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1、 4 8中华显微外科杂志2 0 0 6 年2 月第2 9 卷第1 期C h i n J M i c r o s u r g , F e b r u a ry, 2 0 0 6 , V o l 2 9 , N o . 1 实 验 论 著 皮瓣缺血训练后碱性成纤维细胞生长因子及微血管密度的变化 鲁晓波 都建伟王兆强 【 摘要】 目的观察碱性成纤维细胞生长因子( b F G F ) 表达增强对缺血训练后皮瓣微血管密度的影响。方法 采用大耳白兔背部皮瓣模型， 应用皮瓣训练器对蒂部施压， 进行缺血训练， 工作压力为4 k P a ( 1 k P a = 7 . 5 m m H g ) ， 每日 6 次，
2、 每次1 5 m i n ， 间隔1 h 。 并以 免疫组织化学染色方法检测b F G F 及C D 3 4 的变化。 结果 在3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 d 时相断 蒂， 训练皮瓣存活面积明显大于对照皮瓣; 免疫组织化学染色显示b F G F 及C D s 4 表达增强。 结论 短时缺血训练后， b F G F 及C D 3 4 表达增强， 增加了微血管密度， 加速血供重建， 提高皮瓣存活面积， 有利于早期断蒂。 【 关键词】 碱性成纤维细胞生长因子;微血管密度;皮瓣;移植;显微外科 皮瓣移植后坏死以及如何缩短断蒂时间是尚未解决的问 题。许多学者探索了多种方法， 效果仍不十分
3、理想。用物理方 法对皮瓣进行有规则的主动训练， 或可提高皮瓣存活率， 从而 缩短断蒂时间， 为此我们设计了本实验， 应用皮瓣训练器对皮 瓣进行反复短时缺血训练， 探讨其对皮瓣成活率及断蒂时间的 影响以及皮瓣组织碱性成纤维细胞生长因子( b a s i c f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r , b F G F ) 和微血管密度 ( m ic r o v a s c u l a r d e n s i t y , M V D ) 的变化。 材料和方法 一、 材料 选4 月龄， 体重2 . 0 - 2 . 5 k g 的大耳白兔7 2 只， 为二
4、级实 验动物， 购自 沪州医学院实验动物科。训练仪器采用自 行设计 的皮瓣训练器( 专利号 C L 9 8 2 2 8 5 5 3 2 ) 。主要试剂有羊抗兔 C D , 多克隆抗体、 羊抗兔V E G F 多克隆抗体、 免疫组化S - P 试剂 盒。 二、 实验动物分组及皮瓣模型建立 1 . 实验动物分组: 随机选8 只兔为空白组( C 组) ， 其余6 4 只兔为实验组， 分笼喂养， 自由进食、 饮水， 室温( 2 5 士 2 ) E o 2 . 动物模型建立: 在各兔背部斜方肌区域， 设计两侧对称， 蒂在上端的皮瓣区， 大小约4 c m x 3 c m 。空白组标记后不作处 理。观察组以
5、3 %戊巴比妥钠( 3 0 m g / k g ) 耳缘静脉注人麻醉， 麻醉后固定于实验台， 按术前设计区域进行皮肤消毒， 沿皮瓣 设计线切开皮肤、 皮下组织， 掀起皮瓣， 只留上端血管蒂与皮瓣 相连， 掀起的皮瓣缝合成皮管， 远端原位缝合。 三、 训练 皮瓣建立后， 兔背两侧皮瓣随机选一侧为训练皮瓣( A 组) ， 另一侧为对照皮瓣( B 组) ， 术后每日 肌注头饱哇琳钠。术 后即对A组皮瓣蒂部用训练器进行缺血训练， 每次 巧 m i n ， 间 隔1 h ， 每日 训练6次， 训练器工作压力设定为4 k P a ( 1 k P a = 7 . 5 m m H g ) 。 四、 术后观察及
6、标本的采集 1 。 一般观察: 观察白兔的生活行为及皮瓣颜色、 皮温、 有无 肿胀等。 基金项目: 四川省教育厅重点资助项目 作者单位: 6 4 6 0 0 0 四川省沪州市， 沪州医学院附属医院骨关节科 2 . 断蒂: 术后第1 天起观察组每天随机选8 只白 兔进行断 蒂。 3 . 存活面积的检测计算: 于断蒂后测出各皮瓣的坏死率及 存活面积。用硫酸纸精确描绘坏死和存活区域， 计算机分析皮 瓣存活面积。 4 . 组织的采取: 断蒂时分别在皮瓣远端取少量组织， 以 4 %多聚甲醛固定， 同时在C 组每天取 1 只白兔双侧相应部位 组织予以固定， 行石蜡包埋切片， 免疫组织化学染色( S - P
7、 法) ， 检测b F G F 及C D。 五、 结果判断 b F G F表达按染色强度和细胞内出现棕黄颗粒的阳性细胞 百分数两方面综合评分。 染色强度( a ) : 无色为0 分， 淡黄色为 1 分， 黄色为2 分， 棕黄色为3 分。阳性细胞数( b ) : 阳性细胞 - 5 %为0 分， 6 %一 2 5 %为 1 分， 2 6 % 一 5 0 %为2 分， 5 1 %以上 为3 分。将a , b 积分相加， a 加 b 得分为0 一 1 ， 则阳性系数为 O , a 加b 为2 ， 则阳性系数为1 , a 加b 为3 ， 则阳 性系数为2 , a 加 b 为4 - 5 则阳性系数为3 ,
8、 a 加 b 为6 ， 则阳性系数为4 。微血 管 计 数 参 照 文 献 I ， 观 察C D , 染色的 切 片， 任 何 被 抗 体 染色的 单个细胞或细胞团， 不管有没有形成管腔， 只要它与周围的微 血管或其它连接组织成分清楚分离， 都认为是一个可计数的微 血管。低倍镜下( 4 0倍) 选取高血管密度区， 高倍镜下( 2 0 0 倍) 计数5 个视野中微血管数， 取其平均值作为该侧的 M V D 值。 六、 统计学分析: 数据应用S P S S 1 0 . 0 统计软件处理。 结果 一、 大体观察 白兔全部成活， 无 1 例感染、 死亡， 生活行为无明显变化。 术后各组皮瓣的颜色、 质
9、地无明显差别， 无肿胀、 发黑、 变硬现 象。 术后1 , 2 d 时相断蒂， 皮瓣全部发黑、 变硬; 3 d 时相断蒂， 训练皮瓣大部分成活， 1 d 后逐渐发黑、 变硬， 而对照组皮瓣 1 d 后全部发黑、 变硬; 4 d 时相断蒂， 训练皮瓣大约一半始终成活， 另一半逐渐发黑、 变硬， 对照皮瓣大部分逐渐发黑、 变硬; 5 d 时 相断蒂， 训练皮瓣约3 / 4 成活， 而对照皮瓣大部分发黑、 变硬; 6 d 时相断蒂， 训练皮瓣大部分成活， 对照皮瓣约1 / 3 成活; 7 d 时 相断蒂， 训练皮瓣基本全部成活， 对照皮瓣约2 / 3 成活; 8 d 时 中华显微外科杂志2 0 0
10、6 年2 月第2 9 卷第1 期C h i n J M i c r o s u r g F e b r u 2 0 0 6. V o l 2 9. N o . 1 4 9 相断蒂， 训练皮瓣全部成活， 对照皮瓣大部分成活。在3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 d 时相断蒂， 训练皮瓣蒂部创面渗血较对照皮瓣鲜红。 二、 免疫组化检测皮瓣b F G F 表达( 表 1 ) 。 表1皮瓣b - F G F 表达情况 A组 1 . 9 0士0 . 7 2 2 . 7 0 10 . 9 1 3 . 4 3士0 . 7 6 3 . 1 4士1 . 1 5 2 . 5 8 t 1 . 1 6 2 .
11、 0 0 1 0 . 8 5 1 . 6 3土0 . 9 6 B组 四、 皮瓣b F G F 与微血管密度的相关性分析 以上实验数据表明， 训练组皮瓣M V D与b F G F 之间呈显著 正相关， 相关系数: = 0 . 7 2 3 , P 0 . 0 5 ) 。训练皮瓣与对照皮瓣于术后第1 天M V D开始增加， 于 术后2 d 开始， 训练皮瓣 M V D与对照皮瓣 M V D及正常皮肤 M V D相比， 增加明显， 差异有统计学意义( P 0 . 0 5或 P 0 . 0 1 ) 。其中训练皮瓣3 , 4 d 组之间及4 , 5 d 组之间差异有统 计学意义( P 0 . 0 5 )
12、， 对照皮瓣3 , 4 d 组之间及5 , 6 d 组之间差 异 有统计学意义( P 0 . 0 5 ) 。 从动态曲线可见训练皮瓣 M V D于术后开始增加， 于3 , 4 , 5 , 6 d 增加迅速， 于第6 天达高峰， 之后几天维持在一定水平， 对照皮瓣M V D 增加相对缓慢， 于第7 天达到高峰( 表2 ) 0 表2皮瓣 M V D表达( x 1 s ) A组组别 1 天 2天 3天 4天 5天 6天 7天 8天 B组C组 1 7 . 4 0士1 . 9 5 . 1 3士2 . 1 7 +2 . 1 0 * 禅 钾 翻 禅 *盛 2 0 “ # * * A 1 8 . 1 0 .
13、1 5 . 8 0土1 . 7 6 1 6 . 5 0士 2 . 3 8 “ 1 7 . 1 3土1 . 4 6 0 2 2 . 3 8士 2 . 2 0 * * A 2 4 . 3 8士2 . 3 9 “ 3 0 . 2 5士1 . 9 8 * * A 3 4 . 6 5土 2 . 0 1 3 4 . 0 5士 2 . 0 1 1 4 . 6 0土1 . 9 8 1 3 . 8 8士2 . 1 7 1 4 . 2 5土1 . 7 1 1 4 . 5 0土1 . 9 1 1 4 . 5 0士2 . 3 8 1 5 . 以)土2 . 4 5 1 5 . 3 0 t 2 . 3 8 1 4 . 0
14、 5士2 . 2 1 oo2l 内、22， 十-士士十-+- 881332500143 19223139403938 A组与 B组比较 P 0 . 0 5 , “ P 0 . 0 1 ; A , B组与 C组比较 0 P 0 . 0 5 , P 0 * 0 . 0 1 ; A , B 组间比 较 P 0 . 0 5 b F G F 广泛存在于细胞外间质中， 最初因发现能促进成纤 维细胞的有丝分裂而命名， 之后发现它具有广泛的生物活性， 能促进多种细胞增殖， 尤其能促进内皮细胞分裂， 这种作用可 能通过上调V E G F ( 血管内 皮生长因子) 表达， 诱导其分泌某些 蛋白 酸， 溶 解并 侵
15、 人周围 基 质， 进而 形成毛 细血 管 “ 。 这种 促 血管生成作用有可能使皮瓣在移植后较早期与受体建立血管 网。在细胞周期转换中促进G 。 期( 休止期) 细胞迅速进人s 期 ( 增殖期) ， 实现其靶细胞迅速增殖分化， 新生血管生成。 近年来， 有许多学者将外源性b F G F 应用于提高皮瓣存活 面 积 5 ) 。 王 绪 凯 等 在 兔预 构 皮瓣 血 管 化 及成活的 研 究中 发 现， b F G F 能有效降低皮瓣坏死率， 且利于早期断蒂皮瓣的存 活， 可能与其促进新生血管的 形 成有关。 郑少萍等5 1 在兔腹壁 下浅动脉岛状皮瓣在联合应用b F G F 和硫糖铝发现，
16、两者合用 能促进皮瓣血管新生和血流灌注， 加速血液循环建立， 提高皮 瓣 成活 率。 但 也有相反的 结论。 I s h i g u r o 等 6 认为b F G F 剂量 的增加并不导致坏死率的降低， 可能的解释是内皮细胞在增殖 初期需要一定浓度的b F G F的激发， 一旦激发以后， 就不一定再 需要这种有效浓度的维持。H o m等认为 b F G F能够促进早期 断蒂。 但所有结果都是在应用外源性b F G F 时观察到的， 而内 源性b F G F 表达增强的激发以及作用变化规律尚未见报道。 有学者在研究保湿敷料的作用时发现， 潮湿环境可以促进 包括b F G F 在内的多种生长因子
17、释放， 而且认为氧张力下降或 者缺氧是b F G F 表达增强的有力诱导因素， 一旦缺氧解除b F G F 表达即 开始下调 7 7 。 我们在实验中 发现， 移植后， 训练皮瓣与 对照皮瓣即呈阳性表达， 与正常皮肤组织对比， 差异有统计学 意义( P 0 . 0 1 ) ， 训练皮瓣与对照皮瓣相比， 差异有统计学意义 ( P 0 . 0 5 ) ， 且训练皮瓣b F G F 表达的峰值时间点在第3 天， 之 后迅速下降， 对照皮瓣b F G F 表达上调相对缓慢， 峰值时间在第 3 天， 之后缓慢下降。结果表明， 相对的缺血缺氧是引起b F G F 表达上调的主导因素， 皮瓣的氧张力与周围皮
18、肤组织相比， 一 定限度内的氧梯度增大可更显著地上调b F G F 表达， 氧梯度减 小将下调b F G F 表达。这些结果与莱登等人的观点一致。C o l - l i n - O s d o b y 等 认为b F G F 是 血管 生 成的 较为 直 接的 诱导 物， 能促 进内皮细胞再生， 促进血管内皮细胞分裂， 诱导其从基膜中分 离出来， 形成管状结构。 F u 等 s 在鼠骨骼肌上发现缺血再灌注导致内源性b F G F 减少， 从而导致组织损伤加重和修复的延迟。而M i g n a t t i 等发 现b F G F 能明显促进多种细胞的有丝分裂， 促进创伤修复， 局部 及早应用b
19、F G F 可减轻组织损伤， 提高修复的速度和质量。 目 前通过免疫组化染色方法表示 M V D的指标较多， 而 C D 3 , 是表 示M V D 较 好且 普 遍应 用的 指 标。 血 管内 皮细胞 胞浆 出现棕黄色颗粒， 即表示C D , , 阳性。 本实验发现， 皮瓣制成后， 5 0 C D 34 表达即开始上调， 较正常皮肤组织内C D 34 增加明显( P 0 . 0 5 ) ， 同时， 训练皮瓣较对照皮瓣增加更明显( P 0 . 0 5 ) ， 而且 峰值提前， 之后一段时间均维持在一定水平， 这表明相对的缺 血缺氧是引起C D 3 4 表达增强的有力因素， 而且在一定限度内，
20、相对缺血缺氧的程度与C D 3 4 表达呈正相关关系。 为探讨b F G F 与M V D的关系对相关数据进行直线相关分 析， b F G F 与M V D之间呈显著正相关( P 0 . 0 5 ) ， 表明b F G F 表 达的强弱对皮瓣M V D有明显的影响， 这也提示， 在血管形成的 调控中， b F G F 起关键作用。 b F G F 是血管生成的较为直接的诱 导物， 能促进内皮细胞再生， 促生血管内皮细胞分裂， 诱导其从 基膜中分离出来， 形成管状结构。 其具体机制有待于进一步探 讨。 参考文献 唐孝明， 裴福兴， 谭健三. 碱性成纤维细胞生长因子促神经8 再生的 实验研究. 中
21、 华显微外科杂志， 1 9 9 8 , 2 1 : 2 0 1 一 2 0 4 . 池雷霆， 裴福兴， 丁兰， 等. 应用逆转录一 聚合酶链反应检测 碱性纤维细胞生长因子基因表达的研究 .中华显微外科杂 志， 2 0 0 0 , 2 3 : 6 1 一 6 2 . 杨家群， 郑晓明， 洪光祥， 等. 碱性成纤维细胞生长因子促 进外周神经清创吻合后功能恢复的实验研究中华显微外 科杂志， 2 0 0 2 , 2 5 : 5 3 一 5 4 . 王绪凯， 严冬， 刘永权碱性成纤维细胞生长因子对预构皮 瓣血管化及皮瓣成活的影响.中华显微外科杂志， 2 0 0 3 , 2 6 : 2 2 1一 2 2
22、2 . 郑少萍， 郭树忠. B F G F 和硫糖铝联合局部应用对皮瓣断蒂 时间的 影响. 中 华整形外科杂志， 2 0 0 3 , 1 9 : 7 1 一 7 2 . I s h i g u r o N , Y a b e Y , S h i m i z u T , e t a l . B a s i c f i b r o b l a s t g r o u t h f a c t o r h a s a b e n e f i c i a l e f f e c t o n t h e v i a k i l i t y o f r a n d o m s k i n fl a p s
23、i n r a t s . A m P l a s t S r u g , 1 9 9 4 , 3 2 : 3 5 6一 3 6 2 . U h l E U , B a r e r J H , B o n d a r I , e t a l . I m p r o v e m e n t o f s k i n fl a p p e r f u s i o n s u b d e r m e d i n j e c t i o n o f r e c o m b i n a n t h u m a n b a s i c f i - b r o b l a s t g r o w t h f
24、a c t o r . A m P l a s t S u r g , 1 1 9 4 -, 3 2 : 3 6 1 一 3 6 6 . F u X B , C u e v a s P , G i n e n e s G a l l i e g o G , e t a l . I s c h e m i a a n d r e p e r f u s i o n r e d u c e t h e e n d o g e n o u s b a s i c f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r i n r a t a k e l e t a l
25、 m u s c l e s . C h i n M e d J , 1 9 9 5 ， 1 0 8 : 6 9 9一 7 0 5 . ( 收稿日 期: 2 0 0 5 一 0 9 一 2 4 ) T 细胞疫苗诱导大鼠同种异体肢体移植免疫耐受的实验研究 王鱿鹏张信英石作为 【 摘要】 目的 探讨T 细胞疫苗( T C V ) 诱导大鼠同种异体肢体移植特异性免疫耐受的作用。 方法 制备受者 L e w i s 大鼠针对供者 D A大鼠的T C V ， 应用T C V ， 免疫正常L e w i s 大鼠共3 次， 每周 1 次。设T C V组和T C V未接种组， 在 接种前及接种后5 d 进行
26、混合淋巴细胞培养( M L R ) ; 设T C V组、 C s A组和空白 对照组， 于接种后7 d 进行D A大鼠 针对 L e w i s 大鼠的同种异体肢体移植， 在术后7 d 进行淋巴细胞毒检测， 术后2 1 d 进行嵌合分析。结果M L R显示， L e w i s 大鼠的脾细胞反应程度接种组显著低于未接种组( P 0 . 0 1 ) ; 微量细胞毒测定显示， 死亡细胞百分率在 T C V组、 C s A 组、 空白 对照组3 组比 较性差异有统计学意义( P 0 . 0 1 ) ; 嵌合分析显示经处理的L e w i s 大鼠脾脏， 胸腺中检测出了D A 大鼠源性的骨髓嵌合体。
27、结论T 细胞疫苗可以抑制受者对供者的免疫应答; 作为骨髓移植前预处理手段， T 细胞疫 苗接种后行吻合血管的骨髓移植成功地诱导出同种异体肢体移植嵌合耐受。 【 关键词】 T 细胞;疫苗;移植;免疫耐受 在受者体内诱导嵌合状态来延长移植物存活是目前诱导 移 植 耐 受的 重 要策略 之一川。 用骨髓移 植来诱导 嵌合状态能 够 可 靠 地 得 到 对 器 官和 细 胞移 植供体的 特 异 性耐 受川。 本 实 验研究T 细胞疫苗( T C V ) 接种后行吻合血管的骨髓移植( V B - M T ) 来诱导大鼠同种异体肢体移植免疫耐受的作用。 材料与方法 一、 材料与试剂 健康雄性D A大鼠(
28、R T 1 a ， 哈尔滨医科大学附属第二医院 实验动物中 心) 和L e w i s 大鼠( R T l ， 北京大学医学部实验动物 部) ， 重量2 0 0 一 2 5 0 g 。试剂主要有: 刀豆素A ( C o n A ) , R P - 作者单位: 1 5 0 0 0 1 哈尔滨市， 哈尔滨医科大学第一临床医学院骨 科 M I 1 6 4 0 培养液， 环抱素A ( C s A ) ， 胎牛血清， 丝裂霉素 C , F I T C - 抗R T l “ 单抗。 二、 T C V的制备 取D A大鼠的脾细胞剪碎制成匀浆， 低渗法去除红细胞 后， 用丝裂霉素C ( 2 5 L g / m
29、 l ) 于3 7 水浴处理4 5 m i n ， 洗涤3 次， 最后用R P M 1 1 6 4 0 培养液调整细胞浓度至1 x 1 0 8 个 / M I . 取上述制备好的D A大鼠脾脏T 细胞免疫8 只L e w i s 大鼠 ( 腹腔注射， 0 . 2 m l/ 只， 每周 1 次， 连续3 周) 于末次免疫后的 第7 天， 取被免疫的L e w i s 大鼠的脾细胞， 用1 %自 家血清加完 全 培 养 液 调 整 细 胞 数 至2 x 1 0 6 钾m l ， 加C o n A 2 . 5 L g / m l 混 匀 后移至 1 0 0 m l 的培养瓶内( 1 0 m l/ 瓶) 。置5 % C O Z , 3 7 C 孵箱 中培养4 8 h 后收集细胞， 然后加人丝裂霉素C ( 2 5 V g / m l ) 处理 ( 3 7 - C ， 水浴4 5 m i n ) 灭活细胞。用p H为7 . 2 的P B S 洗涤3 次