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1、微 R“# 对 $%暨南大学医学院生物化学与分子生物学教研室,广东 广州%(+*华南基因组研究中心,广东 广州 %(+,+) 摘要:目的 应用基因芯片技术,研究微R“#(-.R/(,(0)对人白血病1%?0-.7AB脂质体法转染1%.67?)D4-0) (C寡核苷酸基因芯片,检测和分析对照组与微R“C转染组间的基因表达谱差异。 结果 从+)(E*个候选基因中,筛选 出,个差异表达基因。 与对照组1%表达下调的有(微R“C;白血病;基因表达谱;基因芯片 中图分类号:RE*SET)R*FNS)文献标识码:#)文章编号:(QLD_QRQ;.77b.;QL06QX.c7b9.?ZQd40;eRR7-.
2、9?bZQ03QB460bQ f.06QO9QR7970bRQO7?7bQd40;eR:$%)?: A?Qb7669Q 49.;Q-.bR.h47S Q:%AB73Q03Q9Z?R79.e73Q07Q?.46?4b73Q1%Q:6.;?0-.7AB Q;77Q 785b799.7669Qi7b7Q9?43.73Q03Q006Ze73Q49.;QC;.67?QW4-0Q(CQ:6.;bb7773Q;779 Q.643.;Q%FQ452b7;460?73Q.0?73Q;779Q?4-?0?73Q;779Q.-4.?ZQ03Q37=7972099VQ03Q(779Q9.;06Q?b0934?0?73
3、Q;779Q766QZ67Q03Q37c76.0?73Q;779Q7?SVQ.Q?R7Q?b09=7?73Q1%79Q.Q785b799.b.5?.R0.Qb70?.?.79Q;77Q 785b799.R0;79Q.Q1%Q?R7Q=4?.?.bb.5?;S QAR797Q=.3.;9Q5b7Q=R.7b.79Q 03Q =4?.b7669S 6:F G*BantiEenEeZ JQCACCSACASCSQQSAAQSQQSQJU。miRNA NXleY 由广州市锐博生物科技有限公司合成,J20 保存。 1.U.2 细胞培养K62细胞培养于含10小牛血 清,无青、链霉素的RPMI 1640培养
4、基中,培养条件 为UT、CO2,每U_4TN换液传代培养。 1.U.UT转 染 用Oligofectamine?M脂 质 体 转 染 法当 K62细胞汇合率达到0_W0时, 在24孔板中进 行转染。 实验共分U组,每组W孔,分别为转染组、阴 性对照组和空白对照组。先用PMV缓冲液将细胞洗1 遍,之后用OtiJMBMTTTIT减血清培 养基重悬细胞沉淀,接种于24孔板 中,每孔细胞数为10,终体积为 600Tl, 然后各组再分别按如下进 行转染。 处理组每孔miRNA终浓 度 为0.1T molLUT lT miRNAT NXleYT溶于0TlT减血清培养基aT UTlTOligofectami
5、ne?M溶于12TlT减 血清培养基;阴性对照组每孔为:UT lTOligofectamine?M溶于12TlT减血清培养基; 空白 对照组未加任何处理。 将24孔板放在U 、TCO2 培养箱中培养4TI后,每孔加入60TlT小牛血清,使培 养液血清终浓度约为10,培养4WTI后收集细胞。 1.U.4TT总RNA抽提及样品标记 收集转染组、阴性对 照组, 按照RNeaEFTmini试剂盒说明抽提细胞总 RNA,RNA质量采用AgilentT2100生物分析仪进行 鉴定,结果显示2WTV和1WTVTRNA比值约为2:1,符合 芯片检测要求。 样品标记按照AgilentTcRNA线性荧 光扩增标记
6、试剂盒说明书提供的方法进行,采用CF 标记转染组样品,CFU标记对照组样品, 标记好的 cRNA样品用RNeaEFTmini试剂盒进行纯化。 1.U.TT芯片杂交、扫描及数据采集 采用bXmanT1A全 基因组寡核苷酸芯片(22个点),包含约201U个 基因,c1W个阳性对照探针,162个阴性对照探针。 按照Agilent公司的原位杂交试剂盒说明书配制 2cRNA样品溶液、2杂交溶液。 之后取一新盖玻片 (标签面向上) 置于杂交盒底座上, 在盖玻片上滴加 40Tl杂交标本,将寡核苷酸芯片(数字面向上)盖 在盖玻片上,装好杂交盒后,置于杂交炉中60 , 4TDmin杂交16TI。 芯片洗涤、干燥
7、等操作均按照说明 书进行。 采用AgilentT26MA基因芯片扫描仪进行 芯片扫描,扫描后的图像用deatXDeTBYtDaction软件进 行数据采集、分析及均一化处理。 1.U.6TT差异基因筛选方法 将deatXDeTBYtDaction软件 导出的数据导入BYcel软件进行分析, 以CFU以及 CFTLogRatioTPTRalXe为标准进行判断。 1.U.TT半定量R?JPCR验证部分差异基因从上述差 异表达基因中, 选出4个可能的靶基因作进一步验 证。 取1 g总RNA,加入OligoKN?O1W在AMR逆 转录酶作用下进行逆转录反应,反应体系为20 l,反 应条件为42 60T
8、min,2 10Tmin。 以SAPeb为内 参 照 采 用 半 定 量R?JPCR验 证RALA、SEMA4C、 CTCF、ZAP04个基因, 引物由上海英骏生物技术有 限公司合成,引物序列及扩增产物长度见表1。PCR 反应条件为c4T Tmin;c4 U0TE,T U0TE,2T 1T min,U0T次循环;2T延伸10Tmin。 SeneT EFmHol doDfaDNTDimeDReCeDEeTDimeD LengtITofT DoNXct -AP./JCAACSSA?SS?CS?A?JU JCACAS?C?C?SSS?SSCJU41TH SEMA40JSCC?C?S?SSA?SS?S
9、JUJT?SASSA?S?S?CSSS?ASJU66cTH RA1AJA?CSSAASAASS?AS?SCJUJAA?C?SC?CCC?SAAS?JU1W2TH 2T2FJASS?SS?CCASSA?S?CJUJC?CASSCAAASS?ASSSJUU42TH ZAP0J?CCC?S?SASCAA?S?SSCJU J?SASCSSSCAS?S?AS?ASCJU1c4TH 表1半定量R?JPCR引物序列 Tab.1 Sequen e of the primers for semiJquantitative RTJPCR 周珏宇g等.微RNA对K62细胞基因表达谱的影响第期 R R 60 60 图
10、1 芯片数据可靠性验证 Fig.1 Confirmation of the reliability of the mi roarray data A: Expressions of !“#“ and $% B: Expressions of ()(* and +,70 mRNA in transfection group and control group; M: DNA marker DL2000; Lanes 1 and 3: Control group; Lanes 2 and 4: Transfection group 2 结果 2.1 芯片杂交结果 除质量控制点及未能达到分析要求而被
11、排除的 基因探针之外,在检测的20173个基因中,共筛出差 异表达基因228个,其中169个基因表达下调,59个 基因表达上调, 它们当中可能存在着miR_181a调控 基因表达的作用靶点。 2.2 生物信息学分析 对上述差异表达基因进行Panther生物学过程 分类,结果发现上调的59个基因中,已知功能基因有 57个, 包括O与信号转导相关 :CABP2、DDEP1、 ETL1、ETQ4、RLP2R、RNR10、PSTC1、UV3MD1、PE_W NX、PTPRN2、U100A1、UPUB3、QN1R1;Y与免疫防 御相关:UELP、NST4;Z与肿瘤发生相关:ANRPT2、 CP1A1、E
12、TQ1、RARP、PP、U100A4、UTX11、AP1U2、 CTCP、XAA1055、CSMMD5;与细胞周期及生长、 分 化 相 关 :XP5B、RAB23、RAB28、RPP8、TVSP1、 AP70、PP29;_与 转 运 相 关 :XCN9、ACCN1、 ULC12A5、XCNA2、ULC6A13、PTRDU、CSPE、UT9; a与 核 苷 酸 代 谢 相 关 :PL22578、NP215、PCBP1、 PSLR2D;b其 它 :BRLAP、CCVC6、TMEM44、 C6orf136、PL3577等。 而169个下调基因中, 已知功能基因有154个, 包 括c与 肿 瘤 发 生
13、 相 关 :ABCC6、CAQ2、ERBB4、 VSTA7、CT1、LMS2、SRR1、RAD51C、RALA、RAP_W 1RDU1、TX1、TAT1BP1、Rd2、EPLN、MdCDVL、TU_W AP6、NMe022097.1、AXR1B10、LEPRE1、NMe025214. 1、B3Rn_T6;f与免疫防御相关:ABCC4、ALST12B、 AP3U1、BP、CCL25、CD84、VLA_A、L13RA2、DEPB4、 L18BP、XREMEN2、NMe015569.1、USD1、UTL4、Q_W AMP1;g与抑制凋亡相关:PNA4、PNA21、RELB; h与发育相关:DRL2、
14、XAA0976、PRABN、NdP50、 VEM1、XRT9、RBM3;i与蛋白代谢与修饰相关: B3RALT3、BMPR1B、CABP5、CDC2L5、PL20313、N_W DS、MRPU5、MTMR1、NEd1、e957066、NMe005881. 1、NMe152699.1、ND_TUPR、PTPN18;j与核苷酸 代 谢 相 关 :DXPP547E2110、BLQRA、CUTP2T、 DDT18、TDP1、LkPBU_1、NMe001152.1、RPP20、PRPU_W AP1、PL10581、RRR、UTAd;l与脂类代谢相关: APSA1、VADV2、VUD11B2、PLA2R2
15、E、PLCB2、PLCL2、 USRT1、UAT4C、NMe015141.1;m与mRNA转录相 关:CNST4、VDAC9、MRC15631、STT2、TADA2L、 VBTAP、TAP12、e1109211、DERMS1、PP28、e1151_W 919、NP300、PL13590;n与信号转导相关:ARRB2、 ATP6Q0C、DUCR1L2、EPN3、RB5、RNB3、RPR15、RoW PR56、MTNR1B、UERPNA12、RALBP1、PPPA1、eW 1151949、e929207、e1221818、UEMA4C、e1152096、 TNTB、CEB1、TRV;p其他:CRB
16、、PBTS32、LEP_W REL2等。 本 文 实 验 数 据 已 经 提 交 美 国NCB的ReneW ExpressionWSmniqus数据库rRESs http:ttuuu.ncqi. nlm.nih.govtgeotw,接受号为RUE3605。 2.3 RT_PCR验证 选择其中4个差异基因,采用半定量RT_PCR作 进一步验证。 经RT_PCR检测,转染微RNA至X562 细胞48 h后,RALA的表达降低了28.8x,UEMA4C 的 表 达 降 低 了26.1x, 而CTCP的 表 达 上 调 了 39.8x,AP70的表达上调了93.7x,该结果进一步证 明了芯片结果的可靠
17、性y图1w。 3 讨论 微RNA的研究已经成为当前的一大热点,据预 测人的微RNA基因数约在200z255之间,约占人类 基因组的1x。目前已经确定的人的微RNA数有227 个,但对于微RNA的功能研究仍不尽人意,从1993 年发现第一个微RNA至今,在动物中发现的确定功 能的微RNA数量不超过10个3。 微RNA miR_181a是研究较多的一种与造血调 控相关的微RNA,它在小鼠骨髓B细胞中优先表达, 其表达上调与B淋巴细胞的分化相关。 体外试验证 南方医科大学学报y Uouth Med dnivw 第26卷 608 608 实,当其在造血干/祖细胞中表达时,促进了组织培 养试验和移植小鼠
18、外周血中的B细胞分化4。尽管并 未 见 到 有 文 献 报 道miR_181a与 白 血 病 有 关 , 但 Cheng等5人通过反义抑制miR_181a的表达促进了 肺癌细胞株A549的增殖, 提示miR_181a可能与肿 瘤细胞的增殖密切相关,但其具体的作用机制仍不清 楚。Ramkinssoon等6人通过Northern分析证实,在 K562细胞株中未检测到miR_181a的表达。 因此,本 研究利用Oligofectamine脂质体法转染化学合成的 miR_181a进入K562细胞, 模拟体内miR_181a的高 表达,观察其对K562生长和增殖的影响,并结合基 因芯片技术对miR_18
19、1a转染K562细胞48 h后的基 因表达谱进行了研究,同时结合生物信息学方法对相 关基因进行分析, 初步探讨miR_181a抑制K562细 胞生长的具体机制。 本研究中, 转染造血组织特异性的微RNA后, 细胞生长亦受到了抑制,但是否可以促使K562细胞 向良性方向发展还有待进一步研究。 我们还发现,ZAP70在转染后K562细胞内表达 上调, 而ZAP70信号通路的激活与T淋巴细胞的活 化有关,同时它又在TCR和MARK信号通路中起了 重要的作用。RPIP8、RAB23、IO1152453、PNP10都属 于Ras信号通路成员,已有研究表明CMQ病情的发 生发展确实与Ras信号传导通路有关
20、及Ras基因活 性失调有关7。 由此推测,miR_181a在K562细胞内 发挥作用的过程中可能涉及Ras信号传导通路。 PCBP1编码的是一种RolSTrCU结合蛋白,其主要作用 是抑制蛋白的翻译,同时可以稳定mRNA,它可能与 微RNA调控靶基因的机制有关。 研究发现的差异基因约75V(169个) 为下调基 因,这说明微RNA在体内主要是通过负调控靶基因 来完成其调控作用, 而这些基因主要是与肿瘤、 mRNA转 录 、 核 苷 酸 代 谢 相 关 基 因 。 我 们 发 现 miRW181a对K562细胞基因表达谱的影响,总体上看 表现为抑癌基因表达上调, 而原癌基因表达下调,可 以推测m
21、iRW181a可能对于肿瘤的生长具有一定的抑 制作用。下调基因还包含了一些与转录调控相关的基 因,它们可能是微RNA在转录后水平上抑制基因表 达的调控方式得以实现的基础。 然而,这种调控方式 是十分复杂的,是多基因共同调控的最终结果,因此 很难通过一次实验得知其靶基因。 但本研究,将造血 系统特异性微RNA转染K562细胞, 并从全基因组 水平上分析这种小分子非编码RNA对于真核生物 细胞基因表达的影响, 这为下一步深入了解微RNA 的功能及其具体的作用机制提供了重要的线索和依 据,同时也为白血病的治疗提供了一种新思路。 参考文献: 1XchYarZ X t_agnerP T et ala A
22、sSmmetrS in the assemblS of the RNAi enZSme comRlecde Cell 200f 115g2Uh 199W208e 2Kh_oro_a A ReSnolis A daSasena Xe jnctional siRNAs ani miRNAs echibit strani biasde Cell 200f 115 g2Uh 209W16e f陈 芳 殷勤伟e 调控基因表达的miRNAde科学通报 2005 50 g1fUh 1289W99e 4Chen CZ Qoiish je MicroRNAs as reglators of mammalian
23、hematoRoiesisde Xemin Immnol 2005 17g2Uh 155W65e 5Cheng AM BSrom Mk Xhelton d et ale Antisense inhibition of hman miRNAs ani iniications for an in_ol_ement of miRNA in cell groYth ani aRoRtosisde Ncleic Aciis Res 2005 ffg4Uh 1290W7e 6Ramkissoon X MainYaring QA OgasaYara l et ale ematoRoieticWsRecific microRNA ecRression in hman cellsde Qek Res 2006 f0g5Uh 64fW7e 7燕 翔 马文丽 宋艳斌 等e NWras基因在K562细胞中的表达研 究de解放军医学杂志 2005 f0 gfUh 245W6e 第5期周珏宇等e微RNA对K562细胞基因表达谱的影响 609 609