GBT 20196-2006.pdf

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1、I C S 6 5 . 1 2 0 B 2 0 遏日 中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 G B / T 2 0 1 9 6 -2 0 0 6 饲 料 中 盐 霉 素 的 测 定 D e t e r mi n a t i o n o f s a l i n o m y c i n i n f e e d s 2 0 0 6 - 0 2 - 2 4 发布 2 0 0 6 - 0 7 - 0 1 实施 中 华人民 共和国 国 家质量 监督 检验 检疫总局 中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会 发布 G B/ T 2 0 1 9 6 - 2 0 0 6 月U吕 本标准在查阅国内外文

2、献基础上， 提出饲料中盐霉素测定的两种方法。 第一法为微生物检验法 ( 仲裁法) ， 微 生物检验方法 主要参考 了我 国原进 出口商 品检验局 S N 0 6 7 3 -1 9 9 7 出口肉及肉制品中盐霉素残留量检验方法滤纸片法 和日本厚生省 1 9 9 。年编写的 畜、 水产食品中的残留物质检验方法 中盐霉素残留量检测方法制定的。其方法原理、 微生物检定操作 步骤基本相同， 方法的范围、 称样量、 试样提取条件进行了改进， 改进技术内容如下: 一 将提取液由甲醇， 四氯化碳分离提取改为用甲醇和水直接提取; 一 由先过硅胶柱再过氧化铝层析柱净化改为直接用氧化铝层析柱净化。 第二法为高效液相

3、色谱柱前衍生化法， 参考 J o u r n a l o f C h r o ma t o g r a p h y A) 1 9 9 9 报导 高效液相色 谱柱前衍生化法测定动物饲料中拉沙里霉素、 莫能霉素、 盐霉素、 甲基盐霉素 制定其方法原理、 基本 操作步骤相同， 方法的范围、 试样称样量根据试验进行了改进， 改进技术内容如下: 一 本标准范围适用于配合饲料、 浓缩饲料、 预混合饲料、 盐霉素预混剂， 较文献扩大; 本标准称样量、 盐霉素提取液稀释度见附录 A 以上两种方法均增加了“ 重复性” 。 本标准的附录 B 、 附录 C为规范性附录， 附录A为资料性附录。 本标准由全国饲料标准化

4、技术委员会提出并归口。 本标准起草单位: 国家饲料质量监督检验中心( 武汉) 本标准起草人: 刘小敏、 张勇、 高利红、 何一帆。 GB / T 2 0 1 9 6 -2 0 0 6 饲 料 中 盐 霉 素 的 测 定 范围 本标准规定了饲料中盐霉素的微生物检验方法和高效液相色谱仪柱前衍生化检验方法。 本标准两种方法均适用于配合饲料、 浓缩饲料、 添加剂预混合饲料中盐霉素的测定。最低检出限为 1 . 2 5 mg / k g 。其微生物检验方法为仲裁法。本标准高效液相色谱柱前衍生化法也适用于盐霉素预混 剂中盐霉素的测定。 注1 : 1 0 0 0盐霉素单位( U) 相当干1 mg的盐霉素 qz

5、 H, , O ) 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件， 其随后所有 的修改单4 . 0 0 X1 0 m g / k g时， 不超过算术平均值的1 0 %0 4 方法2 : 高效液相色谱仪柱前衍生化检验方法 4 . 1 原 理 用甲醇提取试样中盐霉素， 以2 , 4 一 二硝基苯麟( D N P ) 为衍生剂， 应用高效液相色谱柱前衍生化法、 采用紫外检测器对饲料中的盐霉素进行测定。 4 . 2 试荆和材料 除非另有说明， 仅使用分析纯试剂。 4 . 2 . 1 水 GB/ T 6 6 8 2， 一级 。 4 . 2 . 2 三氮乙酸溶

6、液 c =5 0 0 g / L 4 , 2 . 3 甲醇 色谱纯 。 4 . 2 . 4 衍生化试液 。 一。 . 5 m g / m L : 称取 5 0 m g 2 , 4 一 二硝基苯腆置于1 0 0 m l 一 容量瓶中， 用甲醇充分溶解后稀释至 刻度 。 4 . 2 . 5 提 取液 用甲醇与水( 9 0 +1 0 , V +V) 配制而成。 4 . 2 . 6 盐霉素标准溶液 4 . 2 . 6 . 1 盐霉素标准贮备溶液 精确称取盐霉素钠标准品( 含量 9 4 . 1 %) 0 . 1 0 6 3 g ， 置于 1 0 0 m L容量瓶中， 用甲醇溶解， 稀释至刻 度， 摇匀，

7、 其浓度为1 0 0 0 p g / mL ， 置于 0 冰箱中， 有效期二周。 4 . 2 . 6 . 2 盐霉素标准工作溶液 分别准确移取 1 . 0 0 ml , , 1 0 . 0 0 m L标准贮备液( 4 . 2 . 6 . 1 ) 于 1 0 0 m L容量瓶中， 用甲醇稀释至刻 度， 摇匀， 其浓度分别为1 0 . 0 g / m L , 1 0 0 . 0 W g / m l ， 现配现用。 4 . 2 . 7流 动相 将 1 . 5 mL冰乙酸( 优级纯) 加人 9 8 . 5 mL水中， 并按 1 0: 9 0的比例和甲醇混合。用前超声或做其 他脱气处理。 4 . 3仪器

8、与设 备 4 . 3 . 1 实验室常用玻璃器皿 4 . 3 . 2 振荡器， 往复式。 4 . 3 . 3 旋转真空蒸发器。 4 . 3 . 4 离心机 不低于7 0 0 0 g ( 9 0 0 0 r / m i n ) 4 . 3 . 5 微型混合器 4 . 3 . 6 可调微量移液器， 1 0 , L -5 0 V I -1 0 0 p .L - 2 0 0 tA, , 2 0 0 t 1 一1 0 0 0 K l 。 注 3 : 可调微量移液器需经过校准 4 . 3 . 7 高效液相色谱仪: 配有四联泵、 柱温箱、 紫外( UV) 或二极管阵列检测器， OD S C , 。 色谱柱(

9、 如粒 度 4 p m， 长 1 5 0 m m， 内径 3 . 9 mm ) , 4 . 4 试样的制备 按 G B / T 1 4 6 9 9 . 1 饲料采样方法采样， 选取饲料样品至少 5 0 0 g ， 四分法缩减至少1 0 0 g ， 磨碎， 通过 0 . 2 8 p m孔筛， 混匀， 装人密闭容器中， 避光低温保存备用。 GB / T 2 0 1 9 6 -2 0 0 6 4 . 5 分析步骤 4 . 5 . 1 试液提取 4 . 5 . 1 . 1 称取一定量试样( 参见附录 A) ， 精确至 。 . 0 0 0 1 g ， 于 2 5 0 mL具塞三角瓶中， 准确加人 1 0

10、 0 . 0 mL样品提取液( 4 . 2 . 5 ) ， 在往复振荡器上振荡 1h ， 静置片刻， 取上清液 1 0 m L于离心管中， 以 1 0 0 0 g ( 3 5 0 0 r / mi n ) 离心 1 0 m i n . 4 . 5 . 1 . 2 如需将试液浓缩， 根据提取液( 4 . 5 . 1 . 1 ) 中盐霉素预计浓度( 依据标示量、 称样量和提取液量 确定分取量， 参见附录 A) 吸取一定量提取液( 4 . 5 . 1 . 1 ) 置于旋转蒸发器中， 减压至干， 再加人7 0 0月 样 品提取液( 4 . 2 . 5 ) ， 使试液中盐霉素含量为2 0 1, g /

11、m L -1 0 0 1, g / m L . 4 . 5 . 2 试液衍生化 用可调微量移液器( 4 . 3 . 6 ) 准确吸取7 0 0 1, L上清液于具螺口的离心管中， 准确加人 1 0 0 1, L三氯乙 酸水溶液( 4 . 2 . 2 ) ， 盖紧后， 在微型混合器上混旋 2 0 s ， 室温放置 1 0 m i n ， 再准确加人 2 0 0 1, L二硝基苯麟 衍生化试液( 4 . 2 . 4 ) 盖紧， 同样混旋 2 0 s 后， 置于 5 5 水浴锅中反应 3 0 mi n后， 取出， 待冷却后进行 检测 。 如发现衍生化液混浊， 需 7 0 0 0 g ( 9 0 0

12、0 r / mi n ) 离心后， 取上清液上机测定。 4 . 5 . 3 标液衍生化 用可调微量移液器( 4 . 3 . 6 ) 准确吸 取1 0 p L , 2 0 1, 1 . , 5 0 p L , 1 0 0 1, l2 0 0 1, 1 _ , 3 0 0 p L , 5 0 0 1, L 盐霉素 标准工作液( 4 . 2 . 6 . 2 ) 于具螺口的离心管中， 用甲醇稀释至 7 0 0川 ， 另设 1个空白管加 7 0 0 1, L甲醇作 对照， 按 4 . 5 . 2衍生化方法衍生。 4 . 5 . 4测定 4 . 5 . 4 . 1 高效液相色谱仪( H P L C ) 测

13、定参数的设定 色谱柱: O D S C,， 柱， 粒度4 1, m ， 长1 5 0 m m， 内径3 . 9 m m或性能类似的分析柱。 柱温: 3 0 0C。 流动相: 同4 . 2 . 7 ， 流速1 . 0 m l 丫 m m 检测器: 紫外( UV) 或二极管阵列检测器。 检测波长: 3 9 2 n m. 进样量: 1 0川一 2 0 k L 4 . 5 . 4 . 2 定性、 定量测定 取适量的 4 . 5 . 2 获得的衍生化试液和相应浓度的4 . 5 . 3 衍生化标准工作液进行测定。以保留时间 和衍生液紫外光区特征光谱定性以色谱峰面积积分值做单点或多点校准定量。 4 . 6

14、结果计算 4 . 6 . 1 饲料 中盐霉 素含量按式( 3 ) 计 算 尸. 火V又c又V， ， 只n PXmxV, XV, 式中: 。 试样中盐霉素的 含量， 单 位为毫克每 千克( m g / k g ) ; c 标准工作液衍生化液中( 4 . 5 . 3 ) 中盐霉素浓度， 单位为毫克每千克( mg / k g ) ; 尸 - 一 标准工作液衍生液峰面积值; Vt 标准工作液衍生液进样体积， 单位为微升( 川 ) ; P试样衍生液峰面积值; V ;试样衍生液进样体积， 单位为微升( P I ) ; V 试样体积， 单位为毫升( mL ) ; V, 参与衍生的试液体积( 4 . 5 .

15、2 ) ， 单位为毫升( m L ) ; n -稀释或浓缩倍数; 。 称取试样的质量， 单位为克( g ) . ( 3 ) G B/ T 2 0 1 9 6 -2 0 0 6 4 . 6 . 2 平行测定结果用算术平均值表示， 保留3 位有效数字。 4 . 7 重复性 在重复性条件下获得的两次独立测试结果的测定值的绝对差值: 盐霉素的含量4 . 0 0 X 1 0 m g / k g时， 不超过算术平均值的 1 0 %0 GB / T 2 0 1 9 6 -2 0 0 6 附录A ( 资料性附录) 试样 的称样t 给出饲料样品标示量、 称样量及盐霉素提取液稀释度示例。见表 A . 1 、 表

16、A . 2 . 表 A . 1 饲料样品标示f、 称样f及盐霉素提取液稀释度( 微生物检验方法) 饲 料 类 别 盐霉素标示量/ ( 1, g / k g ) 称样量 功 / ， g 提取液量V/ - L 提 取 液 量 中 盐 霉 素 浓 度 c / ( p g / mL 提 取 液 稀 释 或 浓 缩 倍 数 n 检 测 预 计 浓 度 / ( p g / mL 预混合饲料 7 0 00 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 21 0 0 1 4 0 6 0 1 0 5 1 4 . 0 1 2 . 0 浓 缩 饲 料 3 5 0 0 0 0 1 5 0 0 0 0 51 0 0 1 7

17、. 5 7 . 5 1 1 7 . 5 7 . 5 配 合 饲 料 7 0 0 0 0 3 0 0 0 0 1 01 0 0 7 3 0 .5 1 4 6 表 A . 2 饲料样品标示f、 称样f及盐扭素提取液稀释度( HP L C ) 饲料类别 盐霉素标示量/ C p g / k g ) 称 样 量 ，/ g 提取液量 V / mL 提 取 液 量 中 盐 霉 素 浓 度 c / ( p g / ml ) 提 取 液 稀 释 或 浓 缩 倍 数 力 注 人 HP L C预 计 浓 度 / ( p g / mL ) 盐霉素预混剂 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 2 0 0 0 0 0

18、0 0 1 . 0 0 . 8 1 0 0 . 0 1 0 0 0 . o 9 6 0 . 0 1 0. 0 1 0 . 0 7 0 . 0 4 2 . 0 预 混 合 饲 料 7 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 2 . 0 4 . 0 1 0 0 . 0 1 4 0 . 0 1 2 0. 0 1 . 0 1 . 0 9 8 . 0 8 4 . 0 浓 缩 饲 料 3 5 0 0 0 0 I S O 0 0 0 2 0 . 0 2 0 . 0 1 0 0 . 0 一 一 4 9 . 0 2 1 . 0 配 合 饲 料 7 0 0 0 0 3 0 0 0 0 2 0 . 0

19、2 0 . 0 1 0 0 . 0 1 4 . 0 6 . 0 0 . 5 0 . 2 1 9 . 6 2 1 . 0 GB / T 2 0 1 9 6 -2 0 0 6 附录B ( 规范性 附录) 培 养基和试 剂制备 B . 1 培养基 I B . 1 . 1 成分 蛋白脏 牛肉浸膏 氯化 钠 酵母浸膏 琼脂 水 B . 1 . 2制 法 将上述各成分于水中加热溶解， 调节 斜面备用 5 . 0 g 1 . 0 g 5 . 0 g 2 . 0 g 1 5 . 0 g 1 0 0 0 m 1 p H值 7 . 4 士。 . 1 ， 分装于试管中， 于1 2 1 灭菌 1 5 m i n 。制

20、成 B . 2 培养基 II B， 2 . 1 成分 胰蛋白陈 葡 萄糖 酵母浸膏 琼脂 水 B . 2 . 2制法 将上述各成分于水中加热溶解， 调节 5 . 0 g 1 . 09 2 . 5 g 1 5 . 0 g 1 0 0 0 m1 p H值 7 . 。 士。 . 1 ， 分装于锥形瓶中， 于 1 2 1 灭菌 1 5 mi n B . 3生理盐水 称取 8 . 5 g氯化钠， 溶于 1L水中， 于 1 2 1 高压灭菌 1 5 mi n . GB / T 2 0 1 9 6 -2 0 0 6 附录C ( 规范性 附录) 微生物检验方法确证试验 C. 1原 理 确证试验采用生物自 显影

21、法， 用标准品作对照， 求R , 值， 以确证样液中存在的抑菌物是否确实是 盐霉素 。 C . 2生物 自显影法条件 C . 2 . 1 薄层板 硅胶 Q / Y T 2 5 7 -8 5 S G, 5 c mX2 0 c m 使用前于 1 1 0 0C活化 2h C . 2 . 2 点样f 2 0 K L ， 点状。 C. 2 . 3展开 在饱和槽内进行。 C . 2 . 4 检测 将每个样液及标准溶液分别点在四块薄层板上; 先于每块薄层板下端 2 c m处划一条基线; 然后在 这条基线上分别点 2 0 t L 样液和2 . 。I, g / m工盐霉素标准溶液， 试液和标准溶液点相距 2 .

22、 5 c m。在展开 缸中用甲醇进行展开， 直至溶剂前沿线距板顶端 1 . 5 c m处为止， 取出薄层板， 风干后备培养用。 将薄层板水平置于高压灭菌的长方形培养皿中， 在无菌条件下将已熔化并冷却至5 0 0C 5 5 的生 物自显影用培养基II均匀地喷在其表面上， 然后用 1 0 ml , 上述接种芽抱菌悬液的培养基 II 铺满整个薄 层板， 保持水平， 待其凝固， 于( 5 5 士1 ) 培养( 1 7 士1 ) h o 经过培养后， 在薄 层板上与盐霉素标准液产生抑菌圈的、 R值相同位置上， 显现 抑菌圈者即 证明抑 菌物确是盐霉素。 *草庐一苇草庐一苇*提供优质文档， 如果 你下载的

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