培养基影响大肠杆菌产L天冬酰胺酶的研究.pdf

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1、现代食品科技 M o d e r nF o o dS c i e n c ea n dT e c h n o l o g y 2 0 0 8 ，V o L 2 4 ，N o 6 培养基影响大肠杆菌产L 一天冬酰胺酶的研究 范志华，张爱琳，何庆峰，张涛，陈一江 ( 天津农学院生物工程教研室，天津3 0 0 3 8 4 ) 摘要：研究培养基的成分及添加量对大肠杆菌产生抗癌药物I ，天冬酰胺酶的影响。通过对大肠杆茵培养基中碳源、氮源以及 微量元素的讨论，得知该菌株以蔗糖为碳源，添加量为0 7 ，以O 5 牛内膏+ 1 O 蛋白胨为氮源，添加0 0 1 的磁威亚铁为微量元 素，所产L 天冬酰胺酶的比酶

2、活达到3 5 2 5 4U g ，相比基泰培养基培养提高了3 1 关键词：培养基；L - 天冬酰睦酶；大肠杆菌 中图分类号：T Q 9 2 5 ；文献标识码：A ；文章篇号：1 6 7 3 - 9 0 7 8 ( 2 0 0 8 ) 0 6 - 0 5 5 2 - 0 3 E f f e c to fC u l t u r eM e d i u mo nL - a s p a r a g i n a s eP o r d u c t i o nb yE c o l i F A NZ h i - h u a , Z H A N GA M i n ，H EQ i n g - f e n g ，Z

3、H A N GT a o ，C H E NY i - j i a n g ( L a b o r a t o r yo f B i o l o g yE n g r a v i n g ，T i a n j i n A g r i c u l t u r a lC o l l e g e ，T i a n j i n3 0 0 3 8 4 ，C h i n a ) A b s t r a c t ：T h ee f f e c t so f t h ec , o m p o n e n t so f c u l t u r em e d i u mo nt h ep r o d u c t i

4、 o no fL - a s p a r a g i n a s e ，a l la n t i - c a n c e rd r u gf e r m e n t e db yE c o ， w e r es t u d i e d R e s u l t ss h o w e dt h a tt h eh i g h e s ts p e c i f i ca c t i v i t yo fL - a s p a r a g i n a s e ( 3 5 2 5 4 U g ) W a Sa c h i e v e du n d e rs u c hc o n d i t i o n

5、s ：O 7 o f 如c r o 鹤c a r b o nS O U W 七0 5 o f b e e f 麟t r a c ta n d1 o o f p e p t o n e 勰n i t r o g e n $ O U V za n d0 0 1 o f F e S 0 4 a s 昀e l e m e n tT h ey i e l do f 【，删呻g i n 蛾w a s31 h i g h e rt h a nt h a tb yb a s i cm e d i u mf e r m e n t a 6 0 血 K e yw o r d s ：m e d i u mc u l

6、 t u r e ；L - a s p a t a g i m s e ；E c o 研究发现，L 天冬酰胺是某些癌细胞生长的营养 源，但癌细胞自身不能合成L 天冬酰胺，因此L 广天冬 酰胺酶通过对L 天冬酰胺的水解作用能有效抑制癌细 胞的生长【l 2 1 。临床试验证明，L 广天冬酰胺酶尤其对急 性白血病和恶性淋巴母细胞肿瘤有效【H J 。近年来由于 其应用范围的不断扩大，采用大肠杆菌发酵生产L 一天 冬酰氨酶受到很多学者的重视，培养基的选择对于上 述问题的研究仍具有重要意义，因此本文从培养基成 分和添加比例两方面对这一问题加以讨论。 l 扣2 0 h 。 1 4 测定方法 L 广天冬酰胺酶

7、活性测定参照N e s s l e r 试剂澍5 1 。3 7 下，lm i n 催化L 一天冬酰胺水解生成l “m o l 氨的酶量 为一个酶活力单位。再由生物量得出单位菌体的酶活， 即比酶活力( U g ) 。产氨率( ) 为单位菌体的产氨 量。 菌体浓度测定采用分光光度法测定。试剂均为国 产分析纯。 1 材料与方法2 结果与讨论 1 1 菌株 大肠杆菌( E c o l i K * _ T N l 5 8 8 5 ) ，由本教研室生物 工程中心实验室提供。 1 2 培养基 菌种采用基本培养基进行斜面移种和保藏。发酵 培养基按照不同影响因素配制。 1 3 培养条件 在2 5 0m L 三角

8、瓶中进行摇瓶培养，装液量5 0 m L ，摇床转速3 0 0r m i n ，培养温度3 7 ，发酵时间 收稿E t 期：0 1 ) - 0 3 - 0 4 作者简介：范志华( 1 9 7 3 - ) ，男，硕士，讲师，主要从事食品科学和生物工 程方面的教学和科研工作 5 5 2 2 1 碳源对大肠杆菌产【广天冬酰胺酶的影响 2 1 1碳源种类对大肠杆菌产L 天冬酰胺酶的影响 相同的培养条件下，分别选取葡萄糖、麦芽糖、 蔗糖、柠檬酸三钠、乳糖作为碳源，按1 O 的比例添 加到液体基本培养基中，以基本培养基为对照，经发 酵产酶后测定其生物量、产氨量和比酶活。所得碳源 种类对大肠杆菌产L 天冬酰胺

9、酶的影响如图1 所示。 从图l 中可以看出以蔗糖为碳源时，其比酶活最 高，约为3 2 2U g ，产氨量约为2 4 5 嵋，m - L ，生物量较 为适中。与对照实验相比，除了葡萄糖和柠檬酸三钠 作为碳源时所得比酶活减弱外，其他都有所提高。分 析原因可能是柠檬酸三钠一般作为某种特定菌种的碳 现代食品科技M o d e r nF o o dS c i e n c ea n dT e c h n o l o g y 2 0 0 8 ，V 0 1 2 4 ，N o 6 源，生物量增加较多但比酶活不高，因而不是该菌株 产酶最适宜的碳源；葡萄糖作为碳源抑制产酶可能与 葡萄糖效应有关，葡萄糖的添加不仅改变

10、了培养基的 渗透压使水活度减小，最主要的是葡萄糖的代谢致使 发酵后期大量有机酸的积累，降低了p H 从而使产酶 明显受到抑制。 图1 碳源种类对大肠杆菌产L - 天冬酰胺酶的影响 F i g 1E f f e c to fc a r b o ns o u r c eo nt h ey i e l do fL - a s p a r a g i n a s e 2 1 2 碳源添加量对大肠杆菌产L 天冬酰胺酶的影 响 从上述实验可知蔗糖为碳源时，其酶活力最大， 但是蔗糖的添加量也会影响到该菌株的产酶能力。据 此分别按O 3 、0 5 、0 7 、1 以及1 5 的比例 添加蔗糖作为碳源，在其它相

11、同的条件下进行实验， 测定相应的比酶活和产氨率。结果如图2 所示。 宙 3 ￥ ! i g 落 丑 鋈 锝 城 亿 蔗糖质量浓度 图2 蔗糖添加量对大肠杆菌产L 天冬酰胺酶的影响 脚2E f f e c to f a d c U n ga m o u n to f s u c r o s eo nt h ey i e l do f L - a s p a r a g i n a s e 由图2 可以看出，0 3 - - 0 7 范围内，随着蔗糖 添加量增大，其比酶活也相应地增大，最大值达到 3 3 2 5U g 。当添加量继续增大时，其比酶活减小。产 氨率也具有相似的趋势。故选取蔗糖的添加量为

12、0 7 作为碳源的添加比例。 2 2 氮源对大肠杆菌产L 广天冬酰胺酶的影响 2 2 1氮源种类对大肠杆菌产L 天冬酰胺酶的影响 以基本培养基中添加量1 0 的蛋白胨为固定氮 源，然后分别以添加量0 3 的牛肉膏和酵母膏作为辅 助氮源进行比较，以添加量O 7 的蔗糖为碳源，其余 的条件相同进行实验，测定其相应的参数。结果如表 1 所示。 表1 辅助氮源种类对大肠杆菌产L 一天冬酰胺酶的影响 T a b 1 E f f e c to ta d d l I I ga m o u n to fn i t r o g e ns o l l r g eo nt h ey i e l do f L - a

13、 s p a r a g i n a s e 由表1 可看出选择0 3 牛肉膏+ 1 0 蛋白胨作为 该菌株的氮源时，其比酶活为3 1 0 8 6U g ，相对于0 3 酵母膏+ 1 0 蛋白胨作为氮源比酶活提高了约9 4 。 分析原因可能是在同等条件之下，牛肉膏中所含有的 某些特殊成分比酵母膏更适于菌体的生长，从而为菌 体细胞积累L 天冬酰胺酶提供更加丰富的氮源。 2 2 2 氮源添加量对大肠杆菌产L 天冬酰胺酶的影 响 辅助氮源添加量的大小也会影响到菌株的产酶能 力。在其它相同的条件下蛋白胨的添加量不变仍为 1 ，改变牛肉膏的添加量，分别为0 2 、0 3 、0 4 、 0 5 、0 6

14、、O 8 以及1 进行实验。结果如图3 所 示。 量 藿 丑 莲 得 晡 L 牛肉膏质量浓度 图3 牛肉膏添加量对大肠杆菌产L - 天冬酰睃酶的影响 n pE f 伍e c to f a d d i n ga m o u n to f b e e f e x l r a c tO nt h ey i e 村o f L - a s p a r a g i n a s e 由图3 看出，当牛肉膏添加量为0 5 时，该菌株 所产L 天冬酰胺酶的比酶活力最高达到3 4 5 6 8U g ， 产氨率也达到最高5 1 2 。因而培养该菌株时选择 O 5 牛肉膏+ 1 O 蛋白胨作为最适宜的氮源。 2 3

15、微量元素对大肠杆菌产L 天冬酰胺酶的影响 2 3 1 微量元素种类对大肠杆菌产L 广天冬酰胺酶的 影响 按添加量均为0 0 5 分别选用硫酸铜、硫酸亚铁、 硫酸锌以及碳酸钙等微量元素添加到培养基中进行实 验，以不添加微量元素作为对照。其它实验条件相同， 结果如图4 所示。 5 5 3 现代食品科技 M o d e r nF o o dS c i e n c ea n d T e c h n o l o g y2 0 0 8 ，V 0 1 2 4 ，N o 6 图4 微量元素对大肠杆菌产L 一天冬酰胺酶的影响 4E f f e c to f t r a c ee l e m e n t so n

16、t h ey i e l do f L - a s p a r a g i n a s e 从图4 中可以看出，添加0 0 5 的硫酸铜和硫酸 锌对大肠杆菌产L 广天冬酰胺酶都会有一定的抑制作 用，碳酸钙的加入基本无影响，而硫酸亚铁的添加对 大肠杆菌L 天冬酰胺的产生有促进作用，比酶活最高 为3 4 1 9 2U g ，相对于对照提高了1 7 6 。原因在于 铁是微生物细胞内过氧化氢酶、过氧化物酶、细胞色 素与细胞氧化酶的组成元素，缺铁会使机体内的某些 代谢活性降低或丧失。大肠杆菌在铁含量不足的培养 基里培养时，不能合成足够的甲酸脱氢酶，而使其生 长和代谢受到影响。铜和锌两种微量元素抑制了酶活

17、， 原因可能是作为诱导酶的抑制剂，使得产酶受阻。 2 3 2 硫酸亚铁添加量对大肠杆菌产L 天冬酰胺酶 的影响 按照上述实验结论，以硫酸亚铁作为微量元素， 添加量分别为0 0 0 5 、0 0 1 、0 0 2 、0 0 3 、0 0 4 、 0 0 5 以不添加硫酸亚铁作为对照，在摇床上进行 发酵，取样测定相应参数，结果如图5 所示。 霎 藿 丑 F e S 0 4 质量浓度 鋈 I 卜 城 钆 图5 硫酸亚铁添加量对大肠杆菌产L 一天冬酰胺酶的影响 F 嘻5E f f e c to fF e S 0 4c o n t e n to nt h ey i e l do fL - a s p a

18、 r a g t n a s e 结果显示当硫酸亚铁的添加量为0 0 1 - 4 ) 0 2 的 时该菌株所产酶的比酶活力较高，最高为3 5 2 5 4U g ， 产率也达到最高。因此选择硫酸亚铁0 0 1 为最适宜 添加量。 参考文献 【1 】刘红，潘红春抗癌药物L 天冬酰胺酶及其研究进展叨四 J I 【轻化工学院学报，2 0 0 0 ，1 3 ( 2 ) ：3 1 3 6 【2 】 潘红春，刘红，吴华昌抗癌药物L 天冬酰胺酶摇瓶发酵研 究叨四川轻化工学院学报，1 9 9 9 ，1 2 0 ) ：6 0 - 6 4 【3 】3 W e a t h e r b u m m w P h 饥o l

19、 h y p 0 C m 硎t e r e a c t i o nf o r 出【e r m j n 撕伽o fa m m o n 蛔a m I 蜘cC 胁，1 9 6 7 ，3 9 ( 8 ) ： 9 7 1 - 9 7 4 4 】刘红，魏东芝氧载体对L 天冬酰胺酶发酵过程影响的研究 叨生物工程学报，1 9 9 8 ，1 4 ( 3 ) ：2 9 8 3 0 1 【5 】 中华人民共和国药典二部, 2 0 0 0 ( 上接第5 6 0 页) 试验结果表明：添加变性淀粉比添加淀粉可明显 改善样品口感，添加三聚磷酸钠未能提高样品感官评 分，添加九棍鱼可显著改善样品口感弹性，以添加2 0 九棍鱼(

20、 占鱼肉) 时，样品获得的综合感官评分较高， 当添加量为3 0 ，样品虽弹性好，但综合感官评分下 降。 3 结论 3 1 制作罐藏鱼饼的几个关键工艺条件为：鱼肉在 3 1 0 的5 倍清水漂洗1 次；经漂洗脱水的鱼肉放入 擂溃机内擂溃，空擂5 m i n 、盐擂2 0 m i n 、拌擂3 m i n ； 擂溃成型后的鱼糜于4 0 放置3 h 进行凝胶化；装罐 后的罐头经1 2n f i n 2 0z z m z 1 2m i n 1 1 8 杀菌可使制 品获得较好的综合感官评分。 3 2 罐头中鱼饼的配比( 质量比，) ：鲮鱼肉8 0 、九 棍鱼肉2 0 ( 经漂洗脱水后的鱼肉) ，白砂糖0

21、 5 ，盐2 ， 5 5 4 香葱1 ，变性淀粉5 。 参考文献 【l 】 曾王曼，陈力巨鱼饼加工工艺的研究与探索阴中国水产， 2 0 0 6 ，( 6 ) ：6 5 - 6 7 【2 】杨贤庆，李来，周婉君，等提高鲮鱼鱼糜弹性的方法【J 】湛江 海洋大学学报, 2 0 1 ) 3 ，( 8 ) ：2 6 f 3 】中华人民共和国国家标准，肉类罐头卫生标准 s 】， G B l 3 1 0 0 - 2 0 0 5 【4 】吴光红，车文毅，费至良，等水产品加工工艺与配方 M I ，北 京：科学出版；i ! ：l z , 2 0 0 1 ：2 1 8 2 2 0 【5 】黄国宏，沈要林，鱼糜加工过程中凝胶性能的影响因素研究 进展【J 】现代食品科技，2 0 0 7 ，( 1 ) 1 0 7 1 0 9 同杨邦英，罐头工业手册( 新版) 咖，北京：轻工业出版社， 2 0 0 2 ：5 5 6 - 5 5 7