1、主要禽病的实验室检测方法及主要禽病的实验室检测方法及结果分析结果分析张国中（中国农业大学）张国中（中国农业大学）2011年年4月月23日日2（一）血清学检测方法（一）血清学检测方法 1、免疫血清学技术、免疫血清学技术l抗抗原原与与抗抗体体在在体体内内（外外）均均可可发发生生特特异异性性结结合合反反应应，因因为为抗抗体体主主要要来来自自于于血血清清，在在体体外外进进行行的的抗抗原原抗抗体体反反应应称称为为血血清清学学反反应应或免疫血清学技术。或免疫血清学技术。一、常用的实验室检测方法一、常用的实验室检测方法3l血清学反应的一般特点血清学反应的一般特点高度特异性高度特异性反应可逆性反应可逆性反应二
2、阶段性反应二阶段性影响反应的因素影响反应的因素4l血清学反应的应用血清学反应的应用抗原抗体的快速检测抗原抗体的快速检测微生物的鉴定与分析微生物的鉴定与分析生物活性物质的超微定量生物活性物质的超微定量抗原抗体在细胞和亚细胞水平定位抗原抗体在细胞和亚细胞水平定位52、血清学反应类型及常用试验方法、血清学反应类型及常用试验方法反应类型反应类型常用试验名称常用试验名称凝集试验凝集试验直接凝集试验直接凝集试验平板凝集试验（平板凝集试验（SPA）血凝（血凝（HA）和血凝抑制试验（）和血凝抑制试验（HI）沉淀试验沉淀试验琼脂免疫扩散试验（琼脂免疫扩散试验（AGP）中和试验中和试验病毒中和试验（病毒中和试验（
3、VN）标记抗体技术标记抗体技术 酶标记技术酶标记技术酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（ELISA）6（1）平板凝集试验（）平板凝集试验（SPA）l基基本本原原理理：细细菌菌、红红细细胞胞等等颗颗粒粒状状抗抗原原与与相相应应抗抗血血清清在在电电解解质质存存在在情情况况下下，产产生生可可见的颗粒凝集现象。见的颗粒凝集现象。l主要应用：鸡白痢（主要应用：鸡白痢（SP）支原体（支原体（MG/MS）图图1 1 平板凝集试验检测结果平板凝集试验检测结果8（2）血凝（）血凝（HA）和血凝抑制试验（）和血凝抑制试验（HI）l基基本本原原理理：某某些些病病毒毒（如如NDV）能能够够凝凝集集特特定定种种类类动动
4、物物的的红红细细胞胞，此此即即红红细细胞胞凝凝集集现现象象。这这种种红红细细胞胞凝凝集集现现象象可可以以被被特特异异性性抗血清所抑制，即红细胞凝集抑制试验。抗血清所抑制，即红细胞凝集抑制试验。l主要应用：新城疫（主要应用：新城疫（ND）禽流感（禽流感（AI）产蛋下降综合症（产蛋下降综合症（EDS）鸡传染性支气管炎（鸡传染性支气管炎（IB）图图2 2 血凝抑制试验检测结果血凝抑制试验检测结果G.Cattoli（OIE）10（3）琼脂免疫扩散试验（）琼脂免疫扩散试验（AGP）l基基本本原原理理：可可溶溶性性抗抗原原（毒毒素素、病病毒毒、细细菌菌裂裂解解液液）与与相相应应抗抗体体结结合合,在在电电解
5、解质质存存在情况下，产生可见的沉淀物。在情况下，产生可见的沉淀物。l主要应用：鸡马立克氏病病毒（主要应用：鸡马立克氏病病毒（MDV）鸡痘病毒（鸡痘病毒（FPV）图图3 3 琼脂扩散试验检测结果琼脂扩散试验检测结果1.1.抗原；抗原；2.2.阳性对照；阳性对照；3-6.3-6.待检血清；待检血清；7.7.阴性对照阴性对照12（4）病毒中和试验（）病毒中和试验（VN）l基基本本原原理理：抗抗原原与与相相应应的的抗抗血血清清按按适适当当比比例例混混合合作作用用后后，可可被被中中和和而而失失去去感感染染实实验验动物、组织细胞或鸡胚的能力。动物、组织细胞或鸡胚的能力。l主主 要要 应应 用用：鸡鸡 传传
6、 染染 性性 支支 气气 管管 炎炎 病病 毒毒（IBV）的血清分型。）的血清分型。图图4 4 采用鸡胚接种进行采用鸡胚接种进行IBVIBV分离分离空白对照空白对照病毒接种病毒接种图图5 5 采用中和试验对疑似采用中和试验对疑似IBVIBV分离物进行鉴定与分型分离物进行鉴定与分型空白对照空白对照病毒接种病毒接种病毒病毒+抗血清抗血清15（5）酶联免疫吸附试验（）酶联免疫吸附试验（ELISA）l基本原理：抗原抗体反应的特异性基本原理：抗原抗体反应的特异性 酶促反应的高效性酶促反应的高效性使使抗抗原原（或或抗抗体体）结结合合到到某某种种固固相相载载体体表表面面并并保持其免疫活性；保持其免疫活性；使
7、使抗抗原原（或或抗抗体体）与与某某种种酶酶连连接接成成酶酶标标物物，这这种种酶酶标标抗抗原原（或或抗抗体体）既既保保留留其其免免疫疫活活性性，又又保留酶的活性。保留酶的活性。16l主要应用：多种禽病检测主要应用：多种禽病检测l抗抗体体检检测测最最常常用用ELISA方方法法：间间接接法法，是是利利用用酶酶标标记记的的抗抗抗抗体体（一一般般为为抗抗鸡鸡IgG）检检测测已与固相抗原结合的抗体。已与固相抗原结合的抗体。图图6 6 间接间接ELISAELISA方法测抗体的基本原理示意图方法测抗体的基本原理示意图固相载体固相载体固相载体固相载体包被抗原包被抗原包被抗原包被抗原待检抗体待检抗体待检抗体待检抗
8、体酶标二抗酶标二抗酶标二抗酶标二抗底物显色底物显色底物显色底物显色18l考虑血清学检测的目的考虑血清学检测的目的l血清样品的采集方法血清样品的采集方法l采集血清样品的数量采集血清样品的数量l血清样品的标记血清样品的标记l血清样品的贮藏及运输血清样品的贮藏及运输3、血清学检测应注意的问题、血清学检测应注意的问题191、病原分离鉴定、病原分离鉴定 （1）定定义义：指指通通过过人人工工培培养养的的方方法法分分离离出出病原体的过程。病原体的过程。（二）病原学检测方法（二）病原学检测方法20（2）病原分离主要目的）病原分离主要目的l进行疾病诊断进行疾病诊断l疾病确诊的黄金方法疾病确诊的黄金方法l病原学研
9、究的基础病原学研究的基础21（3）病原分离方法）病原分离方法l细菌分离培养：各种培养基细菌分离培养：各种培养基l病毒分离鉴定：鸡胚、细胞或实验动物接种病毒分离鉴定：鸡胚、细胞或实验动物接种22（4）进行病毒分离应注意的问题）进行病毒分离应注意的问题l样品采集时间样品采集时间l采集样品种类采集样品种类l样品贮藏及运输样品贮藏及运输l常见接种途径常见接种途径l常用鉴定方法常用鉴定方法232、聚合酶链式反应（、聚合酶链式反应（PCR）（1）主主要要目目的的：通通过过对对特特异异性性基基因因片片段段的的检检测达到检测病原体的目的。测达到检测病原体的目的。（2）优缺点：方便快捷、存在假阳（阴）性）优缺点
10、方便快捷、存在假阳（阴）性图图7 7 常规常规RT-PCRRT-PCR检测结果（电泳图）检测结果（电泳图）253、其它病原学检测方法、其它病原学检测方法（1）血凝（）血凝（HA）和血凝抑制（）和血凝抑制（HI）试验）试验（2）琼脂免疫扩散试验（）琼脂免疫扩散试验（AGP）（3）酶联免疫吸附试验（）酶联免疫吸附试验（ELISA）（4）胶体金试纸条检测）胶体金试纸条检测（5）动物实验检查）动物实验检查261、雏鸡母源抗体检查（、雏鸡母源抗体检查（1-3日龄）日龄）（1）了解原产地的免疫种类）了解原产地的免疫种类l了解原产地易发病种类及保护性水平了解原产地易发病种类及保护性水平l确定需根据当地情况
11、加免的疫苗确定需根据当地情况加免的疫苗l根据抗体反应追踪是否有过感染根据抗体反应追踪是否有过感染二、实验室监测方案的制定二、实验室监测方案的制定27（2）了解母源抗体水平）了解母源抗体水平l根根据据母母源源抗抗体体水水平平及及各各种种疫疫病病母母源源抗抗体体半半衰衰期合理确定疫苗首免时间期合理确定疫苗首免时间l了解雏鸡免疫保护能力，便于疫病诊断了解雏鸡免疫保护能力，便于疫病诊断282、免疫检查、免疫检查 （1）免疫前检查）免疫前检查l目目的的是是了了解解免免前前抗抗体体水水平平、决决定定免免疫疫时时间间和和进行免疫效果评价。进行免疫效果评价。初免前检查初免前检查 再免前检查再免前检查29（2）
12、免疫后检查）免疫后检查l目目的的是是检检查查免免疫疫效效果果，评评价价免免疫疫成成功功或或失失败败，尽尽快快采采取取相相应应措措施施确确保保生生产产安安全全。通通常常应选择免疫后应选择免疫后14-21天进行。天进行。30（3）定期检查）定期检查l目目的的是是规规律律性性检检查查抗抗体体消消长长水水平平以以便便及及时时采采取取补补救救措措施施，分分析析各各种种免免疫疫之之间间的的相相关关性，调整免疫程序。性，调整免疫程序。31（4）重要节点检查）重要节点检查l3050d检查（检查前几次免疫效果）检查（检查前几次免疫效果）l开产前检查（产蛋期及雏鸡保护性抗体需求）开产前检查（产蛋期及雏鸡保护性抗体
13、需求）l3640W检查（确定抗体水平、适时补免）检查（确定抗体水平、适时补免）323、生产发生变动时的检查、生产发生变动时的检查 （1）日常规律性抗体监测）日常规律性抗体监测l做为发病时检查的参考数据做为发病时检查的参考数据l做为鸡群抵抗力的依据，指示病因分析方向做为鸡群抵抗力的依据，指示病因分析方向l做为流行病学分析数据，利于发现病原变异做为流行病学分析数据，利于发现病原变异33（2）双份血清检测）双份血清检测l鉴鉴于于发发病病后后抗抗体体常常有有明明显显升升高高，双双份份血血清清抗抗体值对比分析有很好的诊断价值。体值对比分析有很好的诊断价值。34（3）抗原检测）抗原检测l某某些些情情况况下
14、下，抗抗原原检检测测可可以以直直接接证证实实感感染染状况的存在。状况的存在。35（4）未免疫鸡群抗体检测）未免疫鸡群抗体检测l未未免免疫疫鸡鸡群群某某疾疾病病抗抗体体的的出出现现，特特别别注注意意雏雏鸡鸡母母源源抗抗体体消消失失后后抗抗体体的的再再出出现现以以及及随随日日龄龄增增加加而而抗抗体体持持续续上上升升的的现现象象，这这对对疾疾病病诊诊断断十分重要。十分重要。364、重要疫病流行动态分析、重要疫病流行动态分析l流流行行动动态态分分析析对对生生产产企企业业来来说说，开开展展具具有有一一定定的的难难度度，但但对对重重要要疫疫病病，尤尤其其是是重重点点进进行行免免疫疫防防控控的的疫疫病病仍仍
15、然然值值得得重重视视，对对长长期期的的流流行行资资料料进行分析，会得到极为有益的技术支持。进行分析，会得到极为有益的技术支持。37l流流行行动动态态分分析析需需要要进进行行大大量量工工作作，除除抗抗体体监监测测外外，必必需需配配合合针针对对性性的的实实验验室室研研究究工工作作，如如病病原原分分离离鉴定、动物实验和必要的分子生物学研究。鉴定、动物实验和必要的分子生物学研究。381、HI检测结果与分析检测结果与分析 （1）常见）常见HI检测结果检测结果1-3d 15-25d25-35d35-50d50d开开产前前36w左右左右40wH5N125-720-320-423-526-727-925-62
16、7-9H9N225-920-323-524-727-829-1226-729-11ND25-920-323-525-827-1029-1227-829-12三、重要疫病的常见检查结果与分析三、重要疫病的常见检查结果与分析图图8 8 种鸡开产前种鸡开产前NDVNDV抗体检测情况抗体检测情况40（2）免疫抗体空档期）免疫抗体空档期l15-25d是是母母源源抗抗体体逐逐渐渐消消失失，新新的的免免疫疫抗抗体体尚未建立的时期尚未建立的时期l野毒侵袭大多发生于此，一般野毒侵袭大多发生于此，一般18-25d多发多发l空档期随免疫（程序和疫苗）成功达到最短空档期随免疫（程序和疫苗）成功达到最短图图9 NDV9
17、 NDV母源抗体衰减情况母源抗体衰减情况图图10 15-3010 15-30日龄雏鸡日龄雏鸡NDVNDV抗体检测情况抗体检测情况43（3）HI检查的抗体离散度检查的抗体离散度l在在4lg2内是允许范围内是允许范围l大于大于4lg2的基本原因的基本原因初免时母源抗体水平参差不齐初免时母源抗体水平参差不齐免疫成功率不高免疫成功率不高-漏免太多漏免太多疫苗质量不好疫苗质量不好l二免后离散度应达到要求二免后离散度应达到要求44（4）抗体保护临界值）抗体保护临界值l通过攻毒试验加以验证的结果通过攻毒试验加以验证的结果AIV要求要求26NDV要求要求28-10l临临界界值值是是针针对对有有效效保保护护对对
18、等等而而言言，即即疫疫苗苗和和流行毒株有良好的相关性。流行毒株有良好的相关性。l当当流流行行毒毒株株变变异异而而疫疫苗苗株株保保护护性性不不足足时时，原原有有临临界界值值在在一一定定程程度度上上失失去去意意义义，需需要要新新确确立或提高临界值水平。立或提高临界值水平。45（5）诊断试剂问题）诊断试剂问题l抗原问题：抗原问题：抗原不纯（影响抗原不纯（影响HA的确定）的确定）抗原制备毒株和流行毒株存在明显差异抗原制备毒株和流行毒株存在明显差异l阳性血清问题：阳性血清不纯阳性血清问题：阳性血清不纯46（6）诊断指标）诊断指标lH5N1双双份份血血清清检检测测：应应用用常常规规 Re-4、Re-5苗苗
19、免免疫疫情情况况下下，如如果果知知道道发发病病前前抗抗体体水水平平，则则发发病病后后10-14d可可检检测测出出Re-4、Re-5抗抗体体滴滴度上升度上升22-3。未未免免相相应应疫疫苗苗的的情情况况下下，检检测测变变异异株株抗抗体体达到达到26-9有诊断价值。有诊断价值。图图11 11 某肉种鸡群发生某肉种鸡群发生H5H5感染前后抗体检测结果感染前后抗体检测结果（38W38W发生，发生，2W2W产蛋率产蛋率75%75%5%5%，死淘，死淘20%20%）图图12 12 某肉种鸡群某肉种鸡群H5H5感染后变异株抗体检测结果感染后变异株抗体检测结果（换羽（换羽24W24W发生，降蛋发生，降蛋10%
20、10%，累计死亡率，累计死亡率5%5%）49lH9N2产产蛋蛋鸡鸡发发病病后后10-14天天，HI抗抗体体20%以以上上达达到到212以以上上有诊断价值。有诊断价值。雏鸡雏鸡20-30d HI抗体达到抗体达到26-9有诊断价值。有诊断价值。50lND产蛋鸡发病后产蛋鸡发病后10-14d，HI抗体抗体213有诊断价值。有诊断价值。雏鸡雏鸡20-35d HI抗体达到抗体达到26-9有诊断价值。有诊断价值。图图13 13 某肉种鸡群发生某肉种鸡群发生NDVNDV感染后抗体检测结果感染后抗体检测结果52lHI诊断应注意的问题诊断应注意的问题HI诊诊断断应应结结合合临临床床表表现现，当当临临床床表表现现
21、无无异异常常而而检检测测结结果异常时往往是检测结果出了错，应提高警惕。果异常时往往是检测结果出了错，应提高警惕。532、平板凝集试验（、平板凝集试验（SPA）检测结果与分析）检测结果与分析 （1）可用于）可用于MG、MS、SP检查检查 （2）可可进进行行血血清清平平板板和和全全血血平平板板，相相对对来来说说血血清平板更准确和易于判断。清平板更准确和易于判断。54（3）SPA准准确确率率相相对对较较差差，假假阳阳性性率率高高，一一般般群群体体检检查查超超过过30%以以上上阳阳性性才才有有确确实实群群体体感感染染的的诊诊断断意义。意义。（4）国内产品和国外产品特异性上有一定差距。）国内产品和国外产
22、品特异性上有一定差距。553、琼脂扩散试验（、琼脂扩散试验（AGP）检测结果与分析）检测结果与分析 （1）可用于）可用于MD、POX和和IC （2）对）对MD可进行抗体、抗原两种检测可进行抗体、抗原两种检测l50d左右，左右，50%以上抗体阳性预示疫苗反应正常以上抗体阳性预示疫苗反应正常l用羽髓做琼扩有发病诊断价值用羽髓做琼扩有发病诊断价值56（3）POX常常不不用用检检测测，通通过过观观察察接接种种部部位位反反应应可可了解免疫效果，观察临床症状进行疫病诊断。了解免疫效果，观察临床症状进行疫病诊断。（4）IC的的琼琼扩扩试试剂剂很很少少，可可从从国国外外进进口口或或选选用用日日本北里所的间接血
23、凝试剂。本北里所的间接血凝试剂。574、ELISA检测结果与分析检测结果与分析 （1）目前可应用）目前可应用ELISA检测的疾病检测的疾病lND、AI lMG、MS、SPlIB、IBD、REO、AE、RE、ILT、CIAlALV-A/B、ALV-J、ALV-Ag58（2）常见）常见ELISA检测结果检测结果1-3d15-25d25-35d50d开开产前前产蛋期蛋期IB2000-80000-10001000-20002000-80002000-150002000-15000IBD2000-80000-15002000-40004000-100004000-100004000-12000REO20
24、00-50000-5000-20002000-60002000-150002000-15000ILT2000-30000-10000-5002000-40002000-60002000-6000AE500-20000-5000-300300-6000300-8000500-8000CIA+（0.3）+/-+/-+（0.1）+（15000预示存在野毒感染。预示存在野毒感染。l应应达达到到的的指指标标在在相相应应日日龄龄检检测测达达不不到到，指指示示免免疫失败，应追踪疫苗质量和免疫技术。疫失败，应追踪疫苗质量和免疫技术。l长长期期检检测测有有助助于于了了解解抗抗体体变变化化规规律律，用用于于指指导
25、导疫苗选择和免疫程序的制定。疫苗选择和免疫程序的制定。l按按照照常常规规做做检检测测，有有利利于于发发病病诊诊断断和和监监督督生生产产问题的发现。问题的发现。图图17 25W17 25W肉种鸡群肉种鸡群IBVIBV的的ELISAELISA抗体检测结果抗体检测结果 图图18 18 抗体异常血清鸡胚中和试验检测结果抗体异常血清鸡胚中和试验检测结果空白对照空白对照A2毒毒+A2血清血清A2毒对照毒对照A2毒毒+待检血清待检血清图图19 19 某某1 1日龄雏鸡群日龄雏鸡群MSMS抗体检测情况抗体检测情况图图20 20 某某5050日龄鸡群日龄鸡群MSMS抗体检测情况抗体检测情况图图21 21 某某35W35W肉种鸡群肉种鸡群MSMS抗体检测情况抗体检测情况图图22 22 某某21W21W肉种鸡群肉种鸡群APVAPV抗体检测结果抗体检测结果图图23 23 不同日龄鸡群不同日龄鸡群CAVCAV抗体阳性率情况抗体阳性率情况74谢谢 谢谢!
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