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1、书书书 论著 基金项目： 国家自然科学基金资助项目 （30340045） 作者单位： 400014 重庆医科大学附属儿童医院免疫室 抗呼吸道合胞病毒 M2-1 基因 pshRNA 载体质粒的构建及效应研究 崔玉霞 周娟 方平 蒋利萍 王莉佳 杨锡强 【摘要】 目的 构建针对人类呼吸道合胞病毒 （RSV） M2-1 基因 mRNA 的 pshRNA 表达载体， 并 在培养细胞内观察其对 RSV 复制的影响， 为从基因水平抑制 RSV 感染的研究奠定基础。方法 将构 建成功的表达载体 pshRNA7816 转染 Hep2 细胞， 然后利用光镜观察 pshRNA7816 对 RSV 致 Hep2 细
2、 胞病变效应的影响， 空斑实验检测 RSV 滴度变化以及四甲基偶氮唑盐比色实验检测 pshRNA7816 对 被 RSV 感染后细胞的保护作用。结果 成功构建了针对 RSV M2-1 基因 mRNA 的 pshRNA7816 载体 质粒， 研究发现 pshRNA7816 能明显改善 RSV 所致的病变效应， 降低 RSV 在细胞内复制的病毒滴度， 并且能明显提高被 RSV 感染后细胞的存活率 （P 0. 05） . Conclusion The recombinant pshRNA7816 plasmid which targeted the mRNA of RSV M2-1 gene sho
3、wed a significant and specific anti- RSV effect. 【Key words】 Respiratory syncystial viruses； Genes，viral； Plasmids； Virus replication 呼吸道合胞病毒 （respiratory syncystial virus， RSV） 是世界范围内婴幼儿下呼吸道感染的首要病 毒病原， 迄今为止尚无安全有效的抗 RSV 疫苗及治 疗药 物 问 世 1， RNA 干 扰2 （ RNA interference， RNAi） 技术是一种能阻断目的基因表达的有效方 法， 为了从基因水
4、平抑制 RSV 复制， 我们选择对 RSV 复制起关键作用的 M2 基因 3-5作为靶基因， 利 用含有 U6 启动子， 以 pEGFP-C1 为骨架的转录载体 Pgenesil-1 构建能产生短发卡结构状 RNA （short hairpin RNA， shRNA） 的载体质粒， 并在培养细胞内 观察其对 RSV 复制的影响， 为今后利用 RNAi 技术 抗 RSV 感染的深入研究奠定基础。 材料与方法 一、 材料 858中华儿科杂志 2005 年 11 月第 43 卷第 11 期 Chin J Pediatr，November 2005，Vol 43，No. 11 图 1 pshRNA78
5、16 设计示意图 1. 质粒、 细胞与病毒： 含有绿色荧光蛋白 （GFP） 表达序列和 U6 启动子的质粒 Pgenesil-1 由 重庆医科大学肝炎研究所惠赠； 人喉癌上皮细胞 Hep-2 由本实验室提供； RSV 标准株 A2 株购于中国 预防医学科学院病毒研究所。 2. 主要试剂： T4DNA 连接酶、 各种限制性内切 酶购于大连宝生物有限公司、 脂质体转染试剂 LipofectamineTM2000 购于美国 Invitrogen 公司， 小量 质粒提取试剂盒购于美国 Promega 公司， 大量质粒 提取试剂盒购于德国 Qiagen 公司， 灭活胎牛血清 （FBS） 购于天津灏洋生物
6、制品科技有限公司， 胰酶、 病毒维持液 （DMEM） 培养液及 PBS 为本实验室 提供。 3. shRNA 序列合成和测序： 所设计的 shRNA 序 列在上海博亚公司合成， 构建成功的质粒测序由上 海华大公司完成。 二、 方法 1. 细胞与病毒培养： Hep2 在含 10% FBS 和 青、 链霉素的 DMEM 中培养传代， 病毒在含 2% FBS 和青、 链霉素的 DMEM 培养的 Hep2 细胞中繁殖传 代， 将滴度为 1. 28 107pfu/ ml 的病毒储存于 -80备用， 在本实验中均使用此浓度的病毒。 2. RSV-M2 基因 shRNA 载体质粒的构建： （1） 针对 RS
7、V-M2 基因 shRNA 的双链核苷酸设 计与合成： 根据 siRNA 的设计原则， 针对 RSV 标准 株 A2 株编码 M2-1 蛋白的 mRNA， 从起始密码子下 游寻找符合设计特征的靶序列， 设计出针对编码区 7816-7834 核苷酸碱基序列的一对正、 反义核苷酸 链，并用 BLAST 软件进行同源 分析证实为 RSV 高度保守后， 采用化学合成方法合成。取等 量 100 mmol/ L 的单链寡核苷 酸合 成 片 段， 在 退 火 缓 冲 液 （100 mmol/ L NaCl） 中于 95 保温 5 min 后， 缓慢降至室温得 到退火双链 DNA。寡核苷酸形 成双链后 5端带
8、有改变一个碱 基的 BamH酶切位点以做酶 切鉴定， 3端带有 Hind酶切 位点， 5端开始为 19 个核苷酸 的正义链， 中间以 9 个核苷酸 间隔 TTCAAGACG 形成发夹结 构， 其后为 19 个核苷酸的反义 链， 3 端 加 有 转 录 终 止 信 号 TTTTT。具体设计见图 1。 （2）载体质粒 pshRNA7816 的构建与鉴定： 将 上述纯化的 DNA 片段分别与经 BamH和 Hind 双酶切的转录载体 Pgenesil-1 进行连接， 得到含针 对 RSV-M2 基因 shRNA 的表达载体 pshRNA7816， 经 BamH、 Hind及 BamH + Hind酶
9、切鉴定， 筛选出含目的基因的阳性克隆， 最后测序证实质粒 构建正确。根据 Qiagen 大量抽提质粒说明书抽提， 大量质粒备转染细胞用。 3. 观察 pshRNA7816 转染效率： 按脂质体转染 试剂 LipofectamineTM2000 说明书转染载体质粒， 转 染液为无抗生素无血清的 DMEM， 转染 6 h 后换含 血清的培养液， 根据 GFP 表达后发绿色荧光的特 点， 细胞于转染后24 48 h， 倒置荧光显微镜下直接 观察转染情况并照相， 通过绿色荧光细胞发生率评 估转染效率。 4. 观察 pshRNA7816 对 RSV 引起的细胞病变效 应 （cytopathogenic
10、effect， CPE） 的抑制作用： 以 1 104的 Hep2 细胞接种 96 孔培养板， 待细胞长成单 层后， 按 Lipofectamine TM2000 说 明 书 分 别 进 行 pshRNA7816 及无关质粒的转染， 6 h 后用 0. 1 感染 复数 （multiplicity of infection， MOI） 的 RSV-A2 株感 染 Hep2 细胞， 逐日在倒置显微镜下观察 CPE， 病变 程度表示为 6： 75% （ + + + + ） ， 待病毒 感染未处理组 CPE 达到 （ + + + ） （ + + + + ） 时 终止实验并摄像。 5. 空斑形成实验检测
11、 pshRNA7816 对病毒滴度 958中华儿科杂志 2005 年 11 月第 43 卷第 11 期 Chin J Pediatr，November 2005，Vol 43，No. 11 的影响： 将 pshRNA7816 及无关质粒转染 12 孔培养 板的单层 Hep2 细胞， 6 h 后感染 0. 1 MOI 的 RSV， 同时设置无 RSV 感染对照组、 RSV 感染未处理组及 无关质粒处理对照组， 当 RSV 感染未处理组的细胞 CPE 达到 （ + + + ） （ + + + + ） 时停止实验， 各组 同时收集培养上清进行空斑试验。以 Hep2 为基质 细胞， 1. 5%营养琼脂
12、为覆盖层， 37、 5% CO2培养 箱内倒置培养 5 d 后用四甲基偶氮唑盐 （MTT） 染 色， 孵育 4 h 观察空斑结果并计算病毒抑制百分率， 公式为 7： 病毒抑制百分率 =1 - 处理组空斑数 对照组空斑数 100% 6. MTT 法检测 pshRNA7816 对细胞存活率的 影响： 将 pshRNA7816 及无关质粒转染 96 孔培养板 的单层 Hep2 细胞， 6 h 后感染 0. 1 MOI 的 RSV， 同 时设置未感染 RSV 组、 RSV 感染未处理组及 RSV 感染无关质粒处理组， 当 RSV 感染未处理组的细胞 CPE 达到 （ + + + ） （ + + + +
13、 ） 时停止实验， 空白 孔调零， 用 MTT 比色法计算细胞存活率， 公式为 8： 细胞存活率% = 实验组光吸收值 （A） 对照组光吸收值 （A）100% 7. 统计学处理： 结果以均数 标准差 （-x s） 表 示， 采用 SPSS 11. 0 医学统计软件对实验资料进行 方差分析或 t 检验， P 0. 05； 与正常对 照组比较*P 0. 001 讨论 RNA 干扰是由双链 RNA （double strand RNA， dsRNA） 引发的使细胞内同源 mRNA 降解的转录后 基因沉默现象， 可以特异性抑制相应互补碱基序列 的基因表达， 以防御外来有害转座子或病毒的入侵。 其作用机
14、制主要是当dsRNA被导入细胞后， dsRNA 068中华儿科杂志 2005 年 11 月第 43 卷第 11 期 Chin J Pediatr，November 2005，Vol 43，No. 11 图 3 pshRNA7816 转染细胞 GFP 蛋白的 表达 （倒置荧光显微镜 200） 图 4 正常Hep2 细胞 （ 光镜 250） 图 5 RSV 感染 （MOI =0. 1） 细胞基本圆缩， 脱落 （光镜 250） 图 6 RSV 感染 （MOI = 0. 1） 经 pshRNA7816 处理后 Hep2 细胞， 部 分细胞圆缩脱落， 大多数细胞形态正常 （光镜 250） 图 7 RSV
15、 感染后特征 性融细胞病变 （光镜 400） 被细胞内核酸内切酶切割成 21 23 bp 的小干扰 RNA （small interference RNA， siRNA） ， 进而启动细 胞内的 RNAi 反应， 而导致基因沉默，研究发现， 19 23 bp 的 siRNA 能特异地诱导 RNA 干扰 9， 10， siRNA 可通过直接化学合成或体外转录产生， 也可 由启动子转录形成小发卡结构状 RNA 在体内产生 siRNA 11-13。目前， 已经证明在培养的哺乳细胞中 RNAi 可用于抗病毒和抗肿瘤的基因治疗 14-16。并 且有研究报道利用 RNA 干扰技术可抑制多种病毒 的感染，
16、比如抑制 RSV、 HIV、 SARS 病毒、 流感病毒、 乙肝病毒、 麻疹病毒、 脊髓灰质炎病毒等。 RSV 隶属于副黏病毒科、 肺炎病毒属， 为非节 段性、 单 股 负 链 RNA 病 毒， 共 编 码 10 种 蛋 白 质 17， 18， 其基因顺序为 3-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F- M2-L-5，RSV 的 M2 基因包含两个重叠的开放阅读 框架， 编码两种蛋白 M2-1 和 M2-2， M2-1 蛋白为病 毒复制所必需的转录延长因子， 并且还增加病毒多 聚酶复合体在转录复制中对 RNA 的通读能力， 从而 在 RSV 的复制中发挥重要作用 3-5， 故本研究中选 择
17、RSV M2 mRNA 作为基因干扰的靶目标， 构建能 表达针对 RSV M2 基因编码区的 pshRNA7816 载体 质粒， 并 转 染 Hep2 细 胞， 在 细 胞 水 平 观 察 了 pshRNA7816 对 RSV 复制的抑制。 本研究利用构建成功的 pshRNA7816 载体质粒 转染 Hep2 细胞， 通过绿色荧光蛋白表达观察转染 效率， 在保证高效转染的情况下进行系列实验。病 毒对细胞结构影响的普通形态学特征称为 CPE， CPE 是病毒复制的必需阶段 19， 本研究中我们首先 观察了 pshRNA7816 对 RSV 所致 CPE 的影响， 结果 发现， pshRNA781
18、6 能明显改善 RSV 所致的细胞病 变， 减轻细胞间的融合改变； 空斑技术是病毒研究中 常用的、 较为精确的病毒定量和纯化技术 20， 我们 应用空斑实验证实了 pshRNA7816 能显著抑制病毒 空斑形成， 降低病毒滴度； 另外我们还应用 MTT 法 检测了 pshRNA7816 和无关质粒对 RSV 感染细胞存 活率的影响， 结果表明， pshRNA7816 能显著提高 RSV 感染后细胞的存活率， 对细胞有保护作用； 同 时我们还对比观察了无关质粒对 RSV 感染后细胞 CPE、 病毒空斑形成及存活率的影响， 结果发现无关 质粒对照组并不能改善 RSV 感染后细胞 CPE 的形 成，
19、 也不能减少空斑形成数目及提高细胞的存活率， 由此可说明 pshRNA7816 具有特异性的抗 RSV 作 用。 综合本研究的实验结果表明， 我们针对 RSV M2 基因所构建的载体质粒在细胞水平具有明显的 和特异性的抗 RSV 效应。 参考文献 1Maggon K， Barik S. New drugs and treatment for respiratory syncytial virus. Rev Med virol， 2004， 14： 149-168. 2Fire A，Xu S，Montgomery MK，et al. Potent and specific genetic int
20、erference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature， 1998， 391： 806-811. 3Collins PL， Hill MG， Cristina J， et al . Transcription enlongation factor of respiratory syncytial virus，a nonsegment negtive-strand RNA virus. Proc Natl Sci USA， 1996， 93： 81-85. 4Hardy RW，Harmon SB，Wertz GW.Di
21、verse gene junction of respiratory syncytial virus modulate the efficiency of transcription termination and respond differently to M2-mediated termination. J Virol， 1999， 73： 170-176. 5Hardy RW， Wertz GW. The product of the respiratory syncytial virus M2 gene ORF1 enhances readthrough of intergenic
22、junction during viral transcription . J Virol， 1998， 72： 520-526. 168中华儿科杂志 2005 年 11 月第 43 卷第 11 期 Chin J Pediatr，November 2005，Vol 43，No. 11 6傅继华， 主编. 病毒学实用实验技术. 山东： 山东科学技术出版 社， 2001. 61. 7Cirino NM，Li G，Xiao W，et al. Targeting RNA with 2，5 oligoadenylate-antisense in respiratory syncytial virus-i
23、nfected cells. Proc Natl Acad Sci USA， 1997， 94： 1937-1942. 8司徒镇强， 吴军正， 主编. 细胞培养. 西安： 世界图书出版西安公 司， 2004. 200. 9Elbashir SM，Harborth J，Lendeckel W，et al. Duplexes of 21- nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature， 2001， 411： 494-498. 10Yu JY，Deruiter SL，Turner DL. RN
24、A interference by expression of short interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci USA， 2002， 99： 6047-6052. 11Sui G，Soohoo C，Affar B，et al.A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci USA， 2002， 99： 5515-5520. 12Pa
25、ddison PJ，Caudy AA，Bernstein E，et al. Short hairpin RNAs （shRNAs）induce sequence-specific silencing cells. Science， 2002， 296： 550-553. 13Yang D，Buchholz F， Huang Z，et al. Short RNA duplxes produced by hydrolysis with Escherichia coli RNase mediate effective RNA interference in mammalian cells. Proc
26、 Natl Acad Sci USA，2002， 99： 9942-9947. 14Hammond SM，Bernstein E，Beach D，et al.An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells. Nature， 2000， 404： 293-296. 15Bernstein E，Caudy AA，Hammond SM，et al. Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of R
27、NA interference.Nature， 2001， 409： 363-366. 16Yang D，Lu H，Erickson JW.Evidence that processed small dsRNAs may mediate sequence-specific mRNA degradation during RNAi in Drosophila embryos. Curr Biol， 2000， 10： 1191-1200. 17Collins PL，Werts GW. cDNA cloning and transcriptional of nine poolyadenylated
28、 RNAs encoded by genome of human respiratory syncytial virus . Proc Natl Sci USA， 1983， 80： 3208-3212. 18Collins PL， Dickens LE， Buckler-White A， et al. Nucleotide sequence for the gene junction of human respiratory syncytial virus reveal the distinctive features of intergenic structure and gene ord
29、er. Proc Natl Sci USA ， 1986， 83： 4594-4598. 19杨占秋， 余宏， 主编. 临床病毒学. 北京： 中国医药科技出版社， 2000. 18-26. 20郭元吉， 程小雯， 主编. 流行性感冒病毒及其实验技术. 北京： 中 国三峡出版社， 1997. 97-100. （收稿日期： 2005-06-20） （本文编辑： 关卫屏） 通告声明曝光 关于一稿两投和一稿两用问题处理的声明 为维护 中华儿科杂志 的声誉和广大读者的利益， 根 据中华医学会杂志社的统一要求，中华儿科杂志 编辑委 员会就一稿两投和一稿两用问题的处理声明如下。 1. 一稿两投和一稿两用的认
30、定： 凡属原始研究的报告， 同语种一式两份投寄不同的杂志， 或主要数据和图表相同、 只是文字表达可能存在某些不同之处的两篇文稿， 分别投寄 不同的杂志， 属一稿两投； 一经两个杂志刊用， 则为一稿两 用， 重复发表。会议纪要、 疾病的诊断标准和防治指南、 有关 组织达成的共识性文件、 新闻报道类文稿分别投寄不同的杂 志， 以及在一种杂志发表过摘要而将全文投向另一种杂志， 不属一稿两投。但作者若要重复投稿， 应征得首发期刊编辑 部的书面同意。 2. 作者在接到收稿回执后满 3 个月未接到退稿通知， 表明稿件仍在处理中， 若欲投他刊， 应先与本刊编辑部联系。 3. 编辑部认为文稿有一稿两投或两用，
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