抗动脉粥样硬化疫苗的制备及免疫学研究.pdf

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1、药物生物技术 P h a r m a c e u t i c a lB i o t e c h n o l o g y2 0 0 8 ，1 5 ( 6 ) ：4 1 1 - - 一4 1 7 4 1 1 论文 抗动脉粥样硬化疫苗的制备及免疫学研究 孙云霄1 ，杨欣1 ，龙军2 ，李泰明1 ，金亮1 ，刘景晶H ( 1 中国药科大学生命科学与技术学院微基因实验室，江苏南京2 1 0 0 0 9 ； 2 南京中医药大学药学院，江苏南京2 1 0 0 2 9 ) 摘要为了增强胆固醇酯转移蛋白( C E T P ) 羧基末端的2 6 肽B 细胞抗原表位的免疫原性，以大肠杆菌 L 一门冬酰胺酶I I (

2、 A n s B ) 为载体，通过引入2 个强的辅助T 细胞表位，构建了融合基因恕硌B T T P - P A D R E C E T P C ，并在大肠杆菌B L 一2 1 ( D E 3 ) 表达，经过硫酸铵沉淀、D E A E5 2 纤维素阴离子交换层析、分子筛凝胶过滤 层析最终得到单一电泳条带纯度的目的蛋白。纯化的融合多肽疫苗免疫新西兰大白兔可诱导产生高水平持续 存在的抗C E T P 抗体，从而抑制了C E T P 酶活力，显著抑制了兔主动脉斑粥样硬化斑的形成和发展。该融合蛋 白有希望作为抗动脉粥样硬化疫苗进一步研究开发。 关键词动脉粥样硬化；胆固醇脂转移蛋白；辅助T 细胞表位；表达

3、；纯化；免疫 中图分类号：Q 7文献标识码：A文章编号：1 0 0 5 - 8 9 1 5 一( 2 0 0 8 ) 0 6 - 0 4 1 1 - 0 7 动脉粥样硬化( A t h e r o s c l e r o s i s ，A S ) 是一种多 因素并伴有复杂组织病理学过程的自身免疫性疾 病，现在被认为与血管系统的免疫调节过程有关。 脂质失衡被认为是动脉粥样硬化性心血管疾病的预 测标志，如血浆中高密度脂蛋白胆固醇( H i g h - d e n s i t yl i p o p r o t e i nc h o l e s t e r o l ，H D L - C ) 含量的异常

4、降低 和低密度脂蛋白胆固醇( L o w - d e n s i t yl i p o p r o t e i n c h o l e s t e r o l ，u ) 卜C ) 含量的异常升高都可促进动脉 粥样硬化的发生 1 矗 。人胆固醇脂转移蛋白( C h o l - e s t e r y le s t e rt r a n s f e rp r o e i n ，C E T P ) 是一个相对分子 质量约为7 40 0 0 的血浆糖蛋白，它介导血浆脂蛋白 之间中性脂及磷脂的相互转运【3 ，4 ，而在C E T P 活 性异常升高的情况下会减少H D L - C 或增加L D L -

5、C ， 进而促进动脉粥样硬化斑的发生发展 5 。 研究显示抗C E T P 抗体能抑制C E T P 活性，增 加血浆H D I ，C 并减少动脉粥样硬化斑的产生，所以 通过抗C E T P 抗体调节高的C E T P 活性到正常水平 对于抵抗动脉粥样硬化有着重要意j 0 6 9 。本室以 前的研究结果也表明 1 0 12 J ，体内产生高滴度的抗 抗体与动脉粥样硬化的改善呈明显的正相关 性。人C E T P 的羧基端的2 6 个氨基酸( C 端第4 4 8 到4 7 6 个氨基酸，C 赋) 中含有B 细胞表位，可诱 导机体产生抗C E Y P 抗体，抑制C E T P 活性，但单纯 的C 日

6、曙羧基端2 6 肽在体内不足以激发有效的免 疫应答。为了增加C 圈阳中B 表位的免疫原性，在 前期一系列实验的基础上加以改进和完善，用基因 工程手段构建了一个重组嵌合酶( A n s B - 僻P A D 砌1 - C 唧) ，用来治疗动脉粥样硬化。通过引入 破伤风毒素T 细胞表位( A m i n o - a d dr e s i d u e sQ Y l 一 K A N S K F I G I T Eo ft e t a n u st o x i n ，1 v r P ) 与合成的、 非自然的P a nD R 表位( p a n - H L AD R - b i n d i n g e p

7、 i t o p e ，咖) 1 3 做为2 个强的辅助T 表位来增 强重组疫苗的免疫原性。经免疫新西兰大白兔，血 清中检测到高滴度的抗C 日阳抗体产生，并最终能 减轻主动脉粥样硬化症状，减少斑块的形成。 1 材料与方法 1 1 试剂和动物 E c o l iB L 一2 1 ( D E 3 ) 由本室保存；质粒 p E T 2 8 a A n s B P A D R B T T P L C E T P 和p E T 2 8 a A n s B - T T P P 2 7 7 由本室构建；所有限制性内切酶， T 4 连接酶和预染蛋白分子质量m a r k e r ，美国F e r 一 收稿E

8、l 期：2 0 0 8 - 0 5 1 2修回日期：2 0 0 8 0 9 1 2 基金项目：国家自然科学基金资助项目( N o 3 0 6 7 2 4 6 4 3 0 5 0 0 4 8 5 3 0 7 0 1 0 2 3 ，3 0 5 7 2 2 7 2 ) 。 作者简介：孙云霄，女。河北石家庄人，中国药科大学生命科学与技术学院在读博士，微基因药学研究方向。E - m a i l ：s t m y x 9 9 2 l c 【Lc o r n 。 - 通讯作者l 刘景晶，教授，博士生导师，T e l ：0 2 5 8 3 2 7 1 3 6 9 ；E - m a i l l L i u j

9、i n g j p u b l i c Lp t t j & a 1 万方数据 4 1 2药物生物技术第1 5 卷第6 期 m e n t a s 公司；D B 咂一5 2 纤维素，美国W h a t m a n 公 司；S e p h a d e xG 一1 0 0 ，p h a r m a c i a 进口分装，上海化 学试剂厂；P C R 产物纯化试剂盒及胶回收试剂盒，上 海华舜生物工程公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗 兔I g G ，武汉博士德公司产品；其余试剂皆为常规试 剂，国产A R 级。纯化的r h V E G F - C E T P C 蛋白由南 京中医药大学龙军博士友情馈赠，引

10、物合成及测序 由上海英骏生物技术有限公司完成。 3 2 只雄性幼年新西兰大白兔( 1 0 周龄) 购于江 苏省农业科学研究院动物中心，体重约2 0k g ，于 一般环境室内饲养。 1 2 构建融合蛋白基因 根据C E T P 羧基端2 6 肽及T T P 和P A D R E 的D N A 全序列，设计引物T P C I - T P C 5 如下： 57 一A C C A G G A T C o G C C A C A G T A C A T C A A A G C T A A C T C T A A A T T C A T C G G T A T C A C T G A A 一37 ( T

11、C P l ) ；57 一T T C A T C G G T A T C A C T G A A C T G A T C T A C T C C T A C T T C C C G T C T G T A A T C T C T G A A 一 3 ( T C P 2 ) ：5 一C C G T C T G T G A T C T C C C C T G A A T T C G C A A A A T T C G T G G C ( X 五G T G G A C C C T G A A A 一3 ( T C P 3 ) ；5 一G C G G C G T G G A C C C T G A A

12、 A G C G G C A G C A C C T G C T A G C C G T G A C G G T T T C C T GC T G - 37 ( T C P 4 ) ：57 一C C G CA A G C T TA A G A C A G A G A T T G A A G G A A - 3 ( T C P 5 ) ，酶切位 点是B a r n HI 和H i n d1 1 1 。以本实验室以前构建 的p E T 2 8 a A n s B - P A D R E T T P C E T P 质粒为模 版，T P C 5 为下游引物，通过4 次加端P C R 扩增得 到T T

13、 P - P A D R E - C E T P C 片段。P C R 扩增体系 为：5 0 弘l 体系中包括1 0 0p m o lT P C 4 一T P C I ( 经历 4 个P C R 反应) ，1 0 0p m o lT C P 5 ，2 “ld N T P ( 1 0t t m o l m 1 ) 和4 个单位的P f u 酶。P C R 扩增条 件为：首先9 4 变性1m i n ；然后进入9 4 变性 3 0s ，6 0 退火4 5s ，7 2 延伸4 5S 的循环程序，共 3 0 个循环；最后7 2 延伸1 0m i n 。最后获得 T T P P A D R E _ C

14、E T P C 基因片段( 简称F 1 ) ，用 1 7 琼脂糖凝胶电泳检测。F 1 片断纯化后用 B a m HI 和H i n dI l l 消化。质粒p E T 2 8 a A n s 昏 T T P - P 2 7 7 用上述两种酶消化并回收大片断( 简称 F 2 ) 。用T 4 连接酶连接F 1 和F 2 ，获得重组质粒 p E T 2 8 a A n s B - T T P - P A D R E - C E T P C ，用P C R 和 酶切的方法进行筛选。P C R 筛选时分别选用 T P C A 和T P C 5 作为上下游引物，得到2 1 0b p 左右 大小D N A

15、片段的即为p E T 2 8 a A n s B T T P P A D R E - C E T P C 表达载体。酶切筛选时对载体选用 B a r n HI 和H i n d 消化，能得到2 1 0b p 左右大小 的D N A 片段的即为阳性克隆。酶活力测定采用 萘氏法。将该质粒转化入E c o l i B L 2 1 ( D E 3 ) ，从 该工程菌中抽提的质粒经核酸自动测序仪进行测 序鉴定，进一步验证p E T 2 8 a A n s B - T T P - P A D R E - C E T P C 全基因序列的正确性。 1 3 融合蛋白A n s B - T T P P A D

16、R E C E T P C 蛋白 的表达和纯化 挑取含有p E T 2 8 a - A n s B - 丁r P - P A D R B a n 】| C 质粒的工程菌，3 7 培养过夜，按l 的接种量接种 到新鲜的含卡那霉素( 5 0t d m 1 ) 的L u r r a - b e r t a n i ( L B ) 液体培养基中。转接后于3 0 振荡培养3h ，加入终 浓度为1 的乳糖和0 2 葡萄糖进行诱导，诱导后继 续培养6h ，在4 “ C 下9 0 0 0 X g 离心1 0m i n 收集菌体。 取部分菌体用1 2 S D S P A G E 检测分析。 湿菌体溶解在1 0m

17、 m o l L 磷酸缓冲液中( P B ， p H8 0 ，含有1m m o l LE D T A ) ，并加入8 0 “l 溶 菌酶( 1 0 t g m 1 ) 和2 0 弘lD N A 酶I ( 1m g m 1 ) ， 3 7 裂解1h 。裂解产物4 下1 20 0 0 g 离心 1 5r a i n ，上清液和沉淀用1 2 S D S - P A G E 分析。 结果显示超过2 0 的嵌合酶以可溶蛋白的形式存 在于上清液中，且保持很高的酶活力。 收集菌体裂解上清液，加入硫酸铵至终浓度依 次为2 0 ，5 0 ，9 0 ，进行分级沉淀，在4 静止 3 0r a i n 后8 0 0

18、0 g 低温离心1 0r a i n ，上清和沉淀 分别留样，1 2 S D S - P A G E 分析表明超过9 0 以 上的目标蛋白在5 0 饱和硫酸铵沉淀中。沉淀用 1 0 0m l1 0m m o l L “ I r i s H C I 缓冲液( p H8 0 ，含有 1m m o l I 。E D T A ) 溶，4 下用T r i s H ( 3 1 缓冲液( p H 8 o ，含有1m m o l LE D T A ) 透析4 8h ，每8h 更换透 析液一次，以除尽硫酸铵。将透析后的溶液用恒流 泵流加入用1 0m m o l LT f i s H C I 缓冲液( p H8

19、o ) 平 衡好的D E A E5 2 纤维素柱中，2 8 0n l T l 进行检测，用 1 0r n r n o l LT n s H C l 缓冲液冲洗至吸光度低于0 2 ， 然后分别用含有5 0 ，1 0 0 ，1 5 0m m o l L 和3 0 0r n m o l L 梯度浓度的N a a 的1 0m m o l LT n s H C l 溶液进行 阶段洗脱。收集各洗脱峰并进行1 2 S D S - P A G E 分析，并对其酶活力进行检测。随后对于纯度较高 且酶活力较高的部分用S e p h a d e xG - 1 0 0 进行进一步 纯化，具酶活的洗脱峰经透析后，冷冻干

20、燥浓缩后， 万方数据 孙云霄等：抗动脉粥样硬化疫苗的制备及免疫学研究 4 1 3 即得到纯化的嵌合酶。 1 4 纯化后的A n s B - T T P P A D R E _ C E T P C 重组 嵌合酶活力检测 用W r i s t o n 改良的萘氏法测定酶活力测定方 法 1 4 。具体操作如下：在9 6 孔酶标板中，每孔加 入5 0p l 硼酸缓冲液( p H8 o ) ，2 5p l 纯化的A n s B - 1 v r P P A D R E - C E T P C 溶液( 4p t g y 1 ) ，2 5t AL 一门 冬酰胺溶液( 0 4t o o l L ) ，3 7 反

21、应1 5m i n ，然后 加入5 0 ”1 1 5 三氯乙酸终止反应，在5 0 0n m 处 测量各孑L 光密度值。吸取上述反应液1 2 5 肛l ，加 入8 7 5p l 双蒸水和2 5 弘l 萘氏试剂，门冬酰胺酶 在相同条件下反应作为对照组。 1 5 重组嵌合酶免疫新西兰大白兔 3 2 只雄性新西兰大白兔随机分为4 组，分别 为正常组、P B S 组、A l ( ( ) H ) 3 组和A n s B - T T P P A D R E _ C E T P C 蛋白组，除正常组常规饮食不予任何 处理外，其他3 组皮下注射免疫新西兰大白兔。纯 化的蛋白A n s B T T P P A D

22、 R E - C E T P C 以灭菌的 P B S ( p H7 4 ) 溶解，并与A 1 ( O H ) 3 佐剂一起配制 成0 1 5m g m l 与氢氧化铝佐剂l ：1 混合。正常组 正常饮食且没有免疫。不同组给药剂量不同，其中 1 组仅给浓度混合液。分别在第0 ，2 ，4 ，6 和8 周 于新西兰大白兔左右股四头肌处进行多点注射给 药，注射剂量为2m l 只。从第9 周开始饲喂高脂 食物( o 5 胆固醇和5 脂肪) ，使每只兔每天摄 入胆固醇量为0 5g ，连续饲喂1 6 周，直至兔主动 脉中有明显的粥样硬化斑块生成。在一1 ，1 ，3 ， 5 ，7 ，9 ，1 1 ，1 3

23、，1 7 ，2 1 和2 5 周通过耳缘静脉取 血收集血液样本，4 条件下离心收集上清液储存 在- - 2 0 。血液样本用于检测抗体产生情况。 1 6抗C E T P 抗体的E L I S A 检测 用已分离纯化的r h V E G F C E T P C 蛋白包被 9 6 孔酶标板，以lt t g t d 的浓度溶于包被稀释液 ( o 0 5m m o l L 碳酸钠一碳酸氢钠缓冲液，p H9 6 ) ， 每孔加入1 0 0 肚l ，4 包被过夜。弃去封闭液，每孔 加入2 B S A 封闭液( p H7 4P B S 配制) ，4 满 孔封闭过夜。弃去封闭液，每：f L i r t 入1

24、：2 0 0 稀释 ( 2 B S A 封闭液) 的兔血清1 0 0 “l ，3 7 孵育1h 。 弃去血清，每孔用P B S T 和自来水间隔洗涤，每次 3r a i n ，共洗涤6 次。洗涤后，每孔加入1 ：2 0 0 0 0 ( 2 B S A 封闭液) 稀释的辣根过氧化物酶标记的 羊抗兔I g G1 0 0 弘l ，3 7 孵育1h 。弃去酶标二抗 液。每孑L 用P B S T 和自来水间隔洗涤，每次3m i n ， 共洗涤6 次。洗涤后每孔加入1 0 0 肚l 底物液 过氧 化氢尿素和3 ，37 ，5 ，5 一四甲基联苯胺( T M B ) 溶 液 。3 7 反应4 0m i n 后

25、，加入5 0 肛l2m m o l L H z S O 。终止反应，用酶标仪在4 5 0a m 波长测定每 孔的光密度值0 D 。 1 7 兔主动脉粥样硬化病斑检测 利用S u d a nI I I 染色法进行检测。粥样硬化斑 富含胆固醇，易被S u d a nI I I 染成红色，因此可与周 围正常的血管组织相区别。将各组新西兰大白兔颈 动脉放血处死后，从主动脉出心脏处至髂动脉分岔 处取主动脉。剔除血管背面的脂肪组织，沿背侧剪 开，1 0 福尔马林固定4d 后，以0 2 S u d a nI I I 乙 醇溶液染色3 0m i n ，再用7 0 乙醇充分洗涤后，以扫 描仪将染色的血管内表面扫

26、下，然后使用软件M a p I n f r 0 7 0 计算病斑面积和血管内皮总面积。 2 结果 2 1 融合蛋白基因的构建 经过质粒大小比较、P C R 筛选和酶切筛选等方 法，初步确定目的克隆是p 圈眩8 a _ A n s B T m P A D 砌 C E n ) c ( 图1 ) 。再进一步通过萘氏法酶活筛选 含有质粒p E T 2 8 a A n s B T T P - P A D R E C E T P C 的 阳性菌株。阳性菌株可以产生较高的天门冬酰氨 酶活力，分解L 一天门冬酰氨为天门冬氨酸和氨， 其中氨可被萘氏试剂俘获，生成从橙黄色到红色的 反应物，颜色越深，酶活性越高。这

27、个反应也可被 L a n e1 ：D N AM a r k e r ( F e r m e n t a s ) ；L a n e2 ：P l a s m i dp E T 2 8 a A n s B - 僻P 2 7 7 ；L a n e3 ：P l a s m i dp E T 2 8 a A n s B - T T P - P A D R E - C E T P C ；L a n e4 ：P l a s m i dp E T 2 8 a A n s B - 僻P A D R E - C E T P Cd i g e s t e db yB a m Hla n dH i n , l l hL

28、 a n e5 ：T T P - P A D R E _ C E n D N Af r a g m e n ta m p l i f i e db ya d dt e r m i n a lP C R ( p E T 2 8 a - A n s B - T T p - P A D R E C E T P Ca st e m p l a t e ) F i g1 P l a s m i d sa n dP C Rp r o d u c t sa n a l y z e db y1 O a g a r - o s ee l e c t r o p h o r e s i s 万方数据 4 1 4药

29、物生物技术 第1 5 卷第6 期 用来进行酶活力的定量测定。从该工程菌中抽提 的质粒经核甘酸自动测序仪进行测序鉴定，进一步 验证了目的克隆p E T 2 8 a A n s B - T T P P A D R E C E T P C 基因序列的正确性。 2 2融合蛋白A n s 睁T T P P A D R E C E T P C 的表 达与纯化 由于天门冬酰氨酶A n s B 和C E T P C 融合表 达的蛋白质A n s & T T P P A D R E C E T P C 既有包 涵体( 图2 ，l a n e2 ) ，又形成了可溶性的周质蛋白 ( 图2 ，l a n e 3 )

30、。因此，为了较为方便的得到有活性 的融合蛋白，弃去了包涵体部分，仅对上清液部分 通过硫酸铵分级沉淀及阴离子交换层析和凝柱层 析的方法进行纯化。 绝大多数细菌周质表达的嵌合酶A n s B T T P P A D R E C E T P C 可以被5 0 硫酸铵有效地沉淀。 沉淀重新溶解并透析去除残留的硫酸铵后，可以被 C e l l u l o s e - D E A E5 2 很好的分离( 图3 ) 。在整阶段 洗脱过程中，共收集到2 个具有酶活的洗脱峰( 图 3 ，p e a k3 和p e a k4 ) ，说明重组酶并不只是以单一 的四聚体形式存在的。把所有有酶活的峰都收集 起来，冻干浓

31、缩后，进一步进行S e p h a d e xG 1 0 0 凝胶柱层析。凝胶柱层析时得到一个有酶活的洗 脱峰，透析脱盐冻干，即得重组酶A n s B - T T P P A D R E - C E T P C 的纯品，两次柱层析后，可得到电泳 纯的目的蛋白( 图2 ，l a n e 5 ) 。 P r o t e i n sw e r ee l e e t r o p h o r e s e do n1 2 S D S - P A G Eg e l sa n dt h e n s t a i n e dw i t hC o o m a s s i eb r i l l i a n tb l

32、u eR 一2 5 0 L a n el ：T o t a lp r o t e i no fEc o l iB I 。21 ( D E S ) c o n t a i n i n gA n s B - T T P P A D R E C E T P C u n i n d u c e db y1 a c t o s ea n dg l u c o s e ；L a n e2 ：D e p o s i ti nt o t a lp r o t e i n o fEc o l iB L 2 1 ( D E 3 ) d i g e s t e db yl y s o z y m e ；L a n

33、e3 ：S u p e r n a t a n t f l u i d i nt o t a lp r o t e i no fEc o l iB L 2 l ( D E S ) d i g e s t e db yl y s o z y m e ； L a l i e4 ：P r o t e i ne l u t e df r o ma n i o n e x c h a n g ec o l u m n ；L a n e5 ：P r o - t e i ne l u t e df r o mg e l f i l t r a t i o n l u m n ；L a n e6 ：P r o

34、 t e i nm o l e c u l e w e i g h tm a r k e r F 培2 E x p r e s s i o na n dp u r i f i c a t i o no fA n s B - T T P - P A D R E - a 朗广F C 1 09 l1 8 22 7 53 6 54 5 55 4 66 3 77 2 8引9 E l u t i o nt i m e ( m i n ) F i g3P u r i f i c a t i o no fA n s B - T T P - P A D R E - C E T P Cf u s i o np r

35、 o t e i nb yC e l l u l o s e - D E A E5 2a n i o n - e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y ， “l j oe l u t e d 础( p e a l , 3a n dp e a k4 ) w e r ew i t hc h i m e r i ca c t i v i t y 2 3A n s B - T T P P A D R E - C E T P C 酶活力测定 A r L s B - T T P - P A I ) R E _ C 暇经萘氏反应测定酶 活力，每个处理重复9 次，在

36、加入萘氏试剂后测各孔 的。m W 值，代入公式：酶活力一( ( 峨。0 0 7 ) ( 1 1 5 ) ( 1 0 0 0 x ) ( 3 + x 1 0 0 0 ) ，其中x 为加入的反 应液体积( 肚1 ) ，算出嵌合酶A n s B T I P _ P A D R E - C E T P C 的酶活力为每毫克蛋白1 4 6U ，而天然酶A n s B 的 酶活力为每毫克蛋白2 4 0U 。门冬酰氨酶1 个酶活力 单位( U ) 定义为3 7 下每分钟催化L 一天门冬酰氨释 放出1m m o l I 。氨所需要的酶量。嵌合酶A n s B l v r P - P A D R E - C E

37、 T P C 保留了天然A n s B 约6 1 的酶活力。 这个结果表明嵌合酶在融合了T r P 、P A D R E 和 C E 丌P C 之后仍然保留了天然嵌合酶的大部分活力。 2 4 抗C E T P 抗体的E L I S A 检测 经肌肉注射免疫新西兰大白兔后，P B S 与 烈( O H ) 。对照组免疫组未见有抗C E T P 抗体产生， 但在A n s B - m P A D R E _ C 赋免疫组显示出了 高的抗C E T P 抗体( 图4 ) 。血清中抗C K I P 抗体从 2 5 蒉2 三 三I 5 当 置1 ； 8 0 5 0 T i m e ( 、_ s e e

38、k ) 一一S e r u ms a m p l e sf r o mA n s B - 1 v n l P A D R B C E r P Cv a e e i n a t e d r a b b i t s ；一一S e m s a m p l e sf r o mA I ( O H ) 3v a c c i n a t e dr a b b i t s ； 一n S e n J m s a m p l e sf r o mP B Sv a c c i n a t e dr a b b i t s S p e c i f i ca n t i C 阴) a n t i b o d i e

39、sw e r ed e t e c t e da tt h ew e e k3a f t e rt h es e c o n di m m u n i z a t i o nw i t hA r L q 3 - 1 T P - P p 正暇E C F r F r e a c h e dt Ot h e m a x i m u ml e v e la tt h ew e e k9 ( a f t e rt h ef i f t hi m m u n i z a t i o n ) a n dl a s t e d i nh i g hl e v e lf o ri n o r at h a n1

40、 9w e e k sf r o mt h ew e e k3t Ow e e k2 1i nv i v o F i g4A n t i C E T Pa n t i b o d i e si nN e wZ e a l a n dw h i t er a b b i t s a s s a y e db vE L I S A 加加舳如加 万方数据 孙云霄等：抗动脉粥样硬化疫苗的制备及免疫学研究 4 1 5 第3 周开始( 第2 次免疫后) 产生，于第7 9 周，也 即第4 - - 5 次免疫后达到最大，并在第9 周开始( 第 5 次免疫后) 饲喂高胆固醇食物后，新西兰大白兔 体内抗C E T

41、 P 抗体以较高水平持续存在，直至第 2 1 周将新西兰大白兔颈动脉放血处死。 2 5免疫后兔主动脉粥样硬化病斑的检测 对照P B S 组主动脉粥样斑块面积占血管总 面积的2 7 4 ，与N o r m a l 组比具有显著的统计F i g8A o r t i ca t h e r o m a t o u sp a t c hi nt h er a b b i t si m m u n i z e d 学意义( P 0 01 ) 。A n s B T T P 二R 岫R E - C E T P C i n t r a m u s c u l a r l yw i t hA 1 ( O H )

42、3 A o r t aw a ss t a i n e dw i t h 组主动脉粥样斑块面积占血管总面积的百分比 如d a n I 为9 8 1 ，主动脉斑粥样斑块面积与P B S 组相比 明显减少，具有显著的统计学意义( P o 0 1 ) ( 图 5 ) 。各免疫组主动脉粥样硬化病斑染色结果见 图6 9 。 2 5 0 0 2 0 0 0 曼1 5 0 0 罢1 0 0 0 5 0 0 O N o r m a lP B S A I ( 0 H ) ，A n s B - T - P - C 。P O 0 5a n d P O 0 1c o m p a r e dw i t hn o r m

43、 a lg r o u p ；9P 0 0 5a n d 4 4P O 0 1c o m p a r e dw i t hP B S g r o u p ：A o r t i ca r e a ； 口：P a t c ha r e a ，A J l s B T P C ( A n s B - T T P P A D R E - C E T P C ) F i g5 P a t c ha r e ai na o r t ao b t a i n e df r o mN e wZ e a l a n d w h i t er a b b i t si m m u n i z e di n t r

44、a m u s c u l a r l y F i g6 A o r t i ca t h e r o m a t o u sp a t c hi nt h en o r m a lr a b b i t s A o r t aw a ss t a i n e dw i t hS u d a ni l l F i g7 A o r t i ca t h e r o m a t o u sp a t c hi nt h er a b b i t sh r g n u n i z e di n - t r a m u s c u l a r l yw i t hP B S A 岫r t aw a

45、ss t a i n e d 埘t hS u d a n F i g9 A o r t i ca t h e r o m a t o u sp a t c hi nt h er a b b i t si m m u n i z e d i n t r a m u s c u l a r l yw i t hA n s B - T T P - P A D R E - C E T P Cp r o t e i n A o r t aw a ss t a i n e dw i t hS u d a n 3 讨论 动脉粥样硬化是一种自身免疫性炎症疾病，近 年来，越来越多的自身蛋白被发展为疫苗 1 5

46、1 8 | ， C E T P 也已被用来发展成抗动脉粥样硬化的疫 苗 6 8 。研究表明抗C E T P 抗体能抑制C E T P 活 性，提高H D L C 含量并抑制动脉粥样斑的发展。 因此，通过诱导抗C E T P 抗体抑制C E T P 活性应 该是一种防治动脉粥样硬化的安全和有效的方法。 本实验室研究一种用于对抗人内源C E T P 的动脉 粥样硬化多肽疫苗，该疫苗以C E T P 羧基末端2 6 肽为核心，注人体内后诱导产生抗C E T P 抗体，该 抗体与内源C E T P 结合后可抑制C E T P 的酶活 性，从而减少粥样硬化斑块的形成。 R i t t e r s h a

47、 u s 用化学方法设计合成了针对 C E T P 的疫苗并进行了动物试验，用来治疗动脉粥 样硬化8 l 。由于通过化学方法合成多肽较昂贵、 收率低、不易纯化等，尤其在发展中国家不易于大 规模生产，因此我们以大肠杆菌L 一门冬酰胺酶I I ( A n s B ) 为载体，引入2 个强的辅助T 表位( 1 v r P 和P A D R E ) ，利用生物合成法来合成多肽疫苗，得 到具有高抗原性的融合蛋白A n s B - T T P P A D R E 万方数据 4 1 6药物生物技术 第1 5 卷第6 期 C E T P C 。门冬酰胺酶由4 个相同的亚基组成，因 此一个酶分子上呈现有4 个环

48、状多肽，有形成2 聚 体、3 聚体、4 聚体，甚至8 聚体或1 2 聚体以上多聚 分子的倾向，这种颗粒化倾向有利于增强免疫原 性。重组的嵌合酶也有形成多聚体的能力，每个酶 分子能递呈4 个以上的C E T P C 表位给抗原递呈 细胞。加之抗原递呈细胞如巨噬细胸和树突状细胞 等更容易递呈相对大分子质量的抗原，这些都有 利于提高重组蛋白的抗原性。门冬酰胺酶已经 在临床上用于治疗白血病和淋巴瘤 19 | ，其安全性 已经得到验证。因此用该酶作为呈现载体，开发 用于人体的药物，将是较为安全的。P A D R E 表 位刺激T 细胞增殖的能力是T T P 表位的1 0 0 倍，根据易接近原则，使P A D R E 表位位于T T P 表位的外侧。直接与C E T P C 相连接，这样，疫苗 的抗原性会更强。 根据T T P P A D R E C E T P C 的基因全序列，选 用大肠杆菌偏爱的密码子设计引物T P C I 一T P C 5 ， 因此构建的T T P - P A D R E - C E T P C 基因片段能有 效地在大肠杆菌中表达。菌体裂解上清液经硫酸 铵分级沉淀后所得沉淀用C e l l u l o s e - D E A E5 2 阴 离子交换柱进行分离。分离过程中使用分段洗脱 可以有效地将