三种噬菌体对二氯异氰尿酸钠消毒剂抵抗力的比较.pdf

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1、基金项目： 深圳市医疗卫生系统 2005 年科技计划非资助项目 （深科信 2005 227 号） 作者单位： 610041 成都， 四川大学华西公共卫生学院医学检验 教研室 通信作者： 陈昭斌， 518054 深圳市南山区疾病预防控制中心消 毒科 论著 三种噬菌体对二氯异氰尿酸钠消毒剂 抵抗力的比较 陈昭斌 张朝武 许欣 朱敏 王国庆 【摘要】 目的 筛选出消毒实验中评价消毒因子对病毒灭活效果的指示噬菌体， 研究噬菌 T4、 x174D 和 f2 对二氯异氰尿酸钠 （NaDCC） 消毒剂的抵抗力。方法 消毒剂对噬菌体的灭活效果采用 悬液定量灭活实验、 中和剂鉴定实验， 噬菌体的检测采用双层琼脂

2、法。结果 （1） 有效氯浓度为 150 mg/ L 的 NaDCC 溶液与噬菌体 T4 作用 40 min， 或有效氯浓度为 300 mg/ L 作用 5 min， 即可达到消毒 水平 对噬菌体 T4 的灭活对数值或噬菌体 T4 的对数减少值 （log10No-log10Nt） 4. 00 log10 。 （2） 有 效氯浓度为 300 mg/ L 的 NaDCC 溶液与噬菌体 x174D 作用 5 min， 或有效氯浓度为 400 mg/ L 作用 3 min达到消毒。 （3） 有效氯浓度为 2000 mg/ L 的 NaDCC 溶液与噬菌体 f2 作用20 min， 或有效氯浓度 为 40

3、00 mg/ L 作用 5 min 达到消毒。结论 上述 3 种噬菌体对 NaDCC 的抵抗力为： 噬菌体 f2 噬菌 体 T4 噬菌体 x174D。 【关键词】 噬菌体； 二氯异氰尿酸钠； 抵抗力 Comparison on resistance of bacteriophages to sodium dichloroisocyanurate in laboratory CHEN Zhao-bin，ZHANG Chao-wu，XU Xin，ZHU Min， WANG Guo-qing.Department of Medical Laboratory Technology，West China

4、 School of Public Health，Sichuan University，Chengdu 610041， China Corresponding author： CHEN Zhao-bin，Center for Disease Control and Prevention of Nanshan District， Shenzhen 518054，China 【Absract】 Objective To scan the most resistable bacteriophage as an indictor in disinfection tests， and to study

5、the resistance of bacteriophage T4，x174D，and f2 to the sodium dichloroisocyanurate （NaDCC）in laboratory. Methods The virucidal activity of NaDCC against bacteriophage T4，x174D， and f2 were assessed by suspension test. The neutralizer was selected and be appraised by test of neutralizer. Bacteriophag

6、e T4，x174D， and f2were detected and enumerated by the double-agar-layer plaque technique. Results （1）With 150 mg/ L of available chlorine of NaDCC solution，within a contact time of 40 minutes， or 300 mg/ L，5 minutes，the reductions of bacteriophage T4 achieved the “ disinfection”level log10 inactivat

7、ion value or log10reduction value of bacteriophage T4（log10No-log10Nt） 4. 00 log10 .（2）With 300 mg/ L of available chlorine of NaDCC solution，within a contact time of 5 minutes，or 400 mg/ L，3 minutes，the reductions of bacteriophage x174D achieved the“disinfection”level. （3） With 2000 mg/ L of availa

8、ble chlorine of NaDCC solution，within a contact time of 20 minutes，or 4000 mg/ L，5 minutes， the reductions of bacteriophage f2 might achieve the“disinfection”level. Conclusion The order of resistance of the above three bacteriophages to NaDCC from greatest to smallest is as follows： bacteriophage f2

9、 bacteriophage T4 bacteriophage x174D. 【Key words】 Bacteriophages； Sodium dichloroisocyanurate； Resistance 噬菌体 （bacteriophage， 或 phage） 是原核生物 （包括真细菌和古细菌） 的病毒， 又称细菌病毒 （bacterial viruse） 。1915 年和 1917 年分别由 Twort 和 D Herelle 两位科学家发现， 并由 D Herelle 命 名 1。根据核酸类型、 颗粒形状及有无包膜存在分 为 14 个科 1。噬菌体 T4 为线状双链 DNA， 属

10、于肌 尾噬菌体科 1； 噬菌体 x174 为环状单链 （ + ） DNA， 属于微小噬菌体科 2； 噬菌体 f2 为单链 RNA， 属于轻小噬菌体科 2， 三者均为裂解宿主菌的烈性 噬菌体 1， 2。 二氯异氰尿酸钠 （sodium dichloroisocyanurate， NaDCC3） ， 为有机类含氯化合物， 含有效氯 60%， 52中华预防医学杂志 2006 年 1 月第 40 卷第 1 期 Chin J Prev Med， January 2006，Vol 40，No. 1 水中 溶 解 度 为 25%4。含 同 样 水 平 有 效 氯 的 NaDCC 与 NaOCl 具有类似的杀

11、菌活性 3。 在消毒学的研究方面， 国内外文献中尚未检索 到上述三种噬菌体对二氯异氰尿酸钠的抵抗力及其 比较研究的报道。因此， 从 2004 年 10 月开始， 我们 在实验室比较了噬菌体 T4、 x174D 和 f2 对二氯异 氰尿酸钠消毒剂的抵抗力， 现将结果报道如下。 材料与方法 1. 噬菌体及其宿主菌： 噬菌体 T4 及其宿主菌 大肠杆菌 B， 噬菌体 x174D 及其宿主菌大肠杆菌 B （均购自中国科学院武汉病毒所） ， 噬菌体 f2 及宿主 菌大肠杆菌 285 （购自北京军事医学科学院卫生学 环境医学研究所） 。 2. 培养基、 消毒剂及其他试剂： 噬菌体培养用 底层营养琼脂： 普

12、通营养琼脂 （成都长寿生物制剂 有限公司） ， 按要求配制。噬菌体培养用上层营养 琼脂： 胰蛋白胨 10 g， NaCl 5. 0 g， 葡萄糖1. 0 g， 琼脂 粉 6. 0 g， 2. 5 mol/ L CaCl2储备液 10 ml， 蒸馏水 1000 ml， 调至 pH 7. 2。宿主菌培养用营养肉汤： 普 通营养肉汤培养基 （成都长寿生物制剂有限公司） 。 上述培养基均灭菌备用。消毒剂： NaDCC （成都顺 发消洗用品厂） ， 每次用前测定有效氯含量， 用标准 硬水稀释至所需浓度。中和剂： 1% Na2S2O3+ 1% 吐温- 80 + PBS （pH 7. 2） 配制成的溶液。稀

13、释液： 胰 蛋白胨生理盐水溶液 （TPS） ： 胰蛋白胨 1. 0 g， NaCl 8. 5 g。先用 900 ml 蒸馏水溶解， 并调节 pH 至 7. 0 0. 2， 最终加蒸馏水至 1000 ml； 分装后， 经 121压力蒸汽灭菌后备用。牛血清白蛋白 30 g， 蒸 馏水 1000 ml。溶解后用微孔滤膜 （孔径为 0. 45 m） 滤过除菌， 4 冰箱保存备用。标准硬水 （硬度 342 mg/ L） ： 氯化钙 0. 034 g， 氯化镁 0. 139 g， 蒸馏 水加至 1000 ml。0. 3 mol/ L PBS： Na2HPO42. 83 g， KH2PO41. 36 g，

14、蒸馏水 1000 ml， 调节 pH 至 7. 2 7. 4， 于 121 压力蒸汽灭菌后备用。灭菌重蒸水。 3. 宿主菌的制备： 参照卫生部 消毒技术规范 （2002 年版） 的方法 5， 并加以改进。宿主菌接种于 5. 0 ml 营养肉汤， 37 震荡培养过夜。涂片， 革兰 染色镜检， 然后扩增制备菌悬液备用。 4. 噬菌体悬液制备： 宿主菌接种于普通营养琼 脂斜面， 于37 培养18 24 h， 用5 ml 灭菌 PBS 洗 下表面菌苔， 置于试管中， 加入 1. 0 ml 噬菌体悬液， 充分混合， 取 2. 0 ml 置于平皿营养琼脂表面， 孵育 6 7 h， 洗去多余液体。37 倒置

15、培养18 24 h， 以 5. 0 ml PBS 洗下琼脂表面噬菌体， 洗液转入灭菌小 三角瓶中， 加几滴氯仿， 震荡 30 min， 以 5000 r/ min 离心 20 min ， 收集上清为纯化的噬菌体悬液， 保存 于 4 备用。 5. 噬菌体培养记数方法： 采用双层琼脂法， 具 体操作如下： 将待测噬菌体悬液 10 倍系列稀释， 取 宿主菌肉汤培养物 0. 2 ml， 分别加至各平皿的底层 营养琼脂； 吸取适当稀释度的噬菌体悬液0. 2 ml， 分 别加至各平皿与宿主菌混合， 倒入 2 3 ml 50 的 上层琼脂， 混匀， 凝固后37 倒置培养18 24 h， 计 算噬斑数。操作中

16、要注意充分混匀， 每一稀释浓度 接种 2 个平板， 取噬斑在 30 300 个之间平皿的平 均值计算效价， 效价 （pfu/ ml）= 噬斑平均数 5 稀 释倍数。 6. 中和剂鉴定实验： 噬菌体悬液 （1 1075 107pfu/ ml） 用前先与牛血清白蛋白等体积混合。分 为 8 组： 第 1 组： 取 1. 0 ml 噬菌体悬液加入 4. 0 ml 消毒剂中混匀， 作用预定时间； 取 0. 5 ml 作用后的 混合液加入含 4. 5 ml 胰蛋白胨生理盐水溶液的试 管中， 混匀； 取0. 2 ml 接种于双层平板， 观察消毒剂 对噬菌体有无杀灭能力。第 2 组： 取 1. 0 ml 噬菌

17、体 悬液加入 4. 0 ml 消毒剂中混匀， 作用预定时间； 取 0. 5 ml 作用后的混合液加入含 4. 5 ml 中和剂的试 管中， 混匀， 作用预定时间后取 0. 2 ml 接种于双层 平板， 观察残留消毒剂被中和后噬菌体有无生长。 第 3 组： 取1. 0 ml 噬菌体悬液加入4. 0 ml 中和剂中 混匀， 作用预定时间后取0. 5 ml 放入4. 5 ml 中和剂 中， 作适当稀释， 取0. 2 ml 接种于双层平板培养， 观 察中和剂对噬菌体和宿主菌有无抑制作用。第 4 组： 噬菌体悬液 1. 0 ml 加入 4. 0 ml 中和产物 （以 1 份消毒剂加 9 份中和剂， 作用

18、 10 min 而成） 中混匀， 作用预定时间后取0. 5 ml用中和产物适当稀释， 取 0. 2 ml 接种于双层平板， 观察中和产物对噬菌体有 无抑制作用。第 5 组： 噬菌体悬液 1. 0 ml 加入 4. 0 ml TPS 中混匀， 作用预定时间后取 0. 5 ml 作适当稀 释， 取 0. 2 ml 接种于双层平板作阳性对照。第 6 组： 取实验用同批次0. 2 ml TPS 接种于双层平板培 养， 观察 TPS 是否被噬菌体污染。第7 组： 取实验用 同批次中和剂0. 2 ml接种于双层平板， 观察中和剂 是否被污染。第 8 组： 同实验用培养基直接培养， 观 察培养基是否被污染。

19、 7. 悬液定量杀灭实验： 噬菌体悬液 （1 107 62中华预防医学杂志 2006 年 1 月第 40 卷第 1 期 Chin J Prev Med， January 2006，Vol 40，No. 1 5 107pfu/ ml） 用前先与等体积牛血清蛋白混合。 实验组： 将噬菌体悬液1. 0 ml 加入4. 0 ml 不同浓度 的消毒剂溶液中， 作用预定时间后取 0. 5 ml 加入 4. 5 ml 中和剂中， 混匀， 作用 10 min， 作适当稀释， 取 0. 2 ml 接种于双层平板。阳性对照组： 取噬菌体 1. 0 ml 加入 4. 0 ml TPS 中， 其余操作同实验组。阴 性

20、对照组： 同次实验用 TPS、 中和剂各0. 2 ml 接种于 双层平板， 同次实验培养基直接培养。 结果 1. 中和剂鉴定实验结果： NaDCC 对噬菌体 T4、 x174D和 f2 灭活实验的中和剂鉴定实验结果均 是重复 3 次的结果。中和剂实验结果显示， 第 2 组 噬菌体数明显大于第 1 组， 远小于第 3 组、 第 4 组和 第 5 组， 说明中和剂能很好的中和消毒剂， 且中和剂 及中和产物对噬菌体没有毒性。第 6 8 组均未见 噬菌体生长， 说明实验所用试剂没有噬菌体污染。 2. 悬液定量杀灭实验结果： 不同浓度的 NaDCC 与噬菌体 T4、 x174D 和 f2 作用不同时间，

21、 其灭活对 数值见表 1 3。 表 1 二氯异氰尿酸钠溶液与噬菌体 T4 作用不同时间的 平均灭活对数值 有效氯含量 （mg/ L） 不同时间 （min） 的灭活对数值 （log10No-log10Nt） 5102040 1501. 552. 713. 954. 00 3004. 004. 004. 004. 00 阳性对照噬斑数为 1. 95 107pfu/ ml 表 2 二氯异氰尿酸钠溶液与噬菌体 x174D 作用不同时间的 平均灭活对数值 有效氯含量 （mg/ L） 不同时间 （min） 的灭活对数值 （log10No-log10Nt） 3458 1502. 722. 772. 853.

22、 59 3003. 443. 644. 004. 00 4004. 004. 004. 004. 00 阳性对照噬斑数为 2. 49 107pfu/ ml 上述实验的温度为 20 ， 实验重复 3 次， 灭活 对数值为 3 次的平均值。 讨论 1. 不同噬菌体对 NaDCC 的抵抗力大小不同， 而且差别很大。参照有关文献 4， 若以浓度时间乘 积来衡量 NaDCC 对噬菌体的灭活效果或噬菌体 对NaDCC的抵抗力， 其值越大， 越难杀灭， 说明噬 表 3 二氯异氰尿酸钠溶液与噬菌体 f2 作用不同时间的 平均灭活对数值 有效氯含量 （mg/ L） 不同时间 （min） 的灭活对数值 （log1

23、0No-log10Nt） 5102040 10002. 082. 222. 983. 20 20002. 592. 734. 004. 00 40004. 004. 004. 004. 00 阳性对照噬斑数为 2. 50 107pfu/ ml 菌体对 NaDCC 的抵抗力越大。以能达到消毒噬菌 体的最小浓度时间乘积值比较， 则噬菌体 f2 为 20 000 mgmin -1 L -1， 余此类推， 噬菌体 T4 为 1500 mgmin -1L-1， 噬菌体 x174 为 1200 mg min -1L-1， 噬菌体 f2 的浓度时间乘积值是噬菌体 T4 的 13. 33 倍， 是噬菌体 x1

24、74 的 16. 67 倍， 噬菌 体 T4 是噬菌体 x174 的 1. 25 倍。因此， 噬菌体对 NaDCC 的抵抗力为：噬菌体 f2 噬菌体 T4 噬菌 体 x174D。 2. 造成这种抵抗力差别的可能原因有：（1） 由 于噬菌体本身的核酸组成不同。噬菌体 f2 为单链 RNA， 与 MS2 噬菌体 （单链 RNA， 3569 个核苷酸， 只 有 4 个基因） 同属第一类群； 噬菌体 T4 是线状双链 DNA， 基因组有近 200 个基因， 相对分子质量为 1. 2 108， 由 1. 66 106核苷酸组成； 噬菌体 x174 为环状单链 （ + ） DNA， 其基因组小， 含 53

25、86 核苷 酸， 有 11 个基因， 编码 11 个基因产物。 （2） 形态结 构不同。噬菌体 f2 形态为 20 面体； 噬菌体 T4 除有 1 个 20 面体的头部外， 连接着 1 个复杂的尾巴， 整 个病毒颗粒总共有 25 种不同的蛋白质； 噬菌体 x174 虽然也是 20 面体， 但颗粒上有 12 个非常有 特征的刺突。 （3） 噬菌体颗粒大小不同。噬菌体 f2 直径为 26. 0 26. 6 nm； 噬菌体 T4 头部大小约为 95 nm 65 nm， 尾巴由 1 个螺旋状的管子组成， 长约 95 125 nm， 直径13 20 nm ； 噬菌体 x174 直径为 26 nm。 （4

26、） 结合的位点不同。虽然上述 3 个噬菌 体的宿主都是大肠杆菌， 但是噬菌体 f2 宿主受体位 点为 F 菌毛， 噬菌体 T4 多为脂多糖， 噬菌体 x174 为外膜脂多糖的核心多糖， 而且这种结合是可逆 的 2。其中噬菌体 f2 的核酸结构和与宿主的结合 位点完全不同于另外 2 种噬菌体， 可能是其抵抗力 大大强于噬菌体 T4 和噬菌体 x174D 的关键因素。 有关作用机制需进一步研究。 3. 在 NaDCC 对噬菌体的灭活因素中， 浓度因 素是关键， 低浓度即使延长作用时间， 灭活作用也不 72中华预防医学杂志 2006 年 1 月第 40 卷第 1 期 Chin J Prev Med，

27、 January 2006，Vol 40，No. 1 明显。这可能是由于其浓度系数 n 值或 值 6 （或 称浓度指数 3， 7、 稀释系数3， 4， 7） 1， 因为当 n 1 时， 起灭活支配因素的是浓度 4。 4. 对病毒灭活对数值达到多少才算消毒合格， 国外文献认为， 大多数病毒对数减少值达到 3 4 个 log10时， 对于测定是比较实用的； CGSB （1977） 标准 要求3 个 log10； 欧洲标准技术委员会起草的定量 悬浮实验， 把腺病毒和脊髓灰质炎病毒疫苗株列入 实验用病毒， 并提议尽快将鸭肝炎病毒列入， 要求最 低达到 4 log10 4， 对口蹄疫病毒和新城鸡瘟病毒达

28、 到 4 log10 7； 我国规定对脊髓灰质炎病毒 1 型疫苗 株和艾滋病病毒 1 型美国株达到 4 log10 5。在本实 验中， 对于噬菌体采用以灭活对数值4. 00 log10为 达到消毒水平或消毒合格， 是否完全合理， 有待进一 步研究。 5. 今后应进一步加强这些噬菌体对其他消毒 因子抵抗力的研究， 尤其是对这些因子抗性机制的 研究， 为选择噬菌体作为指示病毒用于消毒学的评 价提供有价值的信息。 志谢 四川大学华西公共卫生学院 2000 级卫生检验专业学生 崔海洋、 陈刚， 2004 级硕士研究生杨柳、 孙巍参与部分实验工作 参考文献 1Prescott LM，Harley JP，

29、Klein DA. Microbiology. 5th ed. Ohio： McGraw-Hill Companies，Inc. ， 2002. 363-364， 381-397. 2贾盘兴 . 噬菌体分子生物学 基本知识和技能 . 北京： 科学 出版社， 2001. 1-3， 40-66， 120-121. 3Russell AD，Hugo WB，Ayliffe GA. Principles and practice of disinfection， preservation and sterilization. 3rd ed. Oxford：Blackwell Science Ltd， 1

30、999. 46-49， 101-102. 4Block SS. Disinfection， Sterilization， andpreservation. 5thed. Philadelphia： Lippincott Williams & Wilkins， 2001. 149-150， 65-78. 5消毒技术规范 （2002 年版） . 2002-32-39. 6刘育京 . 消毒动力学与杀菌作用指标 . 消毒与灭菌，1984，1： 101-106. 7薛广波， 主编 . 现代消毒学 . 北京： 人民军医出版社，2002. 4- 32， 138-154， 111-113. （收稿日期： 20

31、05-09-26） （本文编辑： 李文慧） 作者单位： 430015 湖北省武汉市妇女儿童医疗保健中心保健部 现场调查 武汉地区 2002 至 2004 年非综合征性总唇裂 流行的监测分析 覃凌智 陈忠 非综合征性总唇裂指不伴发其他系统、 器官畸形的唇裂 和唇裂合并腭裂的总称， 为单发性的唇腭裂， 是我国高发的 先天畸形之一。为了解其流行情况， 我们对武汉地区 2002 年至 2004 年非综合征性总唇裂进行了监测分析。 1. 对象与方法： 利用武汉市出生缺陷监测网络系统， 对 38 所医院 （年接生总数约占全市年出生数的 40% 50%） 2002 年至 2004 年孕 28 周至产后 7

32、d 的围产儿 （含死胎和死 产） 进行监测， 监测围产儿中明确诊断为单发性唇裂和唇裂 合并腭裂的病例， 排除其他系统畸形或综合征性唇裂病例。 采用问卷调查方法进行回顾性调查， 调查项目包括孕母一般 情况、 非综合征性总唇裂的类型等。采用 SPSS 10. 0 软件进 行统计学分析。 2. 结果： 38 所医院 3 年共监测围产儿 52 390 例， 其中城 区30 715 例、 郊区21 675 例， 男性26 528 例、 女性25 862 例； 共发生非综合征性总唇裂60 例， 发生率为11. 45/ 万， 其中单 纯性唇裂的发生率为 4. 39/ 万， 唇裂合并腭裂的发生率为 7. 06

33、/ 万； 非综合征性总唇裂的发生率城区 （38 例， 12. 37/ 万） 高于郊区 （22 例， 10. 15/ 万） ， 经统计学检验， 差异无统计 学意义 （x2=0. 548， P 0. 05） ； 非综合征性总唇裂的发生率 男性 （39 例， 14. 70/ 万） 高于女性 （21 例， 8. 12/ 万） ， 经统计 学检验， 差异有统计学意义 （x2=4. 953， P 0. 05） 。 3. 讨论： 缺陷发生率的地域差异通常可反映不同地域环 境和社会经济文化因素对缺陷发生的影响。本监测结果略 低于南方地区的平均水平， 与武汉地区的经济、 文化发展状 况基本一致。城郊的发生率差异无统计学意义， 提示在某个 相对恒定的地区内， 该地区城郊间的环境和社会经济文化虽 然存在一定的差别， 但这种差别并不会导致城郊间非综合征 性总唇裂的发生率有明显差别。男性的非综合征性总唇裂 发生率显著高于女性， 与近年国内外文献报道的结果一致， 这种现象是否与遗传物质有关， 尚有待进一步研究证明。 （收稿日期： 2005-03-02） （本文编辑： 周星） 82中华预防医学杂志 2006 年 1 月第 40 卷第 1 期 Chin J Prev Med， January 2006，Vol 40，No. 1