[农业标准]-NYT559-2002.pdf

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1、I C S 1 1 . 2 2 0 B4 1 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 N Y / T 5 5 9 -2 0 0 2 禽曲霉菌病诊断技术 D i a g n o s t i c t e c h n i q u e s f o r a v i a n a s p e r g i l l o s i s 2 0 0 2 一 0 8 一 2 7 发布 2 0 0 2 门2 一 0 1实施 中 华 人 民 共 和 国 农 业 部 发 布 4 6 3 N Y / T 5 5 9 -2 0 0 2 前言 禽曲霉菌病( a v i a n a s p e r g i l l o s

2、 i s ) 是多种禽类、 哺乳动物和人畜共患的一种真菌病。 主要侵害呼吸系 统， 在肺和气囊发生炎症和小结节， 导致呼吸困难， 甚至窒息死亡。 病原体主要为曲 霉属( A .s p e r g i l l u s ) 中 的烟曲霉( A . f u m i g a t u s ) 和黄曲霉( A . f l a v u s ) ， 其次为构巢曲霉( A . n i d u l a n s ) , 黑曲霉( A . n i g e r ) 和土曲 霉( A . t e r r e u s ) 等。 本病发生于世界各地， 对雏鸡的危害最大， 可引起幼雏大批死亡， 造成重大经济损失。 对曲霉菌病的

3、诊断， 近年来提出了一些新技术。 但是， 各国确定的常用方法， 仍是本标准规定的病理 学检查和病原学检查。 病理学检查( 包括在病变组织内发现曲霉菌) 可以确定病性， 病原学检查不仅可以 提高诊断率， 而且能够鉴定曲霉菌菌种。 国际上无相应的诊断标准或规范可供参照。本标准的实施， 对提高我国禽曲霉菌病的诊断水平， 保 证养禽业健康发展， 将起到重要的作用。 本标准的附录A、 附录B为规范性附录。 本标准由农业部畜牧兽医局提出。 本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。 本标准起草单位: 中国人民解放军军需大学。 本标准主要起草人: 宜华、 向华。 NY / r 5 5 9 -2 0 0 2

4、禽曲霉菌病诊断技术 1 范围 本标准规定了禽曲霉菌病病理学和病原学检查的技术要求。 本标准适用于禽( 鸟) 类曲霉菌病的诊断和检疫。 2 病理学检查 2 . 1 材料准备 2 . 1 . 1 器材 小动物解剖器具， 灭菌试管( 供采集真菌学检查样品用) ， 普通显微镜等。 2 . 1 . 2 试剂 体积分数为1 0 %的甲 醛溶液， 3 0 % 甘油缓冲 溶液， 其配方见附录A o 2 . 2 尸体剖检方法 按照常规的禽类尸体剖检术式， 将可疑病禽的各内脏器官取出， 逐一检查。重点检查呼吸系统。如 发现可疑病变， 先取1 份置于无菌中试管内或3 0 %甘油缓冲溶液( 见第A . 1 章) 中，

5、 供病原学检查用， 再 取 1 份置人 1 0 写甲醛溶液内， 供病理组织学检查用。 2 . 3 主要病理变化 禽曲霉菌病的病变主要见于呼吸系统， 在肺脏和气囊形成数量不等、 粟粒大至绿豆粒大的结节， 结 节质地较硬， 切面呈同心圆轮层状。 显微镜检查， 见结节周边为淋巴细胞、 多核巨细胞和成纤维细胞构成 的肉芽组织， 中央为干酪样坏死区， 内含大量的霉菌菌丝。 可在气囊、 气管、 支气管、 肺脏及腹膜表面形成 大小不一的霉菌斑， 菌斑上有灰绿色粒状物或绒球状物。此外， 有时在眼睑内、 肝、 脾、 肾、 消化系统乃至 神经系统表面也能发现类似的结节或菌斑病变。 3 病原学检查 I1 材料准备

6、3 . 1 . 1 器材 载玻片， 盖玻片， 培养皿， 铂金耳或针， 恒温箱， 手术刀， 普通显微镜等。 3 . 1 . 2 试荆 2 0 0 o 氢氧化钾溶液， 乳酸酚棉蓝染色液， 沙保劳( S a b o u r a u d ) 氏葡萄糖琼脂培养基或改良 察贝克 ( C z a p e k ) 氏琼脂培养基等， 其配制方法见附录Ae 31 . 3 样品采集 对病理学检查可疑的病禽， 应无菌操作采取带有病变( 如结节、 霉菌斑等) 的组织各数小块， 置于灭 菌容器( 如中试管) 内冷藏， 并尽快送检， 如果不能立即送检， 可暂时保存于3 0 %甘油缓冲液中。 3 . 2 检查方法 3 . 2

7、 . 1 压滴标本法 取结节置于载玻片上， 用手术刀切开， 由切面刮取干酪样坏死组织， 或由病变组织表面刮取霉菌斑， 或用铂金针钩取纯培养物置于载玻片中央， 加 1 -2 滴乳酸酚棉蓝染色液或生理盐水， 用大头针将组织 块或菌团撕扯开， 压上盖玻片( 注意勿产生气泡) ， 制成压滴标本。如果组织碎块较硬， 可改用 1 -2 滴 N Y/ T 5 5 9 -2 0 0 2 2 0 Y o 氢氧化钾( K O H ) 溶液， 并在火焰上微微加温后压片。显微镜检查时， 先用低倍物镜发现目标， 再用 高倍物镜详细观察菌体形态。经棉蓝( 见第A . 2 章) 染色的菌体呈蓝色。 3 . 2 . 2 分离

8、培养法 取沙保劳( S a b o u r a u d ) 氏葡萄糖琼脂培养基( 见第A . 3 章) 或改良察贝克氏琼脂( 见第A . 4 章) 培养 皿若干个( 通常每份样品用4 个) ， 做好标记。将铂金耳在火焰上烧灼灭菌， 冷却后钩取干酪样坏死组织 或霉菌斑， 均匀涂抹于培养基表面; 或者用铂金针蘸取样品， 小块点播刺种于培养基表层。接种完毕， 将 铂金耳或针在火焰上烧灼灭菌， 将接种过的培养皿放在2 7 -C 或3 7 恒温箱内进行培养。 通常于3 6 h 后 即可见菌落出现。菌落形态见附录B ( B . 2 . 1 . 1 , B . 2 . 2 . 1 , B . 2 . 3 .

9、 1 , B . 2 . 4 . 1 和B . 2 . 5 . 1 ) , 4 结果判定 在可疑病禽( 鸟) 的病变组织中， 观察到或分离出曲霉菌， 即可确诊为禽曲霉菌病。如要确定为何种 曲霉菌所感染， 则需参照附录B， 依据菌落和菌体的形态特征， 对所分离的曲霉菌进行菌种鉴定。 N Y / T 5 5 9 -2 0 0 2 附录A ( 规范性附录) 主要试荆的配制方法 A. 1 1 0 3 . A. 2 质.浓度为 3 0%的甘油缓冲液 甘油( 化学纯)3 0 . 0 m L 抓化钠( N a C I ) 0 . 5 g 磷酸氢二钠( N a , H P 0 , ) 1 . 0 g 蒸馏水加

10、至1 0 0 . 0 m L 先用少量蒸馏水溶解抓化钠和磷酸氢二钠， 再加人甘油， 最后用蒸馏水补足量， 混合， 分装， 于 6 k P a 灭菌1 5 m i n -2 0 m i n 后保存备用。 乳酸酚棉蓝染色液 结晶石炭酸2 0 . 0 0 g 乳酸2 0 . 0 0 mL 甘油4 0 . 0 0 m I 棉蓝0 . 0 5 g 蒸馏水2 0 . 0 0 m l 将棉蓝溶于蒸馏水中， 再加人结晶石炭酸、 乳酸、 甘油， 混匀， 备用 A . 3 沙保劳( S a b o u r a u d ) 氏有萄精琼脂培养基 葡萄糖4 0 g 蛋白 陈1 0 g 琼脂粉1 8 g -2 0 g 蒸

11、馏水1 0 0 0 m L 将以上成分倒人烧杯或三角烧瓶内， 先加少量蒸馏水加热溶解。 待完全溶解后补足蒸馏水至所需要 的总体积， 并加人抓霉素5 0 p g / m L -1 0 0 p g / m L ， 用四 层纱布过滤， 按要求定量分装于小烧瓶或中 试管 内， 塞以棉塞， 再于棉塞外加包牛皮纸和油纸各一层， 挂上标签， 于1 0 3 . 6 k P a 灭菌1 0 m i n -1 5 m i n 后 保存备用。 A . 4 改良察贝克( C z a p e k ) 氏琼脂培养基 蔗糖 硝酸钠( N a N O O 磷酸二氢钾( K H 2 P O 4 ) 硫酸镁( M g S O ,

12、 ) 氛化钾( K C I ) 硫酸亚铁( F e S 0 4 7 H 2 0) 抓化钠( N a C I ) 琼脂粉 蒸馏水 配制快 同 A. 3 n 3 0 . 0 0 g 3 . 0 0 g 1 . 0 0 g 0 . 5 0 g 0 . 5 0g 0 . 0 1 g 6 0 . 0 0 g 1 8 g -2 0 . 0 0 g 1 0 0 0 . 0 0 mL N Y / r 5 5 9 -2 0 0 2 附录B ( 规范性附录) 禽曲易菌病有关的曲.菌的鉴别要点 B . 1 概述 引起禽曲霉菌病的病原体主要为烟曲霉和黄曲霉， 其次为构巢曲霉、 黑曲霉和土曲霉等， 这些曲霉 菌都具有如

13、下共同的形态结构: a ) 菌丝: 有隔， 细胞多核; b ) 分生抱子梗: 由特化的膨大而厚壁的菌丝细胞( 即足细胞) 的中部向上叉生而成; c ) 顶囊: 分生抱子梗顶端的膨大部分， 呈球形、 椭球形、 烧瓶形或棍棒形; d ) 小梗: 被覆于顶囊周边， 一层或两层。如为两层， 则内层叫梗基， 外层叫瓶梗; e ) 分生抱子: 成串排列于小梗的游离端。 但是， 不同的菌种在这些结构的形态上又有明显的不同。根据这些不同点， 特别是分生抱子头( 顶 囊、 小梗、 分生抱子三部分的合称) 的特征， 结合菌落的形态和颜色， 可将这几种曲霉菌区别开。 禽曲霉菌 病中常见曲霉菌形态见图B . 1 ,

14、N Y / T 5 5 9 -2 0 0 2 分生抱了 小梗 顶班 分生抱 子梗 A 一 一 烟曲霉; B 一一黄曲每; C - 一 构巢曲舞; D一 黑曲霉。 E- 一 土曲霉。 图 B . 禽曲称菌病中常见曲碑菌形态比较示愈图 B . 2 鉴别要点 B . 2 . 1 B . 2 . 1 . 烟曲尽( A s p e r g i l l u s f u m i g a t u s ) 菌落形态 烟曲霉在沙保劳氏葡萄糖琼脂培养基上生长良好， 发育很快。开始菌落呈白色绒毛样或棉花丝样， 3 d -4 d内， 菌落中心变为烟绿色或深绿色， 表面微细粉末状或绒毛样( 形成大量分生抱子之故) 。菌落

15、 背面无色或略带黄褐色。 在察贝克氏培养基上， 生长旺盛， 菌落呈绒毛状， 气生菌丝直立而丰富， 分生抱子头初呈白色或微带 蓝色， 有呈绿色者， 继而转变为黑褐色。菌落背面无色或呈黄色， 老菌落则可呈暗红色。 N Y/ r 5 5 9 -2 0 0 2 B . 2 门. 2 菌体形态 参见图B . 1中A, a ) 分生抱子梗: 光滑， 较短( 3 0 0 p m -5 0 0 p m ) ， 宽5 p m -8 p m， 常带绿色; b ) 顶囊: 烧瓶形， 直径 2 0 p m -3 0 p m， 绿色; c ) 小梗: 生于顶囊上部， 单层， 梗长6 p m -8 p m， 梗粗2 .

16、5 p m -3 . 0 p m， 排列紧密; d ) 分生抱子: 球形或近球形， 直径2 . 5 p m-3 . 0 p m， 表面粗糙有细刺， 带绿色; e ) 菌核: 不产生。 B . 2 . 2 黄曲娜( A s p e r g i l l u s f l a v u s ) B . 2 . 2 门菌落形态 菌落生长迅速， 至1 0 d -1 4 d 时， 直径可达3 c m-7 c m。初似黄色粉末， 继而密集隆起， 变为黄绿 色， 日久则成棕绿色。表面平坦或有放射状沟纹。菌落背面无色或带褐色。 B . 2 . 2 . 2 菌体形态 参见图B . 1 中B a ) 分生抱子梗: 长约

17、4 0 0 p m -1 0 0 0 p m， 宽约1 0 p m -2 0 p m , 微弯曲， 梗壁极粗糙， 近顶囊处略 膨大， 无色; b ) 顶囊: 烧瓶形、 球形或近球形， 直径约1 0 p m -6 5 p m， 但多数在2 5 p m 4 5 p m间; c ) 小梗: 单层、 双层或单层双层并存于一个顶囊上， 但以双层者居多。 梗基长约7 p m -1 0 p m ， 宽 约4 . 0 p m 5 . 5 p m， 布满顶囊表面。瓶梗长约6 . 5 p m - 1 0 . 0 p m， 宽约3 p m -5 p m; d ) 分生抱子: 球形、 近球形或梨形， 直径约3 . 5

18、 p m 6 . 0 p m， 表面粗糙; e ) 菌核: 有些菌系产生褐色菌核。 B . 2 . 3 构巢曲忿( A s p e r g i l l u s a i d u l a n s ) B . 2 . 3， 菌落形态 在察贝克氏琼脂培养基上于2 7 下培养， 菌落生长快速， 至1 4 d 时直径达5 c m -6 c m。最初为光 滑绒毛 状， 亮绿色， 平 铺生长， 继而变为暗绿 色， 中 心呈粉 末状， 边缘有绒毛 状菌丝。 菌落背面 深红色 至紫 红色。当闭囊壳形成时， 菌落中心向外长出一些小白点， 菌落呈黄褐色。 B . 2 . 3 . 2 菌体形态 参见图B . 1 中C

19、o a ) 分生抱子梗: 极短( 长约7 5 p m -1 0 0 p m， 宽约3 . 5 p m -5 . 0 p m ) ， 常有波状弯曲， 近顶囊处稍 膨大， 壁光滑， 带褐色或肉桂褐色; b ) 顶囊: 半球形， 直径8 p m -1 0 p m; c ) 小梗: 双层， 梗基短( 长约5 p m -6 p m， 宽约2 p m) ， 分布于顶囊的顶部， 呈放射状排列; 瓶梗长 约5 p m -6 p m, 宽约2 . 0 p m -2 . 5 p m; d ) 分生抱子: 球形， 直径3。 p m -3 . 5 p m， 表面粗糙有小刺， 绿色; e ) 闭囊壳: 为该菌有性阶段的

20、产物， 球形， 直径约1 3 5 p m -1 5 0 p m， 略呈紫红色， 内含子囊抱子。 成熟的闭囊壳被淡黄色的壳细胞所包围。 B . 2 . 4 黑曲耳( A s p e r g i l l u s n i g e r ) BZ . 4 门菌落形态 在察贝克氏 琼脂培养基上于2 5 C 下培养， 菌落扩展迅速， 至1 0 d -1 4 d 直径可达2 . 5 c m -3 . 0 c m, 初期有丰富的白色羊毛状气生菌丝， 并常出现鲜黄色区域， 继而变成粗绒状， 黑色、 黑褐色。菌落背面无 色， 或仅中心部分略带黄褐色。 B . 2 . 4 . 2 菌体形态 参见图B . 1 中D ,

21、 a ) 分生抱子梗: 长约2 0 0 g m -4 0 0 p m ， 也有长达1 0 0 0 p m以 上者， 宽约1 0 p m -2 0 p m， 壁厚、 光 滑， 无色或梗的上部稍带黄色; N Y / T 5 5 9 -2 0 0 2 b ) 顶囊: 球形或近球形， 直径4 5 p m-7 5 p m， 无色或带黄褐色; c ) 小梗 双层， 紧密排列于整个顶囊表面， 呈放射状， 褐色。梗基约4 0 0 -5 0 0 个， 每个梗基长约 2 0 p m-3 0 p m， 宽约5 j A m -6 p m， 有时更宽并具有横隔; 瓶梗较短， 长约7 p m -1 0 p m， 宽约 3

22、 . 0 L m一3 . 5 p m ; d ) 分生抱子: 球形， 直径4 L m -5 p m, 褐色， 表面极为粗糙; e ) 菌核: 有些菌系产生菌核， 从不定形到圆形， 直径约1 0 0 0 p mo B . 2 . 5 土曲.( A s p e r g i l l u s t e r r e u s ) B . 2 . 5 . 1 菌落形态 在察贝克氏琼脂培养基上生长较快， 至 1 0 d时菌落直径达3 . 5 c m-5 . 0 c m。 呈圆形， 初平坦， 或有 放射状皱纹， 渐而表面呈绒状， 偶呈絮状， 肉桂色或沙褐色。菌落背面培养基黄色或污褐色。 B . 2 - 5 . 2

23、 菌体形态 参见图B . 1 中E . a ) 分生抱子梗: 长约1 0 0 p m-2 5 0 p m， 宽约4 . 5 u m- - 6 . 0 p m， 微弯曲， 近顶囊处稍膨大， 光滑， 无 色; b ) 顶囊: 半球形， 直径 1 0 p m - - 1 6 p m; 。 ) 小梗: 双层， 梗基长约5 p m-7 p m， 宽约2 . 0 p m -2 . 5 p m， 平行密集于顶囊顶部; 瓶梗长约 5 . 5 p m -7 . 5 p m， 宽1 . 5 p m -2 . 0 p m; d ) 分生抱子: 球形或近球形， 直径约2 p m， 表面光滑无棘; e ) 菌核: 不产生。