestion indification and sequencing. The biological activity of t-PA in the media could be detected in the group with transfected t-PA gene. Conclusion The recombinant eukaryotic expression vec- tor pcDNA3. 1-Myc-His B( -) / t-PA
8、 is successfully constructed. 【Key words】 Human tissue-type plasminogen activator; Gene; Eukaryotic expression vector 随着我国人口老龄化程度的日益加剧， 血栓性 疾病的发病率不断上升， 常引起病人残废和死亡， 严重影响病人生存和生活质量。在血栓性疾病的 治疗中， 组织型纤溶酶原激活因子 （t-PA） 因其特 异、 高效的溶栓作用而倍受关注， 但 t-PA 全身用药 受剂量和持续时间的限制， 因而其基因治疗成为研 究的焦点。本研究拟构建 t-PA 基因的新型真核表 达载体， 为血
9、栓性疾病的 t-PA 基因治疗研究奠定基 础。 材料与方法 1 材料 质粒 PBS/ t-PA 由美国 Cincinnati 大 学医学中心 Sandra J. F. Degen 教授惠赠， Lipfec- tin2000TM， 质粒 pcDNA3. 1-Myc-His B （-） 购自美国 Invitrogen 公司， 其中含 CMV 启动子和新霉素抗性 基因； 大肠杆菌 DH5， 各种限制性核酸内切酶、 T4DNA 连接酶、 RnaseA、 Hind“DNA Marker 购自美 国 Promega 公司， DMEM 高糖培养基、 新生牛血清购 自 GIBCO-BRL 公司， t-PA 活
10、性检测 （底物发色法） 试剂盒购自上海太阳公司。 361 J. of Chinese Microcirculation Jun. 2006，Vol. 10， No. 3 2 方法 2. 1 pcDNA3. 1-Myc-His B （-） / t-PA 真核表达 载体的构建 将含人全长 t-PA 基因序列的质粒 PBS/ t-PA 和质粒载体 pcDNA3. 1-Myc-HisB （-） 分别 经 KpnI 和 NotI 双酶切， 前者回收小片段 （约2.2kb） ， 后者回收 5. 5kb 片段， 按 TA Cloning 方法将回收的 目的基因片段与载体按 31 的比例于 20连接过 夜，
11、取上述连接产物 10 l 转化感受态细菌 DH5， 将转化后的 DH5 涂布于含 100 mg/ L 氨苄青霉素 的 LB 培养板上， 37培养 16 h， 挑取阳性克隆， 扩 大培养后按碱裂解法提取质粒。 2.2 重组质粒酶切鉴定 重组质粒 pcDNA3.1- Myc-His B （-） / t-PA 分别用 KpnI 和 NotI 双酶切和 KpnI 单酶切鉴定， PBS/ t-PA 用 KpnI 和 NotI 双酶切 鉴定， pcDNA3.1-Myc-His B （-） 用 KpnI 单酶切鉴定。 2. 3 DNA 序列测定 将酶切鉴定正确的质粒 交由上海基康公司进行 DNA 序列测定。
12、 2. 4 血管平滑肌细胞的培养与鉴定 选 5 周 龄 SD 大鼠， 取胸腹主动脉， 按贴块法分离、 培养平 滑肌细胞 （VSMC） 。用抗 SM-actin 单克隆抗体通 过免疫细胞化学方法对 VSMC 进行鉴定。0. 25% 胰酶消化传代， 取 4 7 代细胞进行实验。 2. 5 pcDNA3. 1-Myc-His B（-） / t-PA 转 染 VSMC 将细胞经 0. 25% 胰酶消化记数后移入 6 孔 板中， 待细胞长至 70% 时进行转染 （n = 6） ， Lipfec- tin2000TM 介导的 pcDNA3. 1-Myc-His B （-） / t-PA 转 染方法按试剂盒
13、上的操作步骤进行。同法转空载 体组作对照， 并用非转染组作空白对照。 2.6 转基因血管平滑肌细胞 t-PA 活性变化 转染后 48 h， 收集培养液， 离心， 弃细胞碎片， 按底物 发色法试剂盒方法检测 t-PA 活性。另收集转空载体 组和空白对照组细胞培养上清作对照 （各组 n =6） 。 结 果 1 pcDNA3. 1-Myc-His B （-） / t-PA 重组质粒的 酶切鉴定 （图 1） ： 将随机挑取的克隆提取质粒经 KpnI 和 NotI 双酶切后， 可切出约 2. 2kb 和 5. 5kb 片 段， 表明 t-PA 基因已克隆于 pcDNA3. 1-Myc-His B （-）
14、 真核表达载体中。 2 测序结果及比对分析 （图 2） ： 将基康公司测 序结果与 Gene Bank 中的 t-PAcDNA 序列进行比 对， 结果完全一致， 插入方向正确， 表明已成功构建 pcDNA3. 1-Myc-His B （-） / t-PA 真核表达载体。 3 转基因血管平滑肌细胞 t-PA 活性变化： 底 物发色法检测 t-PA 活性 （各组 n =6） ： 转 t-PA 基因 染组 （26. 6 7. 02） IU/106细胞/24 h； 转空载体组和 未转染组细胞培养上清未检测出 t-PA 活性。 讨 论 组织型纤溶酶原激活因子 （t-PA） 因其特异、 高 效的溶栓作用而
15、越来越多的应用于临床 1， 2， 不足 之处是半衰期短， 需持续用药， 费用极为昂贵， 且全 身用药易引起出血等并发症， 使 t-PA 的应用受到很 大限制， 因此 t-PA 的基因治疗倍受关注 3。将外源 性 t-PA 基因导入体细胞内， 使之在局部持续分泌出 活性较高的基因产物， 以防治血栓形成的方法， 具 有良好的应用前景。 基因治疗的前提是目的基因片段必须通过特 定的载体导入真核细胞并能在该细胞中表达。目 前用于外源基因真核表达的载体分为病毒和非病 毒载体两大类， 病毒载体具有转染效率高、 表达稳 定等特点， 但其安全性差， 易产生免疫反应和细胞 毒性 4， 而逆转录病毒载体仅能转染分
16、裂期细胞， 能整合到宿主 DNA 中， 引起细胞畸变。重复使用 病毒载体会诱导免疫反应， 从而削弱转基因的表达 效果 5。非病毒载体可克服这些缺陷， 具有安全可 靠、 容量大、 不整合于宿主细胞 DNA 和操作简单的 461 中国微循环 2006 年 6 月第 10 卷第 3 期 优点。我们选用的真核质粒 PcDNA3. 1-Myc-His B （-） 是一种新型真核表达载体， 能在大多数哺乳动 物细胞内高效表达， 该载体除保留有能在多种细胞 中促进重组蛋白高表达的人巨细胞病毒 （CMV） 增 强启动子及易于插入外源基因片段的多克隆位点 外， 另带有 Myc-His 添加片段， 合成的重组蛋白
17、带有 Myc 决定簇及 6 个多聚组氨酸加尾， 可以很方便的 利用金属螯合剂亲合层析树脂快速纯化蛋白， 并可 以利用抗-Myc 抗体或抗 His 抗体很容易检测合成 的重组蛋白。这为我们在后续实验中进一步纯化 重组蛋白以及体内的功能性研究中对分泌重组蛋 白的定位检测提供了极大的方便， 且该修饰作用不 影响重组蛋白的生物活性。本研究利用分子克隆 方法构建了人 t-PA 基因的新型真核表达载体， 经酶 切鉴定和 DNA 测序证实其序列、 插入方向和阅读 框正确。该载体所携带的 t-PA 基因能够在血管平 滑肌细胞中表达， 并分泌有活性的 t-PA。因此， 该 新型真核表达载体的成功构建为今后血栓相
18、关性 疾病的 t-PA 基因治疗研究奠定了坚实的基础。 参 考 文 献 1 Collen D， Lijnen HR. Thrombolytic agents J . Thromb haemost. 2005， 93 （4） ： 627 630 2 Frey JL. Recombinant tissue plasminogen activator（rtPA）for stroke J . The perspective at 8 years. Neurologist. 2005， 11 （2） ： 123 133 3 Eton D，Yu H， Wang Y， et al. Endograft te
19、chnology： a delivery vehi- cle for intravascular gene therapy J . J Vasc Surg. 2004， 39 （5） ： 1066 1073 4 Simon RH，Engelhardt JF，Yang Y， et al. Adenovrus-mediated gene transfer of the CFTR gene to the non-human primates ： atosicity study J . Hum Gene Tuer. 1993， 4： 771 5 Knowles MR， Hohneker RW， Zho
20、u Z， et al. A controlled study of ade- noviral-vector-mediate gene transfer in the nasal epithelium of patient with cystic fibrosis J . New Engl J Med. 1995， 333： 823 （收稿： 2005 -09 -22 修回： 2006 -01 -20） 作者单位： 214044 江苏无锡， 解放军 101 医院心脏呼吸内科 第一作者简介： 赵秋良 （1965-） ， 男， 汉族， 浙江绍兴人， 副主任医 师。主要从事心脏呼吸专业临床及科研工作。
21、 文章编号： 1007-8568 （2006） 03-0165-01个案报道 冠状动脉介入治疗术后并发脾梗死 1 例 赵秋良， 陈景开， 周辽军， 宗刚军， 吴刚勇， 陈满清， 徐 燕 患者男， 76 岁。因发作性心前区疼痛 2 天入院。查体： 体温、 呼吸正常， 脉搏 60 次/ min， 血压 140/80 mmHg。口唇 无紫绀， 颈静脉无怒张， 心尖部可闻及级吹风样收缩期杂 音。腹部未见异常， 下肢无浮肿。实验室检查： 血常规及出 凝血机制正常， 肝肾功能正常， 心肌酶谱示 LDH 268 / L、 CK 245 / L 均升高， CK-MB 正常。心电图示左房负荷重， ST-T 改变
22、。胸片示主动脉粥样硬化， 腹部 B 超示轻度脂肪肝。 诊断： 冠心病心绞痛。给予硝酸甘油、 肠溶阿司匹林、 丹参等 治疗。入院后 1 周在局麻下行冠脉造影术， 术中见左前降支 完全闭塞， 左冠脉主干及左回旋支未见明显狭窄； 右冠近段 狭窄 90%、 后降支狭窄 95%； 右冠脉狭窄部行 PTCA 并植入 1 个支架。术后给予肝素抗凝、 口服抵克力得及拜阿司匹 林、 抗感染等治疗。术后当晚出现上腹疼痛， 随之恶心、 呕吐 出咖啡色液体约 200 ml， 发热。查体： 上腹部压痛， 无反跳 痛。监护示心率 70 次/ min， 血压降至 95/60 mmHg， 急查心 电图与入院时相似， 考虑为上
23、消化道出血， 即予洛赛克静 注、 去甲肾上腺素、 氢氧化铝凝胶口服， 并停用肝素静滴等 处理后， 患者未再有呕吐， 无黑便， 血压上升至 120/75 mm- Hg。但仍有左上腹痛， 急查血常规示白细胞升高至 12. 1 109/ L， 中性 86%， 血尿淀粉酶、 心肌酶谱正常。遂行上腹部 CT 检查， 结果示脾梗死。改用低分子肝素皮下注射， 并继续 口服抵克力得及拜阿司匹林， 静滴血塞通。治疗 15 d 后腹 痛逐渐缓解， 无胸痛发作， 体温正常， 上腹部压痛消失。复查 腹部 B 超示脾部分回声不均匀。痊愈出院。 讨 论 脾梗死临床少见， 缺乏特征性表现， 部分病例因可自 愈， 临床易被忽
24、视。其发生可由心脏或腹腔动脉内血栓， 动 脉插管术等导致动脉分枝阻塞引起， 也可因红细胞增多症、 恶性肿瘤、 脾血管病变等而形成。较大范围急性脾梗死可 出现突发左上腹疼痛、 压痛、 恶心、 呕吐等症状， 并可有贫血、 白细胞升高和血小板升高。本例患者行经皮冠状动脉介入 治疗， 术后出现脾梗死， 因术中、 术后常规使用肝素静注， 并 已有消化道出血症状， 形成新鲜血栓的可能性极小， 而以心 导管操作刺激后血管内斑块脱落栓塞脾动脉的可能性较 大。提示对于冠脉介入术后出现不明原因的突发上腹疼 痛、 发热、 恶心、 呕吐伴血白细胞、 血小板升高者应想到脾梗 死， 尽快行 B 超、 CT 及动脉造影检查明确诊断， 及时采取相 应治疗措施。 （收稿： 2005 -10 -24 修回： 2006 -01 -09） 561