U230A芯片动态观察非酒精性脂肪性肝病大鼠肝脏基因表达.pdf

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1、中 华肝脏病杂志2 0 0 5 年8 月第1 3 卷第8 期C h i n J H e p a t o l , A u g u s t 2 0 0 5 , V o l 1 3 , N o . 8 5 9 7 其 他 肝 病 U 2 3 0 A芯片动态观察非酒精性脂肪性肝病 大鼠肝脏基因表达 范建高方继伟陆元善钱燕蔡晓波 【 摘耍】目 的探讨大鼠非酒精性脂肪性肝病( NA F L D ) 发生过程中肝脏基因表达谱的改变。 方法通 过持续2 4周高脂饮食诱导大鼠NAF L D模型，应用U2 3 0 A芯片检测不同造模时期肝脏基因表达，并设普通 饮食饲养大鼠作对照。结果与对照大鼠相比，造模4 周和8

2、 周时差异表达基因数分别为4 2 6条和5 4 0条， 上调基因主要为细胞内磷酸化酶基因、代谢酶基因、脂肪酸结合蛋白基因、细胞色素P4 5 0基因以及细胞转 录和分化基因等，下调基因主要为离子通道基因、激素受体基因、细胞勃附基因以及细胞骨架基因等，12 周时差异表达基因有5 0 1条，其中表达上调3 5 2条，除上述基因外，还包括白细胞介素、To l l 样受体4等炎 症和凋亡相关基因;1 6周时差异表达的基因有6 6 5条，其中上调基因4 3 0条，炎症和凋亡相关基因表达进一 步增加，且 I 型胶原等纤维化相关基因出现表达上调，而细胞再生相关基因表达下调; 24周时差异表达的 基因有6 6

3、3条，其中上调基因51 2条，除上述基因表达差异外，主要包括成纤维细胞生长因子、转化生长因 子和胰岛素样生长因子等纤维化相关基因。在所有表达差异的基因中，随着时间进展表达持续上调的基因 共1 2 8条，其中成脂相关基因1 0条，代谢酶基因4 6条，炎症相关基因1 5条、凋亡相关基因1 0条，纤维化 相关基因1 6条。 持续下调的基因有5 2条，包括激素受体相关基因6条，细胞再生相关基因5条，电子转运 基因1 1 条等。 结论高脂饮食大鼠肝脏基因谱呈动态改变，并与NAF L D的组织学进展一致。 【 关扭词】脂肪肝. 大鼠; 基因芯片 A s t u d y o f t h e c h a n

4、g e s o f h e p a t i c g e n e e x p r e s s i o n i n t h e p r o c e s s o f n o n a l c o h o l i c f a t t y l i v e r d i s e a s e d e v e l o p - me n t u s i n g U 2 3 0 A o l i g o n u c l e o t i d e mi c r o a r r a y F A N J i a n - g a o , F A N G J i - w e i , L U Y u a n - s h a n ,

5、Q I A N Y a n , C a i X i a o - b o . D e p a r t m e n t o f D ig e s t i v e D i s e a s e s , S h a n g h a i F i r s t P e o p l e s H o s p i t a l , J i a o t o n g U n i v e r s i t y , S h a n g h a i 2 0 0 0 8 0 , C h i n a E - m a i l : f a 可g c i t i z . n e t A b s t r a c t O b j e c t

6、i v e T o e x p l o r e t h e c h a n g e s o f h e p a t i c g e n e e x p r e s s i o n d u r i n g t h e c o u r s e o f n o n a l c o h o l i c f a tt y l i v e r d i s e a s e ( N A F L D ) d e v e l o p m e n t i n r a t s . Me t h o d s A r a t m o d e l o f N A F L D w a s d e v e l o p e d

7、b y f e e d i n g t h e a n i m a l s a h i g h - f a t d i e t f o r 2 4 w e e k s . L i v e r t i s s u e s o f t h e m o d e l r a t s a n d t h e c o n t r o l r a t s w e r e a n a l y z e d a t d i f f e r e n t t i m e p o i n t s u s i n g r a t U 2 3 0 A ( A f f y m e t r i x G e n e C h i

8、p ) , w h i c h c o v e r s 1 5 6 5 0 g e n e s . R e s u l t s C o m p a r e d w i t h t h e c o n t r o l r a t s , t h e n u m b e r o f g e n e s e x p r e s s e d d i f f e r e n t l y i n t h e m o d e l g r o u p r a t s a t 4 a n d 8 w e e k s w a s 4 2 6 a n d 5 4 0 . T h e u p - r e g u l

9、a t e d g e n e s a m o n g t h e m w e r e i n t r a c e l l u la r p h o s p h o r y la s e g e n e s , m e t a b o li c e n z y m e g e n e s , f a t ty a c i d b in d in g p r o t e i n g e n e s , c y t o c h r o m e P 4 5 0 g e n e s , c e l l u l a r t r a n s c r ip t i o n a n d d i f f e r

10、 e n t i a t i o n g e n e s . T h e d o w n - r e g u l a t e d g e n e s w e r e i o n i c c h a n n e l g e n e s , h o r m o n e r e c e p t o r g e n e s , a n d c y t o s k e l e t o n g e n e s . A t t h e 1 2 t h w e e k , t h e n u m b e r o f t h e g e n e s e x p r e s s e d d i f f e r e

11、 n t l y w a s 5 0 1 , i n w h i c h 3 5 2 w e r e u p - r e g u l a t e d g e n e s , i n c l u d i n g g e n e s r e l a t e d t o i n fl a m m a t i o n a n d a p o p t o s i s s u c h a s i n t e r l e u k i n a n d T o l l - l i k e r e c e p t o r 4 . A t t h e 1 6 t h w e e k , t h e n u m b

12、e r o f t h e d i f f e r e n t l y e x p r e s s e d g e n e s w a s 6 6 5 , w i t h 4 3 0 u p - r e g u l a t e d , s u c h a s t h o s e r e l a t e d t o t h e i n fl a m m a t i o n a n d a p o p t o s i s g e n e s a n d c o l l a g e n I a n d f i b r o s i s g e n e s , h o w e v e r c e l l

13、 r e g e n e r a t i o n g e n e s w e r e d o w n - r e g u l a t e d . A t t h e 2 4 t h w e e k t h e n u m b e r w a s 6 6 3 , o f w h i c h f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r , t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r a n d i n s u l i n - l i k e g r o w t h f a c t o r g e n e

14、 s w e r e u p - r e g u l a t e d . O f a l l t h e d i f f e r e n t l y e x p r e s s e d g e n e s , t h e n u m b e r o f u p - r e g u l a t e d g e n e s w as 1 2 8 , i n c l u d i n g 1 0 l i p o g e n i c g e n e s , 4 6 m e t a b o l i c g e n e s , 1 5 i n fl a m m a t i o n g e n e s , 1

15、 0 a p o p t o s i s g e n e s , a n d 1 6 f i b r o s i s g e n e s ; a n d t h e d o w n - r e g u l a t e d g e n e s w e r e 5 2 , i n c l u d i n g 6 h o r m o n e r e c e p t o r g e n e s , 5 c e l l r e g e n e r a t i o n g e n e s a n d 1 1 基金项目: 上海市青年科技启明星跟踪计划 ( 0 3 Q MH 1 4 0 9 ) 作者单位: 2

16、 0 0 0 8 0上海交通大学附属第一人民医院消化内科、脂肪肝诊治中心 范建高 男， 教授。 E - m a i l : f a n j g c i t i z . n e t 万方数据 中 华肝脏病杂志2 0 0 5 年8 月第1 3 卷第8 期C h i n J H e p a t o l , A u g u s t 2 0 0 5 , V o l 1 3 , N o . 8 e l e c t r o n t r a n p o rt g e n e s . C o n c l u s i o n T h e c h a n g e s o f t h e h e p a t i c

17、g e n e e x p r e s s i o n o f r a t s f e d a f a t - r i c h d i e t a r e r e l a t e d t o t h e d u r a t i o n o f t h e f e e d i n g , a n d a r e c o r r e l a t e d w i t h t h e i r h i s t o p a t h o l o g y i n t h e l i v e r s . K e y w o r d s F a t t y l i v e r d i s e a s e ; R

18、a t s ; G e n e c h i p 三、统计学方法 计算模型大鼠与对照大鼠的标准化信号比值，取 以2 为底的 对数作为其比 值 ( R值) 。以R 值1 . 5 或 1 . 5 表示 模型大鼠/ 对照大鼠 基因 表达显著上调， R- 1 . 5 则 为表达显著下调。从1 5 6 5 0 多条基因中 筛选出 造模过 程中模型鼠与对照鼠标准化信号表达差异在3 倍以上 ( 即R值大于 1 . 5 或小于一 1 . 5 )的基因数。 结果 1 . 肝组织病理学变化: 肝组织切片H E 染色和V G 染色显示， 对照大鼠 肝组织学无异常发现; 造模4 周大 鼠脂肪变累及约3 0 %的肝细胞;

19、 8 周肝脂肪变程度加 剧， 累及约6 0 %的肝细胞; 1 2 周有7 0 %左右的肝细胞 脂肪变， 伴小叶内 散在的点状坏死及炎症细胞浸润; 1 6 周脂肪性肝炎加剧， 可见1 0 个坏死灶融合成片但无明 显肝纤维化; 2 4 周表现为脂肪性肝炎并细胞周围纤维 化呈 “ 鸡笼状改变” 。 2 . 肝组织基因 表达差异比较: 造模不同时期肝组 织与对照肝组织基因表达差异的比较结果， 见表1 。 在 所有表达差异的基因中，随造模时间延长表达持续上 调的基因共1 2 8 条， 其中 成脂相关基因1 0 条、代谢酶 基因4 6 条、 炎症相关基因1 5 条、 凋亡相关基因1 0 条、 纤维化相关基

20、因1 6 条; 持续下调的基因有5 2 条， 包括 激素受体相关基因6 条、 细胞再生相关基因5 条、 电 子 转运基因1 1 条等。 表1 模型大鼠差异表达的基因数 组别差异表达基因数上调基因数下调基因数 、土000了气曰11 只U月峥门jll口 ，.二11.1，1.1 尸J，1，n气 4，汀、j山1 内内、，、411 了no1气气j 气4066 411、J66 大鼠U 2 3 0 A芯片为美国A f f y m e t r i x 公司生产的 新型寡聚核普酸芯片， 涵盖了1 5 6 5 0 余条基因， 具有 高信息量、并行性、集成化等优点。本研究应用此芯 片探讨高脂饮食大鼠非酒精性脂肪性肝

21、病 ( N A F L D ) 发生发展过程中肝脏基因的动态变化，以进一步明确 N A F L D的发病机制。 材料与方法 一、实验材料 持续2 4 周的高脂饮食制备S D 大鼠N A F L D 模型， 分别选取造模4 , 8 , 1 2 , 1 6 , 2 4 周以及普通饮食2 4 周 大鼠肝脏液氮保存标本各1 份用于基因检测， 并对同一 大鼠肝脏石蜡切片作H E 染色和V a n G i e s o n 苦味酸酸 性复红 ( V G )染色。 T r i z o l 试剂和R n e a s y Mi n i 试剂盒分别购自 美国 I n v i t r o g e n L i f e

22、公司、德国Q i a g e n 公司， G e n e C h i p T 7 - O l i g o ( d T ) 引物试剂盒、 S u p e r S c r i p t II 、 双链 c D N A合成试剂盒、R N A转录标记试剂盒、大鼠t e s t 芯片、 U 2 3 0 A芯片，以 及杂交炉、 芯片洗涤系统、 芯 片扫描仪等均购自 美国A f f y m e t r i x 公司。 二、 基因检测 1 . 片段化c RNA的制备: 取液氮保存肝脏用 T r i z o l - 氯仿一 异丙醇， 提取肝脏总R N A ， 紫外分光光 度计定量; 用S u p e r S c

23、r i p t II 和双链c D N A合成试剂盒 合 成 和 纯 化c D N A ; 取5 p 1 纯 化 后的c D N A ， 用R n e a s y M i n i 试剂盒用于体外转录合成c R N A以及c R N A的纯 化及片段化。 2 . 芯片杂交、 扫描和数据分析: 取c R N A片段 1 5 u g 配制杂交液， 9 9 温浴5 m i n , 1 2 0 0 0 r / m i n 离 心5 m i n ， 将杂交液注人基因 芯片中， 4 5 0C , 6 0 r / m i n 预杂交芯片1 0 m i n , 4 5 C， 6 0 r / m i n 杂交芯片

24、1 6 h o 取出芯片， 去除杂交液，加人3 0 0 时漂洗缓冲液直至 芯片舱充满， 应用F l u i d i c s S t a t i o n 4 5 0 系统对芯片进 行洗脱和染色， 应用G e n e C h i p S c a n n e r 1 0 0 0 扫描芯 片， 以M i c r o a r r a y s u i t e 5 . 0 软件分析信号强度， 用 9 个管家基因进行标准化。 基因检测的所有工作均在上 海生物芯片有限公司由专职科研人员进行，并事先做 了预试验。 H 4周 H 8 周 H1 2周 H1 6周 H2 4周 造模4 周和8 周时， 上调基因主要为细胞

25、内 磷酸化 酶基因、代谢酶基因、脂肪酸结合蛋白 基因、细胞色 素P 4 5 0 基因 及细胞转录和分化基因等， 下调基因 主要 为离子通道基因、激素受体基因、细胞砧附基因以及 细胞骨架基因等; 1 2 周大鼠肝脏除上述基因 表达上调 外，同时出现白细胞介素 ( I L ) , T o ll 样受体4 等炎症 万方数据 中 华肝脏病杂志2 0 0 5 年8 月第1 3 卷第8 期C h i n J H e p a t o l , A u g u s t 2 0 0 5 , V o l 1 3 , N o . 8 5 9 9 和凋亡相关基因的表达; 1 6 周时炎症和凋亡相关基因 表达进一步增加，

26、且 I 型胶原等纤维化相关基因出现 表达上调， 而再生相关基因的表达下调; 2 4 周时除上 述基因表达差异外， 成纤维细胞生长因子 ( f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r , F G F ) 、转化生长因子 ( T G F ) 和胰 岛 素 样生长因 子 ( i n s u li n - li k e g r o w t h f a c t o r , I G F ) 等纤维化相关基因表达均显著上调，见表2 0 3 . 代谢、炎症和纤维化相关基因改变: 在造模4 周大鼠肝脏中 参与成脂转录调节的基因如固醇调节元 件结合蛋白 ( s t e

27、r o l r e g u l a t o r y e l e m e n t b i n d i n g p r o t e i n , S R E B P 一 1 ) 、 过氧 化物酶体 增殖物受体Y ( p e r o x i s o m e p r o li f e r a t o r - a c t i v a t e d r e c e p t o r s , P P A R Y ) 及C C A A T / 增强子结合蛋白a ( C C A A T e n - h a n c e r - b i n d i n g p r o t e i n s , C / E B P a )

28、m R N A的 表 表2 芯 片序号G e n B a n k号4周8周1 2 周1 6周2 4 周 飞llnzn只01、J，j000061尹of、叮了00只Q了、00厂D月100了nQ了40八JO了6今ROO八 ，山，一1111，1，111，山11内乙11目11山.11111.工，11111，山11，1 ，乙，1，.人，产00，叉、J ，乙气，11，1 1 3 8 8 6 0 2 1 3 6 8 4 2 3 1 3 6 9 1 7 9 1 3 8 8 4 2 6 1 3 6 9 1 0 1 1 3 6 9 6 5 8 1 3 7 1 0 3 8 1 3 8 7 0 8 7 1 3 8 7

29、3 4 3 A1 2 3 7 3 5 8 NM_ 0 5 3 3 3 3 NM_ 0 1 3 1 2 4 BF3 9 8 8 4 8 NM_ 0 1 2 8 0 5 NM_ 0 1 2 5 2 4 X6 4 4 0 3 NM_ 0 2 4 1 2 5 NM 0 1 3 1 5 4 ，JQO 1 3 6 7 7 0 7 1 3 6 8 6 6 9 1 3 6 8 1 2 6 1 3 6 9 7 5 8 1 3 6 8 1 8 9 1 3 8 6 8 8 0 1 3 6 7 8 5 4 1 3 7 0 2 8 1 1 3 8 7 6 3 0 1 3 6 9 5 6 0 1 3 8 7 1 3 2

30、1 3 8 6 9 6 5 1 3 6 7 9 5 2 NM_ 0 1 7 3 3 2 NM_ 0 1 9 3 5 4 NM_ 0 2 3 1 0 4 U3 6 7 7 1 NM_ 0 2 2 3 8 9 NM_ 1 3 0 4 3 3 与脂肪肝密切相关的表达上调基因 基 因名 称 成脂相关基因 脂 素 抵 抗 素 过氧化物酶体增殖物受体 Y 固醇调节元件结合蛋白1 视黄醇 X 受体 a CC AAT /增强子结合蛋白a C C AAT /增强子结合蛋白Y CC AAT /增强子结合蛋白p C C AAT /增强子结合蛋白6 代谢酶基 因 月 旨 肪酸合成酶 解偶联蛋白2 乙酞辅酶A 合成酶

31、GAPT 胆固醇还原酶 乙酞辅酶A 乙酞转移酶2 AT P柠檬酸裂解酶 脂肪酸结合蛋白5 脂肪酸酞基延长酶 1 甘油磷酸脱氢酶 激素敏感性脂酶 脂蛋白脂酶 低密度脂蛋白受体相关蛋白2 炎症相关基因 肿瘤坏死因子a 热反应蛋白1 2 白介素 1 a 白介素 1 日 白介素 6 受体 凋亡相关基 因 亲环蛋 白 C p 5 7 丝氨酸/苏氨酸激酶1 7 b MAP激酶激活死亡域 纤维化相关基 因 胰岛素样生长因子结合蛋白3 胰岛素样生长因子I 成纤维生长因子 2 成纤维生长因子细胞间结合蛋白 转化生长因子 p3 转化生长因子 9 1 转化生长因子 2 2. 2. 厂060少尹0了04，才00产01

32、气曰气口月咔OC6 . IJ.工1工J胜1，111，1，产11111 ，jUI内jlo八，月了一、，月。0U，J，汀厂0，OOllJ4ll、JI . 11，111目1.1，白，山11111，111，乙1llJ.工111 。O16QO351415，1045497567co65rJ6 . nUllllllll，一，111lllllllnUI八U 4Olr、，八、4内、U，飞口Q少In，nl八，6t汀6 . n01.11101011001.IOll00nUO U1 3 2 5 3 NM_ 1 3 4 3 8 2 NM_ 0 2 2 2 1 5 NM_ 0 1 2 8 5 9 NM_ 0 1 2 5

33、9 8 NM_ 0 3 0 8 2 7 00.5 JqjqO八 000 1 3 6 8 6 3 5 1 3 6 8 0 6 0 1 3 6 8 5 9 2 1 3 9 8 2 5 6 1 3 8 6 9 8 7 NM_ 0 1 9 1 3 5 NM_ 0 3 1 7 1 4 NM_ 0 1 7 0 1 9 NM_ 0 3 1 5 1 2 NM_ 0 1 7 0 2 0 0 . 8 七. 6 0八八 1 3 8 3 0 7 5 1 3 7 2 2 9 9 1 3 8 7 5 0 2 1 3 7 1 4 4 6 B1 2 9 5 8 6 1 A1 0 1 3 9 1 9 NM_1 3 3 3 9

34、2 B1 2 8 3 7 0 3 0. 10. 9 0. 6 2. 00气内乙UU，ROU . ，1，五.111.1.1.11 ，、月峙内乙11 . .1.1.1山.1 0. 5 0. 6 U月研心 00八曰 10声IJU月峙d咤. . 10InJ.工11 ，产Q内乙、凡j，工rj . 001八曰ICUI R1甘，山n曰 八曰nU 1 3 8 6 8 8 1 1 3 8 8 4 6 9 1 3 8 7 6 0 6 1 3 9 9 0 7 2 1 3 6 7 8 5 9 1 3 7 0 0 8 2 1 3 7 6 4 2 5 NM_ 0 1 2 5 8 8 AA9 4 5 6 1 5 NM_ 0

35、 1 9 3 0 5 B 1 2 8 3 0 0 2 NM_ 0 1 3 1 7 4 NM_ 0 2 1 5 7 8 BF4 2 0 7 0 5 0. 0. 卜O 0. 9 万方数据 中 华肝脏病杂志2 0 0 5 年8 月第1 3 卷第8 期C h i n J H e p a t o l , A u g u s t 2 0 0 5 , V o l 1 3 , N o . 8 表3 表达显著下调的基因 4周8周1 2周 一1 . 5 1 6 周 一1 . 8 2 4周 一1 . 9 七000月峰000了6 . 且1工1工1止1工11，石 -一- 月峙1工0八、月峙，了 . 1，11，1，1 -

36、一一- 6，jo八1n，1 . 11，111，11，1 一一-一一-一 014，1 . 01，110，乙1，山 -一-一- 气口月峙1亡1月咔，j 0几-l几-0-l刁-2 芯 片序 号 1 3 7 0 7 8 7 1 3 6 9 0 5 1 1 3 6 9 7 71 1 3 6 9 7 3 9 1 3 8 8 2 6 0 1 3 6 8 0 0 8 1 3 6 9 0 0 0 1 3 71 08 9 G e n B a n k号 AF0 6 5 4 3 3 NM_ 0 1 7 0 7 1 NM_ 0 1 2 9 6 9 D8 5 5 5 8 AF 0 0 7 8 1 8 NM_ 0 2 1

37、7 5 1 NM_ 0 2 1 5 8 9 AA9 4 5 0 8 2 基 因名称 B c l 2 样 1 1 胰岛素受体 胰岛素受体底物 1 瘦素受体 细胞周期蛋白D1 生长促进素 Tr k前体 谷肤昔肤-S 一转移酶 达出现升高趋势，1 2 周时分别达到对照组的4 . 3 , 4 . 6 和4 倍; 参与甘油三醋合成的代谢酶基因如乙酞C o A 竣化酶、乙酞乙酸C o A合成酶、 脂肪酸合成酶、 葡萄 糖一 3 一 磷酸酞基转移酶、脂肪酸连接蛋白、脂肪酸酸 基延长酶、三磷酸腺昔柠檬酸裂解酶、甘油磷酸脱氢 酶、 激素敏感性脂酶等自8 周起即明显上调达对照组的 3 倍以上 ; 参与胆固醇合成的

38、代谢酶基因如胆固醇还 原酶、低密度脂蛋白 受体等也有不同程度的升高。造 模8 周时脂肪变的肝脏出现脂肪源性细胞因子基因， 如 脂素、 抵抗素的表达， 至造模1 6 周时达到对照大鼠的 4 倍以上。 肿瘤坏死因子 ( T N F a) 、 I L - 1 和I L - 6 及 其受体、环抱素A受体C等炎症和凋亡相关基因自 造 模1 2 周时出现升高趋势， 1 6 周时达对照组的3 倍以上， 同时T G F p 、 I G F 及F G F 等纤维化相关基因表达显著 上调，见表2 0 N A F L D 形成过程中 表达下调3 倍以上的基因， 见 表3 ， 其中胰岛素受体及其相关底物、长型瘦素受体

39、 ( O B - R b ) 等呈下降趋势，以造模第1 2 周改变最为明 显; 影响肝细胞再生的细胞周期蛋白 和抗凋亡B细胞 淋巴 瘤白 血病一 2 ( B c l - 2 ) 基因表达也明显减少。 讨论 研究结果发现随着造模时间的延长N A F L D大鼠 肝脏基因呈动态变化，且与肝脂肪变、炎症和纤维化 等病理学改变相对应n 1 0 基因芯片检测结果显示，高脂饮食4周起肝脏 S R E B P - 1 、 P P A R y 及C / E B P a 等参与成脂转录基 因的表达就呈升高趋势，其靶基因脂肪酸合成酶、乙 酞C o A梭化酶、 脂肪酸连接蛋白、 葡萄糖一 3 - 磷酸酸 基转移酶等

40、脂肪酸合成的关键酶表达随之上调，到造 模8 周时达峰值， 导致肝细胞内大量游离脂肪酸 ( f r e e f a t t y a c i d s , F F A ) 和甘油三醋积聚， H E 染色显示肝 脏呈弥漫性脂肪变。造模1 2 周起肝脏出现脂素、 抵抗 素等脂肪特异性细胞因子的阳性表达。研究证实C / E B P a、 P P A R y 及S R E B P - 1 是调节脂肪组织分化 成熟、促进脂肪合成、维持机体脂质和能量稳态的重 要转录因子， 且三者之间相互协同2 , 3 1 。正常情况下， 肝细胞无或仅有P P A R y 和S R E B P 一 1 少量表达。我 们以前的研究

41、曾发现，高脂饮食NAF L D大鼠肝脏 P P A R y 和U C P 2 m R N A及其蛋白 含量较对照组显 著增加。H o r t o n 等3 1发现应用转基因方法使小鼠 肝脏 中的S R E B P - 1 表达量高于生理水平时， 可通过诱导 其靶基因， 如乙酞C o A梭化酶、 脂肪酸合成酶、 葡萄 糖一 3 一 磷酸酞基转移酶、 脂肪酸连接蛋白等的表达而 促进肝内脂质的合成。Y u 等a 1也发现给小鼠注射过量 的P P A R y 可引起肝脂肪变， 并 伴有肝脏表达脂肪细 胞特异性基因和成脂相关基因的增加，由此认为脂肪 化的肝脏可能具有脂肪细胞的部分功能而发生成脂性 改变，

42、 P P A R y 和S R E B P - 1 的过度或异位表达在肝 脏成脂过程中可能起着重要的作用。 造模1 2 周起T N F a 、 I L - 1 , I L - 6 及其受体等炎 症相关基因表达显著增加，这与其肝组织呈现脂肪性 肝炎相一致， 提示细胞因子作为 “ 二次打击”可促使 脂肪性肝炎的发生。既往逆转录聚合酶链反应和免疫 组织化学研究也证实高脂饮食脂肪性肝炎大鼠 肝脏内 毒素受体 ( C D 1 4 和T o l l 样受体4 ) 和T N F a 表达上 调，库普弗细胞数量增多并处于激活状态，伴血清 T N F a 和I L - 1 的水平显著升高11 1 , 肝脏、心脏

43、和胰腺等非脂肪组织中脂质过度蓄积 可导致细胞或组织的功能障 碍甚至死亡，产生脂毒性 ( li p o t o x i c ) 或脂凋亡 ( li p o a p o p t o s i s ) , F F A 是引起脂 毒性的重要因素， F F A可诱导f a / f a Z D F 大鼠 脂肪化 的胰岛细胞内 神经酞胺的合成，使可诱导性一氧化氮 合酶的表达上调， 一氧化氮和过亚硝酸盐的合成增加， 从而促发脂质过氧化反应， 介导细胞的 凋亡; 且F F A 可诱导具有抗凋亡作用的B c l - 2 的表达下降，从而引 万方数据 中 华肝脏病杂志2 0 0 5 年8 月第1 3 卷第8 期C h

44、 i n J H e p a t o l , A u g u s t 2 0 0 5 , V o l 1 3 , N o . 8 6 01 起非脂肪组织脂凋亡的发生4 1 o L e e 等5 1发现与野生型大 鼠 相比， f a / f a Z D F 大鼠发生脂肪变的肝脏B c l - 2 表 达明显下调，补充瘦素受体后，肝脏脂肪含量下降， B d - 2 的 表达恢复正常。 本次实验发现造模1 2 周时， 模型组大鼠 肝脏中出 现环抱素A受体、 p 7 5 凋亡相关蛋白及细胞周期蛋白 激酶抑制剂1 C的表达上调， 环抱素A受体C与凋亡 核酸酶N U C 1 8 的 序列相似， 可降解D

45、N A而促进细胞 凋亡;而介导凋亡平衡过程的B c I - 2 及具有抗脂毒性 的O B - R b 的表达则下降6 1 。 提示N A F L D过程中由 于 F F A的过度积聚， 导致肝脏发生成脂性改变， 肝细胞 发生凋亡的危险度大大增加。 肝脂肪变是发生脂肪性肝纤维化的基础，脂肪蓄 积使肝脏对损伤的敏感性增加，其严重程度与发生肝 纤维化及肝硬化的危险度成正比。脂肪性肝炎患者肝 脏F G F 、结缔组织生长因子的表达上调， 肝星状细胞 活化为肝纤维化、 肝硬化的发生提供了细胞基础7 1 。 本 次实验中， 造模1 6 周时I G F , T G F R 、 F G F 等纤维化 相关基因

46、出现不同 程度的表达，2 4 周时其表达均达到 对照组大鼠的3 倍以 上。相应的病理学检查显示1 6 周 时肝纤维化不明显， 而2 4 周时呈现明显的窦周纤维化， 且既往逆转录聚合酶链反应和免疫组织化学研究发现 造 模大鼠 肝脏T G F 表达增强11 1 , 高脂饮食通过引起大鼠肝脏成脂和代谢酶相关基 因的一系列改变，导致肝细胞脂肪蓄积，使凋亡和纤 维化的危险 性增加， 进一步证实了N A F L D不是一种 良 性疾病，肝脂肪变是发生脂肪性肝炎和纤维化的始 动因素。 参考文献 1 F a n J G , X u Z J , W a n g G L , e t a l . C h a n g

47、 e o f s e r u m e n d o t o x i n l e v e l i n t h e p r o g r e s s o f n o n a l c o h o l i c s t e a t o h e p a t i t i s i n r a t s . Z h o n g h u a G a n z a n g b i n g Z a z h i , 2 0 0 3 , 1 1 : 7 3 - 7 6 . 范建高， 徐正婕， 王国良， 等. 大鼠非酒精性脂肪性肝炎形 成过程中血清内毒素含量的变化. 中华肝脏病杂志， 2 0 0 3 , 1 1 : 7 3 -7

48、6 . 2 F a n J G , D i n g X D , Wa n g G L , e t a l . O v e r e x p r e s s i o n o f p e r o x i s o m e p r o l i f e r a t o r - a c t i v a t e d r e c e p t o r s g a m m a i n t h e l i v e r o f r a t s w i t h n o n - a l c o h o l i c f a t t y l i v e r d i s e a s e c h r o n i c a l l y

49、 f e d w i t h h i g h - f a t d i e t . G a n z a n g , 2 0 0 4 , 9 : 2 2 5 - 2 2 8 . 范建高， 丁晓东， 王国良， 等. 高脂饮食性非酒精性脂肪性 肝病大鼠肝脏P P A R一v 表达增强.肝脏，2 0 0 4 , 9 : 2 2 5 一 2 2 8. 3 H o r t o n J D , S h a h N A , Wa r r i n g t o n J A , e t a l . C o m b i n e d a n a l y s i s o f o l i g o n u c l e o t i d e m i c r o a r r a y d a t a f r o m t r a n s g e n i c a n d k n o c k o u t m i c e i d e n