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1、项目名称：动物重要病原菌功能基因组与分子致病机理研究首席科学家：起止年限：2012.1-2016.8依托部门：教育部 湖北省科技厅一、关键科学问题及研究内容（一）拟解决的关键科学问题1病原菌在动物和人中的流行与传播机制结核病是全球死亡人数最高的人类传染病，主要由结核分枝杆菌引起，但在发展中国家，牛结核是人结核的重要传染源，10的人结核是由牛结核引起的。牛结核主要由牛分枝杆菌引起，但国内外关于牛感染人结核的证据越来越多。在上一个973计划项目中我们发现，我国分菌证实的牛结核中，46为人结核分枝杆菌，54为牛分枝杆菌；牛结核呈上升蔓延趋势，但我国结核分枝杆菌复合群在牛和人间的相互传播尚缺乏系统研究
2、。猪链球菌有33个血清型，除在动物间流行外，1型、2型、4型、14型和16型对人致病，是致成人脑膜脑炎的重要病原菌之一。前期研究证实，除2型外的其它血清型有增加趋势。副猪嗜血杆菌虽然未见感染人的报道，但它是当前危害世界养猪业最重要的病原菌之一，其血清型和致病性的多样性是兽医临床诊断与防控的最大挑战。因此，结核和猪链球菌在动物和人中的流行与传播规律、猪链球菌和副猪嗜血杆菌优势血清型和致病性的动态变化、病原菌毒力多样性和抗原多样性的遗传基础等，是本项目拟解决的关键科学问题之一。2病原菌的蛋白质互作与基因调控网络在后基因组时代，生命科学领域的研究人员面临的问题不再仅仅是某个基因、某个蛋白质等单个分子
3、的功能，而是由分子之间相互作用形成的极其复杂的调控网络，从系统生物学的角度认识生命活动规律。结核分枝杆菌和猪链球菌是两种重要的人兽共患病原菌，研究病原菌蛋白质蛋白质相互作用网络与基因调控网络是理解其基因和蛋白质网络结构及功能的基础和关键，继而理解病原菌的生长、代谢、毒力调控、致病机制、耐药机制等重要科学问题，并为病原菌防治提供新的药物靶标和策略。3病原菌的致病与免疫逃避的机制传染病的发生、发展与转归是病原微生物与宿主相互作用的结果，不同病原菌有其特殊的感染、致病、免疫应答和免疫逃避的机制。结核分枝杆菌引起低烧及长期的慢性炎症反应，猪链球菌感染则引起急性炎症反应，致死率非常高，而副猪嗜血杆菌感染
4、则主要引起亚急性炎症反应。因此，这三种病原菌是研究细菌感染过程中炎症反应的作用及机制的良好模型。结核分枝杆菌是一种特殊的胞内寄生菌，其免疫逃避及引起慢性炎症的分子机制在动物个体、细胞及分子水平都已做了大量研究，但仍没有完全解释清楚，迫切需要更加深入的研究。猪链球菌和副猪嗜血杆菌分别作为动物新发的革兰氏阳性和阴性胞外菌的代表，均能引起脑膜炎、关节炎和肺炎，其感染、致病、免疫应答和免疫逃避的机制也是急需深入研究的重要基础科学问题。（二）主要研究内容以结核分枝杆菌复合群、猪链球菌和副猪嗜血杆菌等重要动物病原菌为研究对象，综合运用分子流行病学、现代细菌学、分子免疫学、功能基因组学、蛋白质组学、糖组学等
5、研究手段，开展如下研究：进一步开展牛结核、猪链球菌病和副猪嗜血杆菌病的病原学与流行病学研究，建立菌种资源库，深入研究结核分枝杆菌复合群在牛和人中的流行现状与传播规律、猪链球菌和副猪嗜血杆菌优势血清型及致病性的动态变化、病原菌毒力多样性和抗原多样性的遗传基础。完善已构建的结核分枝杆菌全菌蛋白质-蛋白质相互作用网络，构建猪链球菌的全菌蛋白质-蛋白质相互作用网络，发掘与细菌生长、代谢、毒力调控和耐药相关的新关键因子和药物靶标。以结核分枝杆菌、猪链球菌等病原菌为研究对象，进行细菌糖组学研究，从多糖的生物合成、结构及功能三个层面入手，阐明结核分枝杆菌和猪链球菌表面多糖的合成途径和生物学作用，深化对这两种
6、病原菌的生长及感染机制的认识，为抗菌药物开发新策略提供理论基础。研究人结核分枝杆菌对牛的致病性，鉴定牛分枝杆菌、猪链球菌和副猪嗜血杆菌的新的毒力因子，深入研究病原菌毒力因子与宿主细胞的相互作用及其信号传导途径，研究猪链球菌与副猪嗜血杆菌的协同致病作用及其机制。研究结核病发生、发展和转归过程中炎性因子的变化及其调控机制，牛分枝杆菌免疫逃避以及引起慢性炎症的机制，猪链球菌引起急性炎症和导致炎症紊乱的机制。二、预期目标（一）总体目标以结核分枝杆菌复合群、猪链球菌和副猪嗜血杆菌为研究对象，初步阐明结核在牛和人中的流行特征与传播规律，猪链球菌和副猪嗜血杆菌优势血清型和致病性的动态变化，揭示病原菌基因组序
7、列的变异、毒力多样性和抗原多样性的遗传基础；解析病原菌的蛋白质相互作用与基因调控网络，及表面多糖的结构、合成机制与功能，阐明病原菌的生长、代谢、毒力调控、DNA损伤修复与耐药机制，发掘新的功能基因、蛋白质和表面多糖；研究病原菌及其蛋白质和表面多糖与宿主的相互作用及其信号传导途径，初步阐明病原菌的感染、致病、免疫应答和免疫逃避的机制，为这三种传染病的防控提供必要的科学理论依据。（二）五年预期目标1揭示结核分枝杆菌复合群、猪链球菌和副猪嗜血杆菌在动物中的流行规律与生态分布，阐明优势血清型和变异株与致病性间的关系，重点探讨结核分枝杆菌复合群在牛和人间流行的传播机制，为这三大疾病的防控提供理论依据。2
8、分离鉴定和收集分枝杆菌500株，其中牛源结核分枝杆菌200株（人型及牛型）、猪链球菌和副猪嗜血杆菌2000株，建立基因组多态性数据库和基因组多态性研究的技术平台，阐明主要流行株的基因组序列变异和进化规律。3完善和构建结核分枝杆菌和猪链球菌的蛋白质相互作用网络和转录调控网络，初步阐明细菌生长、代谢和毒力调控的分子机制，揭示结核分枝杆菌DNA损伤修复与耐药之间的关系。4鉴定牛分枝杆菌的乙酰化蛋白谱及Sir2蛋白的底物蛋白谱，揭示Sir2蛋白与牛分枝杆菌致病性及药物作用机理之间的关联性。5鉴定结核分枝杆菌和猪链球菌表面多糖及结核分枝杆菌细胞壁多糖的生物合成途径中的糖基供体合成酶基因和糖基转移酶基因，
9、完成10种糖基供体合成酶和糖基转移酶基因的克隆及表达，并确定其在病原菌表面多糖生物合成途径中的功能；完成5种糖基转移酶基因对病原菌生长及感染影响的分析；解析1-2种重要表面多糖的组分和结构，明确其在细菌生长及致病中的关键作用。6初步阐明人结核分枝杆菌对牛的致病特征；鉴定猪链球菌、副猪嗜血杆菌及结核分枝杆菌的新的毒力相关基因20个以上，完成810个毒力因子与宿主细胞的相互作用及其信号传导通路研究，初步阐明猪链球菌与副猪嗜血杆菌的协同致病作用和机制。7鉴定结核病发生、发展与转归过程的分子标识；初步阐明自噬在牛分枝杆菌感染的先天性免疫和获得性免疫中的作用及其机制，揭示牛分枝杆菌免疫逃避以及引起慢性炎
10、症的机制；阐明猪链球菌引起急性炎症和导致炎症紊乱的机制。8发表SCI收录论文5060篇，申请/获得专利1520项，培养56名左右中青年学术骨干，培养研究生100150名。三、研究方案（一）总体研究思路、项目研究的技术路线及可行性分析1总体研究思路结核分枝杆菌复合群、猪链球菌和副猪嗜血杆菌是严重危害畜牧业健康发展和人民健康的重要病原菌，其血清型或基因型复杂；结核分枝杆菌复合群和猪链球菌的宿主谱广，可在人和动物间相互传播，但其传播链和传播机制尚不清楚；三种病原菌常与其它病原微生物混合感染和继发感染，形成复杂的病原生态学关系，其单独致病和协同致病的机制，病原菌诱导宿主的先天性和获得性免疫反应，以及病
11、原菌免疫逃避和持续感染的机制等，都是动物细菌性传染病研究领域复杂和关键的科学命题。本项目从病原菌的分离鉴定和收集及流行规律、生态分布和基因组序列变异等研究入手，揭示病原菌的流行与传播机制、流行血清型和致病性的动态变化及毒力多样性和抗原多样性的遗传基础；进而以代表性的菌株为研究对象，构建病原菌的蛋白质互作与基因调控网络，研究病原菌表面多糖的合成机制与功能，揭示病原菌生长、代谢、毒力调控和耐药机制，预测和鉴定新的功能基因、蛋白质和表面多糖；深入研究病原菌及其蛋白质和表面多糖与宿主的相互作用，揭示病原菌的感染、致病、免疫应答和免疫逃避的机制，为这三种传染病的防控提供必要的科学理论依据。2技术路线3可
12、行性分析工作基础：本项目是在2010年结题验收的973计划重大传染病基础研究专题“重要动物病原菌的分子生物学与致病机理研究”（2006-2010）的基础上滚动申报的。已结题的973计划项目在科学研究、人才培养、平台建设、重要成果等方面均超额完成了计划任务，并被评为“优秀”。本项目研究仍然以结核分枝杆菌复合群、猪链球菌和副猪嗜血杆菌为主要研究对象，拟解决的关键科学问题是在上一个项目研究的基础上提炼出来的，研究内容是上一个项目的延续和深入，申报单位和主要学术骨干均参与了上一个973计划项目的研究，并取得重要研究成果。因此，本项目有非常坚实的工作基础。人才队伍：本项目的研究队伍来自教育部属大学、中科
13、院和中国农科院等优势单位，结构合理，年富力强，专业特长突出，学科交叉。项目组绝大多数人员参与了上一个973计划项目的研究，具有良好的团队合作基础和前期研究工作基础。本次又吸纳了新的技术骨干，加强分子流行病学和免疫机理的研究。因此，本项目有优秀的人才队伍保障。技术平台：本项目涉及的关键研究技术平台，包括分子流行病学、基因组学、蛋白质组学、细菌多糖的合成途径与功能分析、相关病原菌的遗传操作体系、分子免疫学、基因蛋白质相互作用、病原与宿主细胞的相互作用、相关疾病的动物模型等均已建立，并能熟练运用。支撑条件：本项目涉及的七个单位拥有与该申请项目研究领域相关的4个国家重点实验室、3个省部级重点实验室和1
14、个中科院重点实验室；四家单位拥有资质认可、运行良好的生物安全III级实验室。因此，本项目有良好的硬件条件保障。（二）项目的创新点与特色1在我国，结核病在动物（特别是牛）和人间相互传播有增加的趋势，猪链球菌不仅在动物中感染率高，而且已成为成人脑膜脑炎的重要病原菌之一，副猪嗜血杆菌病是养猪业最重要的新发细菌性传染病。根据我国结核病、猪链球菌病和副猪嗜血杆菌病流行的复杂形势，本项目拟深入开展病原生态学和分子流行病学研究，进一步弄清结核在动物和人中的流行与传播机制、猪链球菌和副猪嗜血杆菌优势血清型和致病性的动态变化，揭示病原菌基因组序列的变异及毒力多样性与抗原多样性的遗传基础，为三种传染病的防控提供科
15、学决策依据。2从结核分枝杆菌和猪链球菌的全局性蛋白质相互作用网络和基因调控网络分析与验证入手，揭示病原菌生长、代谢、毒力调控和耐药机制，不仅为病原菌致病与免疫机制研究奠定基础，而且是发现新的药物靶标和防治策略的重要途径。3从克隆鉴定参与结核分枝杆菌和猪链球菌的表面多糖合成途径的重要糖基转移酶入手，解析病原菌表面多糖的结构与合成机制，表面多糖在病原菌生长、感染、免疫中的功能，为致病与免疫机制研究、药物和疫苗的设计与开发提供理论依据。4从病原菌及其重要组分（蛋白质、表面多糖）与宿主相互作用及其信号传导通路分析入手，深入研究病原菌的感染、致病、免疫应答和免疫逃避的机制，为揭示三种细菌性传染病的发生、
16、发展与转归机制提供科学数据。（三）课题设置课题1、病原菌在动物和人中的流行与传播机制1主要研究目标揭示结核分枝杆菌复合群在牛和人中的流行规律与传播机制、猪链球菌和副猪嗜血杆菌优势血清型及致病性的动态变化、病原菌毒力多样性和抗原多样性的遗传基础，为这三种传染病的防治提供理论依据。2主要研究内容（1）结核分枝杆菌复合群在动物和人间的流行现状与传播规律：进一步研究人结核分枝杆菌在牛等动物中的流行情况与致病性及牛分枝杆菌在人间的流行情况；通过流行环节和溯源研究，揭示结核在牛人间的传播规律与机制。（2）猪链球菌和副猪嗜血杆菌的流行规律研究：猪链球菌和副猪嗜血杆菌流行的优势血清型和致病性的动态变化规律；猪
17、链球菌对人致病血清型在我国猪群中的流行情况与致病性。（3）细菌分离鉴定和保藏：从动物和/或人中分离鉴定一批结核分枝杆菌复合群、猪链球菌和副猪嗜血杆菌的地方流行菌株，建立菌种资源库；鉴定新的细菌基因分型标记，建立新的基因或血清分型方法；进行种、基因型和血清型鉴定，为基因变异和分子流行病学研究积累材料与资料。（4）病原菌基因变异研究：通过全基因组重测序和/或全基因组扫描分析三种病原菌的基因组序列的变异（SNPs、基因缺失和基因重排等），确定变异的热点区域并对重要变异进行验证，阐明细菌毒力基因多样性和抗原多样性的遗传基础。3承担单位、课题负责人和主要学术骨干（1）承担单位：华中农业大学、中国农业科学
18、院哈尔滨兽医研究所、宁夏大学（2）课题负责人：郭爱珍（3）主要学术骨干：刘思国、王玉炯、蔡旭旺4经费比例：22课题2、病原菌的蛋白质互作与基因调控网络1主要研究目标构建或完善结核分枝杆菌和猪链球菌的蛋白质相互作用与基因调控网络，发掘与细菌生长、代谢和耐药相关的新关键因子和药物靶标；鉴定牛分枝杆菌的乙酰化蛋白谱及Sir2蛋白的底物蛋白谱，揭示Sir2蛋白与病原菌致病性之间的关系。2主要研究内容（1）结核分枝杆菌生长、代谢及耐药机制的研究：利用细菌双杂交技术，完善已构建的结核分枝杆菌蛋白质相互作用网络，系统分析DNA代谢蛋白质亚网络，分析预测和鉴定与生长、代谢及耐药相关的新的关键因子，解析DNA损
19、伤修复与耐药之间的关系，发现药物新靶标。（2）猪链球菌的蛋白质互作与基因调控网络研究：利用生物信息学和双杂交技术构建猪链球菌2型的全菌蛋白质-蛋白质相互作用网络，预测和鉴定与生长、代谢、毒力调控相关的新功能基因和蛋白质，发现药物新靶标。（3）牛分枝杆菌蛋白质乙酰化及其与致病性和耐药性的关系研究：鉴定牛分枝杆菌的乙酰化蛋白谱及Sir2蛋白的底物蛋白谱，揭示Sir2蛋白与病原菌致病性及药物作用机理之间的关联性。3承担单位、课题负责人和主要学术骨干（1）承担单位：华中农业大学、中国科学院武汉病毒研究所（2）课题负责人：周锐（3）主要学术骨干：张华、谷晶、徐卓菲、金卉4经费比例：26课题3、病原菌表面
20、多糖的结构与功能1主要研究目标以结核分枝杆菌、猪链球菌等病原菌的表面多糖为对象，通过对参与其生物合成的糖基供体合成酶及糖基转移酶的基因组学分析、结构与功能分析、多糖结构分析等，阐明病原菌表面多糖合成途径，为基于多糖抗原和毒力因子的诊断、疫苗及药物开发奠定基础。2主要研究内容（1）系统地鉴定、分离、表达结核分枝杆菌和猪链球菌表面多糖合成相关的基因；（2）分离结核分枝杆菌和猪链球菌的表面多糖，分析糖链的组分、结构与合成途径；（3）分析基因及其产物糖链对病原菌的生长和感染过程的影响，理解病原菌细胞表面多糖的生物学与免疫学功能；（4）合成病原菌多糖或类似物，分析验证多糖的生物学作用，进行病原菌抑制剂和
21、检测方法的研究，为新型药物、疫苗和诊断技术的开发提供理论基础。3承担单位、课题负责人和主要学术骨干（1）承担单位：中国科学院微生物研究所、华中农业大学、大连医科大学（2）课题负责人：李学兵（3）主要学术骨干：马郁芳、谭臣4经费比例：16课题4、病原菌感染与分子致病机制1主要研究目标初步阐明人结核分枝杆菌在牛群中的感染与致病特征；阐明猪链球菌和副猪嗜血杆菌与其它呼吸道病原的混合感染与协同致病机制；研究病原菌毒力因子与宿主的相互作用及其信号传导途径，揭示病原菌对细胞、组织和器官导致的病理损伤及其机制。2主要研究内容（1）人结核分枝杆菌对牛的致病性：对自然感染人结核分枝杆菌的牛进行组织病理学研究，分
22、析其致病机理；通过实验动物模型研究人结核分枝杆菌对牛的致病性。（2）病原菌感染、发病、发生发展与转归的机制：以结核分枝杆菌为重点，通过实验动物模型研究病原菌感染的病程经过与转归机制。（3）病原菌新毒力因子的发掘：鉴定和验证猪链球菌和副猪嗜血杆菌新的毒力因子。（4）病原菌与宿主的相互作用研究：研究病原菌重要毒力因子与宿主的相互作用及其信号传导途径，初步阐明猪链球菌和副猪嗜血杆菌突破血脑屏障的机制。（5）病原协同致病机制：比较猪链球菌、副猪嗜血杆菌与其它病原混合感染后对宿主免疫系统的影响及致病力的变化，研究病原间协同致病机制。3承担单位、课题负责人和主要学术骨干（1）承担单位：南京农业大学、中国人
23、民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所（2）课题负责人：陆承平（3）主要学术骨干：范红结、姜永强4经费比例：16课题5、病原菌的免疫应答与免疫逃避机制1主要研究目标鉴定结核病发生、发展与转归过程的分子标识；初步阐明自噬在牛分枝杆菌感染的先天性免疫和获得性免疫中的作用及其机制，揭示牛分枝杆菌免疫逃避以及引起慢性炎症的机制；阐明猪链球菌引起急性炎症和导致炎症紊乱的机制。2主要研究内容（1）结核病发生、发展和转归的研究：研究结核病发生、发展和转归过程中炎性因子的变化及其调控机制，鉴定结核病发生、发展与转归过程的分子标识。（2）牛分枝杆菌免疫逃避以及引起慢性炎症的机制研究：比较研究牛分枝杆菌强弱菌株
24、对小鼠树突状细胞成熟分化的影响，探讨病原菌在树突状细胞内存活的调节机制；研究病原菌相关分子在逃避吞噬、抑制活性氧（ROS）/活性氮（RNS）产生、阻断补体活化通路、抑制免疫应答等中的作用，揭示病原菌拮抗免疫应答的分子机制；探索自噬在天然免疫和获得性免疫中与细菌的相互作用以及这些过程中的信号和信号旁路，揭示牛分枝杆菌及其抗原引起自噬的分子机制。（3）猪链球菌引起急性炎症和导致炎症紊乱机制的研究：建立猪链球菌表面蛋白与分泌蛋白的重组蛋白文库，研究细菌蛋白与细胞的互作，并研究互作分子在病原菌黏附、侵入以及诱导或逃避免疫应答中的作用；通过siRNA、荧光素酶报告系统、炎性通路芯片等技术研究炎症相关因子
25、和趋化因子等活化的信号通路，阐明猪链球菌引起急性炎症和导致炎症紊乱的机制。（4）副猪嗜血杆菌炎症机制的研究：鉴定副猪嗜血杆菌的毒素分子，开展毒素分子调节宿主上皮细胞和免疫细胞代谢、增殖、凋亡等通路的研究，揭示该病原菌致脑膜脑炎、浆膜炎等病理变化的分子机制。3承担单位、课题负责人和主要学术骨干（1）承担单位：扬州大学、华中农业大学（2）课题负责人：焦新安（3）主要学术骨干：金梅林、张安定、贝为成4经费比例：20%（四）各课题间的相互关系本项目的总体目标是：进一步阐明动物结核杆菌、猪链球菌和副猪嗜血杆菌的流行特征与传播机制，解析三种病原菌的重要基因、蛋白质和多糖的结构、功能及其相互作用与调控网路，
26、深入揭示病原菌的致病机理和免疫机理，为这三种传染病的防控提供必要的科学理论依据。围绕项目拟解决的关键科学问题，针对项目总体目标，本项目设置5个课题：（1）病原菌在动物和人中的流行与传播机制。（2）病原菌的蛋白质互作与基因调控网络。（3）病原菌表面多糖的结构与功能。（4）病原菌感染与分子致病机制。（5）病原菌的免疫应答与免疫逃避机制。课题设置的思路：紧密围绕细菌性传染病的三要素病原菌、宿主和环境及其相互作用关系开展研究。课题1从病原生态学与流行病学角度入手，进一步研究三种病原菌的流行特征、传播机制和分子进化规律，为其它课题的深入研究提供研究思路、研究材料（菌株、血清、检测方法等）及理论与技术需求
27、。课题2和课题3分别通过病原菌基因、蛋白质和表面多糖的结构、功能及相互作用的研究，阐明三种病原菌的重要基因、蛋白质和多糖的结构、功能及其调控网路，同时为课题4和课题5的研究提供重要的功能基因、蛋白质和表面多糖。课题4和课题5主要以课题2和课题3鉴定的重要基因、蛋白质和表面多糖为材料，深入研究它们与宿主的相互作用及其信号传导通路，揭示三种病原菌的感染与致病、免疫应答与免疫逃避的机制。因此，五个课题紧密联系，相互支持，共同服务于项目总体目标的实现。四、年度计划年度研究内容预期目标第一年（1）确定病原菌流行病学样品的采集方案与细菌分离鉴定技术规范，并对方案和规范进行示范和调研；（2）病原菌新毒力相关
28、基因的发掘和鉴定；确定核分枝杆菌和猪链球菌糖链合成相关基因簇,克隆、表达部分关键基因。（3）结核分枝杆菌：研究人结核分枝杆菌对牛的致病性；筛选牛分枝杆菌强弱株的差异蛋白；结核分枝杆菌DNA代谢蛋白质亚网络的构建；表达纯化并鉴定去乙酰化酶mbSir2；（4）猪链球菌：细菌双杂交载体和表达载体改造及猪链球菌ORF组克隆；构建猪链球菌表面蛋白和分泌蛋白的重组表达文库；从病原菌胞外分子（蛋白质、多糖等）中筛选可诱导宿主细胞炎性因子释放的组份；利用SILAC技术鉴定出病原菌感染过程中宿主细胞内磷酸化水平改变蛋白；（5）分析副猪嗜血杆菌强弱毒株的差异。（1）建立3种细菌采样方案与病原分离鉴定技术规范各1套
29、；获得分枝杆菌30株，猪链球菌50株，副猪嗜血杆菌50株；（2）鉴定三种细菌新毒力相关基因20个以上；鉴定10个结核分枝杆菌和猪链球菌表面多糖合成途径中的糖基转移酶基因，完成5种糖基转移酶基因的克隆和表达；（3）鉴定8-10种牛分枝杆菌免疫相关蛋白；初步完成结核分枝杆菌DNA代谢蛋白质亚网络的构建；完成mbSir2的表达、纯化和活性鉴定；（4）完成载体改造，猪链球菌2186 ORF 引物设计合成，基因PCR扩增并完成精细文库构建；重组表达50-60个猪链球菌表面蛋白和分泌蛋白；确定猪链球菌可以诱导宿主细胞炎性因子释放的组份；鉴定在病原菌感染过程中宿主细胞内磷酸化水平改变蛋白；（5）鉴定一批副猪
30、嗜血杆菌强弱毒株在感染过程中的差异表达基因；（6）发表SCI论文6-9篇，申请专利1-2项。第二年（1）获得三种细菌流行病学样本，进行细菌分离鉴定，分型，流行环节调研与跟踪，耐药性、毒力和基因组序列变异的分析；（2）构建筛选用细菌双杂交重组质粒，猪链球菌文库的双杂交筛选和基因的大规模表达分析及纯化；进一步完善结核分枝杆菌DNA代谢蛋白质亚网络的构建，并对该网络进行系统分析；搜寻牛分枝杆菌乙酰化蛋白以及mbSir2的底物蛋白，并进行乙酰化蛋白及其乙酰化位点的确认。（3）对结核分枝杆菌和猪链球菌的关键基因进行生物化学分析并测定其3D结构；克隆表达部分糖基转移酶基因；通过基因干扰或缺失构建糖基转移酶
31、缺陷株。（4）建立猪链球菌、副猪嗜血杆菌突破血脑屏障细胞模型；研究这两种细菌主要毒力因子与宿主细胞互作；（5）研究结核病发生、发展和转归过程中炎性相关因子的变化；筛选和鉴定牛分枝杆菌的免疫应答与免疫逃避相关蛋白；构建猪链球菌表面蛋白和分泌蛋白的重组表达文库，并以部分细菌蛋白为诱饵筛选宿主的相互作用蛋白；重组表达所鉴定到的蛋白组份并提取相应的非蛋白组份；确定与猪链球菌感染相关的宿主免疫细胞信号通路；鉴定副猪嗜血杆菌毒素分子。（1）获得160株左右分枝杆菌，并完成分型鉴定；对所收集菌株进行全基因组扫描，每个菌株获得50倍覆盖率的序列；获得330株左右副猪嗜血杆菌分离株，完成分型鉴定工作；获得330
32、株左右猪链球菌分离株，进行血清型和基因型与其毒力因子表型鉴定。（2）完成近2000个猪链球菌ORF的克隆，进行文库双杂交筛选；得到猪链球菌蛋白质表达文库，获得20-30个表达纯化的猪链球菌蛋白质；完成结核分枝杆菌DNA代谢蛋白质亚网络的构建，得到2-3个重要DNA复制修复基因；完成牛分枝杆菌蛋白质乙酰化（去乙酰化）谱和乙酰化位点鉴定；（3）建立酶活性测定方法，完成关键基因的酶特性分析；得到关键基因的3D结构；完成5个糖基转移酶基因的克隆与表达；（4）建立猪链球菌、副猪嗜血杆菌突破血脑屏障的细胞模型；（5）了解结核病发生、发展和转归过程中炎性因子的变化规律；筛选3-5种牛分枝杆菌免疫应答或逃逸新
33、蛋白；纯化50-60个猪链球菌表面蛋白和分泌蛋白，并以部分重组蛋白为诱饵筛选出宿主的相互作用蛋白；表达和纯化得到可以刺激宿主细胞产生炎性因子的蛋白质，并提取非蛋白组份；完成SILAC实验并验证其结果；鉴定5个副猪嗜血杆菌毒素分子，表达纯化毒素蛋白；（6）发表SCI论文12-15篇，申请专利2-3项。第三年（1）继续获得三种细菌流行病学样本，进行细菌分离鉴定，分型，流行环节调研与跟踪，耐药性、毒力和基因组序列变异的分析；（2）猪链球菌文库的双杂交筛选；表达及纯化结核分枝杆菌重要DNA复制修复基因，并在体外分析重组蛋白对目的蛋白的活性影响；牛分枝杆菌乙酰化（去乙酰化）蛋白谱的生物信息学分析，找出其
34、中与药物作用机理及毒力相关的蛋白质；初步验证乙酰化对相关蛋白质功能的影响；（3）构建分枝杆菌和猪链球菌关键糖基转移酶基因的缺陷菌株；建立质谱等细胞壁多糖分析方法，分析分枝杆菌胞壁多糖的结构和猪链球菌荚膜多糖的结构；确定目标糖链，开展化学与酶法结合的合成研究；（4）猪链球菌和副猪嗜血杆菌主要毒力因子与宿主细胞互作及互作的信号传导途径研究；（5）筛选结核病发生、发展与转归的分子标识，抗原优势Th细胞表位和CTL表位鉴定、分子细胞免疫应答类型和规律及其信号通路；研究猪链球菌胞外蛋白与宿主细胞互作及信号传导通路；验证猪链球菌免疫刺激分子诱导宿主炎性因子释放的能力；在猪链球菌感染过程中，研究宿主信号通路
35、，以确定其在感染过程中发挥的作用；副猪嗜血杆菌毒素分子的鉴定及致病作用研究。（1）获得160株左右分枝杆菌，并完成分型鉴定；对所收集菌株进行全基因组扫描，每个菌株获得50倍覆盖率的序列；获得320株左右副猪嗜血杆菌分离株，完成分型鉴定工作；获得320株左右猪链球菌分离株，完成分型鉴定和毒力因子表型鉴定工作。（2）基本完成猪链球菌文库的双杂交筛选，鉴定保存共转化子；纯化得到重要DNA复制修复基因重组蛋白，完成其体外活性的分析；找出乙酰化蛋白质中与细菌耐药性以及毒力相关的蛋白，生化实验初步证明乙酰化对蛋白活性的影响；（3）构建6个糖基转移酶基因缺陷菌株；完成关键基因与病原菌生长相关性的分析；完成1
36、-2种糖链的合成与制备；（4）初步阐明猪链球菌、副猪嗜血杆菌突破血脑屏障的机制；（5）争取获得结核病的分子标识，阐明1-2种新蛋白的免疫应答调节机制；表达纯化全部猪链球菌表面蛋白和分泌蛋白，鉴定其中5种蛋白与宿主互作及信号传导通路；验证猪链球菌免疫刺激分子诱导宿主炎性因子释放的能力；初步确定1-2条宿主信号通路在感染过程中的作用；确定部分副猪嗜血杆菌毒素分子的致病作用；（6）发表SCI论文12-15篇，申请专利4-5项。第四年（1）继续获得三种细菌流行病学样本，进行细菌分离鉴定，分型，流行环节调研与跟踪，耐药性、毒力和基因组序列变异的分析；（2）对鉴定的猪链球菌相互作用共转化子质粒进行大规模测
37、序，并对发现的部分重要互作蛋白进行共沉淀和功能分析，编制蛋白网络处理软件系统；完成结核分枝杆菌重要DNA复制修复基因敲除菌株及超量表达菌株的构建；研究乙酰化对药物作用机理和对牛分枝杆菌毒力的影响;（3）分析结核分枝杆菌和猪链球菌糖基转移酶及多糖链对感染过程的影响；用化学法或化学法和酶法合成底物类似物，分析合成类似物的生物活性;（4）比较猪链球菌、副猪嗜血杆菌与其它病原混合感染后对宿主免疫系统的影响及致病力的变化;（5）比较研究牛分枝杆菌强弱菌株对小鼠树突状细胞成熟分化的影响；探索自噬在天然免疫和获得性免疫中与细菌的相互作用以及这些过程中的信号和信号旁路；进一步研究猪链球菌胞外分子与宿主的互作及
38、信号传导通路，猪链球菌免疫刺激分子的作用机理及副猪嗜血杆菌毒素分子的致病作用。（1）获得150株左右分枝杆菌，并完成分型鉴定，同时获得基因组的完成图及注释信息;获得300株左右副猪嗜血杆菌分离株和链球菌分离株，完成分型鉴定和毒力因子表型鉴定工作;（2）完成猪链球菌互作蛋白的基因测序分析，鉴定500个左右蛋白互作关系，完成10-15个互作蛋白的共沉淀和功能分析；得到结核分枝杆菌DNA复制修复基因敲除菌株及超量表达菌株；建立牛分枝杆菌蛋白质乙酰化对细菌耐药性的关联性及立蛋白质乙酰化与细菌毒力的关联性；（3）获得关键基因及多糖链的免疫原性的数据；完成5-8个酶底物类似物的合成；获得部分底物类似物的活
39、性数据；（4）初步阐明猪链球菌、副猪嗜血杆菌与猪圆环病毒2型等病原的协同致病机制；（5）揭示病原菌在树突状细胞内存活的调节机制；牛分枝杆菌及其抗原引起自噬的分子机制；确定8-10个猪链球菌胞外分子与宿主细胞互作及对信号传导通路的影响；阐明部分猪链球菌免疫刺激分子的作用机理；确定部分副猪嗜血杆菌毒素分子的致病作用；（6）发表SCI论文15-20篇，申请/获得专利4-5项。第五年（1）建立流行菌株菌种库；分析基因组序列的变异与致病性及发病特征间的关系，病原菌进化和分子流行病学规律；分析流行菌株的血清型、毒力和耐药特征，确定病原菌的动态流行病学规律;（2）结核分枝杆菌重要DNA复制修复基因突变菌株在
40、不同生长条件下的差异表达分析；（3）绘制猪链球菌全局性蛋白质相互作用网络，进一步鉴定重要互作蛋白的功能，预测和鉴定与生长、代谢、毒力相关的新功能基因及蛋白质；（4）研究蛋白质乙酰化对牛分枝杆菌毒力和药物作用机理的影响;（5）研究酶底物类似物（抑制剂）的作用机理；糖链的合成修饰，提高糖链或糖链类似物的免疫原性;（6）以实验动物为模型研究结核分枝杆菌感染、发病、发生发展与转归的机制。（7）研究分枝杆菌等相关分子在逃避吞噬、抑制活性氧）/活性氮产生、阻断补体活化通路、抑制免疫应答等中的作用；进一步研究猪链球菌胞外分子与宿主的互作及信号传导通路，猪链球菌免疫刺激分子的作用机理及副猪嗜血杆菌毒素分子的致
41、病作用；（8）项目总结。（1）建立基因组多态性数据库、流行菌株菌种库，总结结核分枝杆菌、副猪嗜血杆菌和猪链球菌在我国流行的基因型与血清型的动态变化规律，及结核菌在人和牛之间的传播规律与机制；（2）初步揭示结核分枝杆菌重要DNA复制修复基因的功能；（3）获得猪链球菌蛋白质互作网络，验证2-3个与重要子网络，发现23个新基因病解析其功能，预测1-2个潜在的药物新靶标；（4）临床样本验证蛋白质乙酰化对细菌耐药性与毒力的影响；（5）确定抑制剂的作用类型；获得1-2种免疫原性强的糖链； （6）初步阐明结核分枝杆菌感染及转归的机制；（7）总结分枝杆菌免疫逃逸和慢性炎症的发生机制，猪链球菌和副猪嗜血杆菌的免疫应答与炎症发生机制。（8）总体完成项目目标；（9）发表SCI论文15-20篇，申请/获得专利5-9项。