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1、中国医科大学学报J C h i n Me d U n i v 第 3 5卷第 1 期2 0 0 6年2月 2 3 星形胶质细胞对 P C 1 2 细胞的分化及突触素和生长相关 蛋白4 3 表达的影响 闯荣， 罗小光， 曹云鹏， 张朝东 ( 巾 国医科大 学附属 第一 医院神经 内科 ， 辽 宁 沈阳 1 1 0 0 0 日 摘要目的: 体外观察星形胶质细胞对 P C 1 2细胞向神经元分化的作用， 以及对 P C 1 2细胞突触素和生长相关蛋白4 3 ( G A P - 4 3 ) 表达的影响， 探讨星形胶质细胞促进非神经元细胞形成神经突触的可能性。方法: 采用P C 1 2细胞与断生大从皮层
2、组织来 源的星形胶质细胞共同孵育， 分为共育组和对照组， 应用免疫荧光技术检测星形胶质细胞对P C 1 2细胞分化、 神经元特异性玲 醉化酶( N S E ) , 突触素和G A P - 4 3表达的影响。结果: 共育组培养4d ， 大部分 P C 1 2细地已具备神经元形态， P C 1 2有突细厄j 总细胞数目比平、 突起长度和突触数目明显高于对照组 ( 尸 0 . 0 1 ) ; N S E , 突触素和G A P - 4 3免疚荧光染色强阳性的P C 1 2细 胞明显增多， 与对照组比较具有统计学意义 ( P 0 . 0 1 ) 。结论: 提示星形胶质甸胞有助于促进非神经元细胞形成神经
3、突触。 关键词1星形胶质细胞; P C 1 2细胞; 神经元分化; 突触紊; 生长相关蛋 白们 中图分类号8 3 7 3 文献 标识码A 文章编号0 2 5 8 - 4 6 4 6 ( 2 0 0 6 ) 0 1 一 0 0 2 3 一 0 3 E f f e c t o f a s t r o c y t e s o n d i f f e r e n t i a ti o n o f P C 1 2 c e ll s i n t o n e u r o n - l ik e c e ll s a n d e x p r e s s i o n o f s y n a p t o p h y
4、 s i n a n d g r o wt h- a s s o c i a t e d p r o t e i n -43 Y A N R o n g , L U O X i a o - g u a n g , C A O Y u n - p e n g , Z H A N G C h a o - l o n g ( 1) e p a n m e n t o f N e u ro l o g y , : h e F ir s t A ff il ia t e d H o s p i ta l , C h iv a M e d ic a l U n i v e r s it y , S h e
5、 n y a n g 1 1 0 0 0 1 , C h i n a ) ( A b s t r a c t O b j e c t i v e ; T o i n v e s t ig a te t h e e f fe c ts o f a s t r o c y te s o n t h e d i ff e r e n t ia t io n o f P C 1 2 c e ll s in to n e u ro n -li k e c e ll s a n d th e ， p r e s s i u n s o f s y n a p tn p h y s i n a n d g
6、ro w th - a s s o c i a t e d p rote i n -43 ( G A P 43 ) a n d t o d is c u s s w h e t h e r a s tr o c y t e s p rom o t e n o n n e u r o n - p ro d u c i n g s y n a p s es . Me t h o d s ; P C 1 2 cell s w e r e c o i n c u b a t e d w it h a s tr o c y t e s i s o la te d f ro m n e w b o r n
7、 r a t s , d iv i d e d i n t o 2 g r o u p s ( e o i n e u b a ti o n g r o u p a n d c o n t r o l g rou p ) ， a n d o b s e r v e d u n d e r p h a s e c o n t r a s t m i c r o s c o p e . I m mu n o fl u o re s c e n c e t e c h n i q u e w a s p e r fo r m e d to id e n ti f y t h e d iff e re
8、 n t ia t io n o f P C 1 2 c e ll s a n d th e e x p r e s s i o n s o f n e u ro n s p e c k e n o l a s e ( N S E ) , s y n a p t o p h y s i n , a n d G A P 4 3 . R e s u l t s ; I n c o in c u b a - l io n g ro u p , P C 1 2 cell s h a d ty p i c a l n e u ron a l c lt a mc te r is ti c s 4 d a
9、y s a f te r c o i n c u b a t io n . T h e r a ti o o f c e ll s w i t h p ro c e s s t o t o ta l c e l ls a n d t h e l e n g t h a n d n u m b e r o f s y n a p s e s in c o i n c u b a t io n g ro u p w e r e m u c h h ig h e r th a n th o s e i n t h e c o n t r o l g ro u p ( P 0 . 0 1 ) . T
10、h e r e w a s s ig - n if r c a n t d i ff e r e n c e i n t h e e x p re s s io n s o f N S E , s y n a p t o p h y s i n , a n d G A P -4 3 o f P C 1 2 c e ll s b e t w e e n t h e c o n t r o l g r o u p a n d c o i n c u b a t im t g ro u p ( P0 . 0 1 ) . C o n c l u s i o n ; A s t ro c y te s
11、p r o m o t e a n d C A P -4 3 in v i tro, w h ic h s u g g e s ts th a t a s tt o e y t e s t h e d i ff e r e n t i a t io n o f P C 1 2 c e l ls i n t o n e u r o n s a n d th e e x p r e s s i o n s o f s y n a p t o p h y s i n m a y p rom o t e n o n n e u r a n - p ro d u c i n g s y n a p s
12、e s . Ke y w o r d s 了 a s tr n c y te s ; P C2 cells;- d i ff e r e n t ia t io n ; s y n a p t o p h y s i n ; g m w t h - a s s o c i a t e d p m t e i n4 3 细胞移植治疗中 枢神经系统损伤变性疾病是神 经科学领域研究的 前沿。星形胶质细胞除了 具有原 来公认的营养支持作用， 在神经突触形成中如何发 挥作用尚无报道。 我们使用P C 1 2 细胞作为非神经 元细胞， 与星 形胶质细胞建立共同 孵育体系， 模拟脑 内微环境， 研究星形胶质
13、细胞促进P C 1 2 细胞向神 经元分化可能性; 突触素( s y m s p l o p h s i n ) 和生长 相关 蛋白4 3 ( G A P -4 3 ) 一直被作为突触重塑性蛋白， 本 实验研究星形胶质细胞能否促进 P C 1 2 细胞表达突 触素和G A P -0 3 ， 探讨星 形胶质细胞能否 促进非神经 细胞形成神经突触。 A金项目江宁省科学技术计划项目 ( 2 0 0 4 2 2 5 0 0 3 - 1 ) 【 作者简介目荣( 1 9 6 9一) ， 女， 副主任医师， 在读博士. 研究方向: 干细胞治疗A l z h e im e r 病 通讯作者7张朝东, E -
14、m a it ; w m v . y 11 d 1P 2 6 3 - c o m 1 材料与方法 1 . 1 实验动物与试剂 生后2d 的W i s t a r 大鼠， 由中国医 科大学动物 部提供。P C 1 2 细胞购于中国科学院北京细胞生物 研究所。F a l c o n c e ll C u l t u r e I n s e rt( 适合于2 4孔板， 微孔直径: 3 . 0 W m , 基因公司， 美国) ; 抗体: 神经元 特异性烯醇化酶( n e u r o n - s p e c i f i c e n o l a s e , N S E ) ( 兔 抗鼠单克隆) ， 胶质纤
15、维酸性蛋白 ( g l i a l fi b ri ll a r y 中国医科大学学报第 3 5 卷 a c i d i c p ro t e i n，G F A P ) ( 兔抗鼠单克隆) ，C A P -4 3 ( 兔抗鼠单克隆)购自武汉博士德公司;突触素 ( s y n a p t o p h y s in ) ( 小鼠抗鼠单克隆，s t r e s s g e 。 公 司， 加拿大) 。 1 . 2 实验方法 1 . 2 . 1 星形胶质细胞的分离、 培养及鉴定和 P C 1 2 细胞的培养: 生后2d的Wi s t a r 大鼠4只， 无菌操作 下取双侧皮层， 剪碎， 0 . 2 5
16、 %胰蛋白 酶消化( 3 VC , 3 0 m i n ) ， 反复吸打、 离心( 1 0 0 0 r / m i n , 5 m i n ) ， 收集细 胞， 3 7 cC孵育 Ih ， 差速贴壁去除成纤维细胞， 含 1 0 %胎牛血清高糖 D M E M培养基培养。培养9 d , 细 胞长至8 0 %一 9 0 % 融合后， 置于3 7 摇床中振荡 2次( 2 5 0 r / m i n ， 第 1 次: 1 2一1 4 h ; 第 2次: 3 0一 6 0 m i n ) ， 得到较纯化的星形胶质细胞。为进一步纯 化， 可重复振荡传代。以G F A P ( 1 : 1 0 0 ) , N
17、 S E ( 1 : 1 0 0 ) 作为一抗， F I T C I e y 3 标记的 二抗进行细胞免疫 荧光染色鉴定星形胶质细胞。 P C 1 2细胞的培养 : 用含 1 0 %马血清和5 %胎牛 血清的 R P MI 1 6 4 0培养基将 P C 1 2细胞培养在 2 5 cmsc m 培养瓶中， 当 细胞铺满7 0 % 一 9 0 %瓶底时用。 . 2 5 %胰酶消化， 按1 : 3 进行传代。 1 . 2 . 2 P C 1 2 细胞与星形胶质细胞共同孵育， 免疫 荧光染色检测 P C 1 2细胞分化成熟度: P C 1 2细胞按 I x l 护密度随机接种在2 4 孔板中， 将生
18、长状态良 好的星形胶质细胞按 1 x 1 0 ， 密度随机接种于F a l - c o n c e ll c u l t u r e i n s e rt 中 。 依 次 分为 两 组: 共 育组 为 P C 1 2细胞 十 星形胶质细胞， 对照组为 P C 1 2细胞 + 1 0 %胎牛血清的D M E M培养液， 设6 个时间点: 0 , 1 , 2 , 3 , 4 , 7 d ， 每个时间点设 S孔。每组随机选取 1 0 个视野进行拍照。 N S E 免疫荧光染色观察P C 1 2 细胞突起生长、 分化和突触形成情况。计量每个视 野有突细胞数 / 总细胞数百分比( 突起长度超过 P C
19、1 2 细胞直径的 算一个有突细 胞) 、 突起长度、 长突 起之间形成突触数目， P C 1 2细胞分化鉴定一抗为 N S E ( 1 : 1 0 0 ) ， 二抗为F I X 标记的I g G o 1 . 2 . 3 免疫黄光染色检测 P C 1 2细胞突触素和 G A P 4 3 的 表达: 两组分别于共育第4 d , 4 %多聚甲 醛固定 1 0 m i n , P B S洗 3 次( 5 m i n ) ， 分别用不含曲 拉通和含曲 拉通的B S A封闭3 0 m i n 和2 0 m i n , 加人 I 抗， 在3 7 摇床孵育2 h , P B S洗3次( 5 m i n )
20、， 加 人II 抗， 避光， 孵育3 0 m i n , P B S 洗3 次( 5 m i n ) ， 加 人荧光保护油， 在荧光显微镜下观察， 每张片分别选 取 1 0个不同视野照相。P C 1 2细胞神经突触重塑性 标记 蛋白鉴 定: I 抗选用突触素和G A P -4 3 , I I 抗选 用F I T C , c y 3 标记的I 薛。 1 . 3 统计学方法 应用M e t a M o r p h / D P 1 0 / B X 4 ; 显微图像分析系 统分析神经突起长度和免疫荧光强度 A ( 吸收度) ， 使用 S P S S 1 0 . 0 统计软件进行组间对照 检验。 2结果
21、 2 . 1 星形 胶质细胞形态学观察及免疫荧光染色鉴 定 培养第 2d见细胞贴壁， 3一 5d逐渐长出突起 并相互交织成网状, 7一 9d即可达 9 0 %融合， 呈铺 路石样外观。免疫荧光G F A P 染色呈强阳性， N S E 染色呈阴性， 星形胶质细胞纯度达9 8 %以上( 图I , 见封3 ) 。 2 . 2 免疫荧光观察 P C 1 2细胞与星形胶质细胞共 同孵育后 P C 1 2 细胞分化成熟度和突触形成数 目 共同孵育前 P C 1 2细胞 N S E免疫荧光染色淡 染， 细胞呈圆 形或多面形， 大部分呈半悬浮状态， 极 少量的细 胞伸出短小突起。共育组: 共同 孵育4 d
22、, 可见绝大 部分P C 1 2 细胞呈N S E强染色阳性， P C 1 2 细胞突起的生长始终处于不断延长的过程， 其形成 突触形状远比对照组复杂， 有突细胞乙 总细胞数百分 比几乎达 9 5 %以上， P C 1 2细胞长突起之间形成突 触数目 明显多于对照组( 图2 ， 见封3 ) ; 而对照组 P C 1 2 细胞始终呈圆形或多角形， 大部分呈悬浮状 态， 贴壁的P C 1 2 细胞突起短小， 形状简单僵直; 两 组的P C 1 2 细 胞有突细胞/ 总细胞数比率、 突起长度 和突 触数目 相比 有明 显差异( P 0 . 0 1 ) ， 两组N S E 免疫荧光强度值A 相比有明显
23、差异， 具有统计学意 义( 表1 ) 。 2 . 3 免疫荧光检测P C 1 2 细胞G A P -4 3 和突触素的 表达 表1 共育4 d 两组P C 1 2 细胞分化及N S E 、 突触素和G A P - 4 3 免疫荧光强度( A ) 比 较任t s ) T a b . 1 D i ff e re n ti a t io n o f P C 1 2 a n d e x p m s s io n s o f N S E, s y n a p t o p h y s in , a n d C A P -43 o f P C 1 2 cel ls 4 d a y s a ft e r c
24、o in o u b a ti o n ( s t a ) 分 组 分化细胞 比例( % ) 突起分 目 ( 个 / 神 经元 ) 突起 长度 ( m m i c e U ) 突触数 日 / 视野 N S E ( A) M A P - 2 ( A ) 共育组 对 照 组 8 9 . 1 4 s : 5 . 6 4 5 . 2 7 :7 . 9 3 . 8 6 z2 . 1 1 . 9 8士 1 . 4 3 2 8 . 2 3 : 3 2 . 2 1 8 7 . 2 3 士 5 4 . 9 1 8 . 9 2.5 . 6 3 . 8 9 t4 . 3 6 3 . 2 1 x 6. 3 1 5 .
25、 6 4. 5. 8 6 8 . 5 6 士 5 . 6 2 1 . 2 1土 4 . 7 突触素( A) 2 6 . 5 8. 4 . 2 1 4 . 0 2士 . 4 C A P -0 3 ( A ) 5 1 . 71 x5 . 6 1 8 . 9 8 x2 . 3 注 : 两组 比较 P 0 . 0 1 第 1 期同荣等 ，星形胶质细胞对 P C- 1 2细胞的分化及突触素和生长相关蛋白4 3 表达的影响 共同 孵育前P C 1 2 细胞的突触素和G A P - 4 3 免 疫荧光染色阴性。共育组 第 4 d可见绝大部分 P C 1 2 细胞呈突触素和G A P 4 3 表达强阳 性，
26、并长出 长突起， 长突起之间形成突触( 图3 、 图5 ， 见封3 ) ; 而对照组始终仅可见少许突触素和 G A P - 4 3淡染 阳 性细胞， 突起短小、 简单、 僵直( 图4 、 图6 ， 见封3 ) ; 两组 P C 1 2 细胞突触素和 G A P - 4 3免疫荧光强度值 相比P0 . 0 1( 表 1 ) 0 3讨论 星形胶质细胞是中枢神经系统内数量众多的一 大类神经细胞群体， 起营养支持的星形胶质细 胞不 但具有分泌功能， 保证神经元的正常发育、 生存和分 化， 而且在神经突触发生; 突触传递的调节和突触可 塑性中发挥极为重要的功能 1 o P C 1 2 细胞来源于 大鼠肾
27、上腺髓质嗜铬细胞瘤， 广泛用于神经系 统疾 病的体外研究。 本实验中， P C 1 2 细胞与原代培养的星形胶质细 胞共同孵育4d后， 绝大部分P C 1 2 细胞出现典型神 经元形态， 有突细胞/ 总细胞数百分比、 突起长度和 突 触数目 明显增多， 绝大部分P C 1 2 细胞 N S E 染色 表达强阳性， 与对照组相比具有明显统计学意义 ( P 0 . 0 1 ) 。 表明星形胶质细胞明显促进 P C 1 2细 胞向典型神经元分化， 与国外报道一致 2 1 。 星形胶 质细 胞促进神经元突触数量的增加并维持其稳 定性 的途径和机制是值得探讨的问题。 目 前已鉴定了 与突触有关的突触蛋白
28、 3 1 ， 其中 突 触素是突触囊泡膜上的特异性蛋白质， 突触素不 存在于 神经干细胞和神经前体细胞中， 突触素调节 神经元突起延伸， 参与突触囊泡的介导转运、 神经递 质的释 放、 突触囊泡循环， 参与突触发生。 G A P - 4 3 是突 触前膜蛋白， G A P - 4 3 不存在于神经干细胞和 神经前体细 胞中， 只 存于已 分化定型并开始轴突和 树突生长的神经元中， 大鼠G A P 4 3 在神经纤维网 中高表达的时期与轴突的延伸生长、 突触形成的起 始密切同步。因此， 突触素和G A P - 4 3不仅可以 作 为突触蛋白分子标记， 也可作为突触重塑的特异标 记蛋白 之一， 即
29、可作为突触的功能标记 - 6 1 本实验发现， 与星形胶质细 胞共育前, P C 1 2 细 胞突触素和G A P - 4 3染色阴性， 共育4d 绝大部分 P C 1 2细胞突触素和 G A P - 4 3染色强阳性， 长突起之 间形成突触， 与对照组相比， 具有明显统计学意义 ( P 0 . 0 1 ) 。 由此可以看到星 形胶质细胞有助于非 神经元细胞向神经 元分化和非神经细 胞表达突触素 和 G A P 4 3 ， 而突触素和 G A P - 4 3是神经元形成神经 突触中 的重要突触标记蛋白， 即是神经突触重塑标 记蛋白 之一， 因 此， 星形 胶质细胞在非神经细 胞神经 突触重塑过
30、程中发挥着重要作用。 综上所述， 研究中枢神经系统难治性疾病( 如 A l z h e im e r 病、 帕金森综合征等) 的细胞移植治疗， 离 不开星形胶质细胞的作用， 探讨移植细胞进人中枢 神经系统脑内微环境中， 与宿主的星 形胶质细 胞相 互作用， 能否分化为典型神经元 ， 重新建立神经突触 网络， 是很重要的问题。我们的实验结果为此提供 了重要的理论依据。 参考文献: I D A S S I A, V E R D E R I O C , P R A V E T T O N I E , e t a l. T h e m le o f 目 h J c e ll s in a y n a
31、p t ic f -ti m I l .P h il . . T r a p s R S o c Le d B io l S r i , 19 9 9 , 3 5 4 ( 1 3 8 1 ) : 4 0 3 - 4 0 9 . 2 U L L I A N E M, S A P P E R S T E I N S K, C H R I S T O P H E R S O N“， e t a l. C o n t ro l o f s y n a p s e n u m b e r场 g li a 1 . S c i e n c e , 2 0 0 1 , 2 9 1 ( 5 5 0 4 ) :6
32、 5 7 - 6 6 1 . 3 H O N E R WG , F A L K A I P , C H E N C , e t a l . S y n a p t ic a n d p l a s ti c 吟- a s s o c ia te d p ro te i n s i n a n t e ri o r fi o n ta l c or t e x i n s e v e re m e n ta l ill n e s s 1 . N e u ro s c ie n c e , - 1 9 9 9 , 9 1 : 1 2 4 5 - 5 5 . 4 D L U G O S C A,
33、P E N T N E Y田. Q u a n ti ta t iv e in u n u n o c y to c h e m is t ry o f G A B A a n d s y m p to p h y s in in th e c e r e b e B a r c o r te x o f o l d e t h e n u l - fe d me 1 . A l.同 C li n E x p R e s , 2 0 0 2 , 2 6 ( 1 1 ) : 1 7 2 8 一 1 7 3 3 . 5 u S , R E I N P R E C H T 1 , F A H R E
34、 S T O C K”，e t a l . A c t iv i ty - d e p e n d e n t c h a n g e s in s y mp t o p h y s in im n m n o re a c tiv ity in h ip p o rr im - p u s , p i r ifp m c o rt e x , a n d e n to r h in a l c a t e r o f t h e r a t 1 . N e u ro - s c i e n c e , 2 0 0 2 , 1 1 5 ( 4 ) : 1 2 2 1 一 1 2 2 9 . 6 B E R G M A N N M , P O S T A , R ITTE L , e t a l . E x p r e s s io n o f e y n a p t , p h y s in i n s p ro u t in g n e u ra u a ft e r e n t o r h i n a l l e s i o n in th e r a t J . E 冲B r a in R e s , 1 9 9 7 , 1 1 7 ( 1 ) ;8 0 一 8 6 . 收稿日期2 0 0 5 - 0 7 一 1 3