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1、第2 4卷第5期 2 0 0 3年1 0月 西 安 交 通 大 学 学 报 (医 学 版 ) J o u r n a l o fX i a nJ i a o t o n gU n i v e r s i t y(M e d i c a lS c i e n c e s) V o l . 2 4N o . 5 O c t . 2 0 0 3 技术方法 大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及其形态观察 康新勤1, 臧伟进1, 宋土生2, 于晓江1, 曾菊绒1 ( 西安交通大学医学院: 1.心血管生理药理研究室;2.生物学教研室, 陕西西安 7 1 0 0 6 1) 摘要: 目的 分离和培养大鼠骨髓组织中的
2、间充质干细胞, 并观察其生长形态。方法 利用造血干细胞和骨髓间充 质干细胞不同生长特性, 采用贴壁法分离并用含1 5%( 体积分数)F B S的低糖型DMEM培养基培养。结果 分离培 养得到的细胞中随着换液次数的增加红细胞和造血细胞逐渐减少; 骨髓组织中贴壁得到间充质干细胞呈梭形、 纺锤 形和多角形。结论 贴壁法可以分离培养骨髓中的间充质干细胞。 关键词: 骨髓间充质干细胞; 分离; 培养 中图分类号:R 3 2 9. 2 文献标识码:B 文章编号: 1 6 7 1 - 8 2 5 9(2 0 0 3)0 5 - 0 5 1 8 - 0 2 1 9 9 9年S c i e n c e 杂志将干
3、细胞研究列为当年十大科学 研究之首。干细胞研究已成为生命科学的一个主攻热点。骨 髓中至少包含两种干细胞成分- - -骨髓间充质干细胞和骨髓 造血干细胞。现在的研究揭示骨髓间充质干细胞有分化成多 种细胞的潜能 1, 包括心肌细胞2、 肝细胞3、 脑中的神经细 胞和非神经细胞 4、 内皮细胞、 成骨细胞和肺泡上皮细胞5 等。研究骨髓细胞的分化潜能, 首先要分离骨髓中的间充质 干细胞。本文根据骨髓中造血细胞和间充质干细胞的不同生 长方式, 采用一种较简单的分离方法, 并观察了大鼠骨髓间充 质干细胞的生长形态。 1 材料和方法 1. 1 实验材料 S p r a g u e - D a w l e y
4、( S D) 大鼠由本校实验动物 中心提供; 低糖型DMEM培养基购自G I B C O公司; 胎牛血清 (F B S) 购自杭州四季青犊牛研究所; 青霉素和链霉素购自市 售的华 北 制 药 有 限 责 任 公 司。1 5%( 体 积 分 数)F B S的 DMEM细胞培养基由1 5%( 体积分数)F B S、DMEM培养基、 1 0 0 I Um L -1青霉素及1 0 0 I Um L-1链霉素组成。 1. 2 方法 取1月龄S D大鼠1只, 雌性, 体重8 8g 。用木棒 敲击头部处死。取股骨和胫骨, 注意保留骨端部分不受损伤。 用7 5%( 体积分数) 酒精浸泡1 5m i n后移入超
5、净工作台中。 放置于干净的培养皿内晾干, 剪去骨头两端, 露出骨髓腔。用 含1 5%( 体积分数)F B S的DMEM培养液冲洗骨髓腔, 反复2 次。含有骨髓细胞的培养液经打匀后接种于6孔培养板中的 3孔。于接种培养2 4h后换液, 并将换取的培养液移入另外3 孔, 于接种后4 8h后换液。从而形成02 4h贴壁细胞和2 4 4 8h贴壁细胞各3孔。以后每天换液, 连续3d。3d后改 为每隔2d换液。每天观察细胞形态并作记录。 收稿日期:2 0 0 3 - 0 3 - 2 5 修回日期:2 0 0 3 - 0 5 - 1 0 基金项目: 国家自然科学基金(N o . 3 0 2 7 0 5 5
6、 4) ; 教育部科学技术重点 项目 (N o . 0 1 1 6 1) ;教 育 部 高 校 博 士 学 科 点 基 金 (N o . 2 0 0 1 0 6 9 8 0 3 4) ;西 安 交 通 大 学 博 士 学 位 论 文 基 金 (N o . D F X TU 2 0 0 2 - 1 6) ; 西安交通大学自然科学基金项目 (N o . 5 7 3 0 1 1) 通讯作者: 臧伟进,T e l . 0 2 9 - 5 2 7 5 1 5 0,E - m a i l . Z W J m a i l . x j t u . e d u . c n 作者简介: 康新勤(1 9 6 8 -
7、) , 男( 汉族) , 讲师, 在读博士. 2 结 果 接种骨髓的培养板2 4h后镜下观察发现细胞浓度极大, 全为球形的大鼠骨髓中的血红细胞, 如堆积的沙粒状, 悬浮于 培养液中并有少量血红细胞相互聚集发生; 连续3 d换液后观 察发现悬浮于培养液中的红细胞大量减少, 塑料培养孔底部 有少量的贴壁细胞, 呈梭形、 纺锤形和多角形; 培养7 d后培养 液中悬浮的细胞已完全除去, 只留下贴壁的细胞, 并且贴壁细 胞数量明显增加。对比每个培养孔不同区域细胞分布发现, 培养孔边沿部分细胞密集, 形态有梭形、 纺锤形和多角形( 图 1) 。相对中央部分, 位于培养孔边沿的细胞长势好而且细胞 体积大,
8、即出现“ 细胞边集现象” 。培养1 4d观察发现, 细胞已 基本上长满整个培养孔( 图2) 。 3 讨 论 骨髓中含有多种细胞, 包括基质细胞、 血管细胞、 脂肪细 胞、 成骨细胞、 破骨细胞、 造血干细胞和间充质干细胞。以前 认为骨髓中细胞的功能只是骨髓内细胞再生和再生循环血细 胞。现在的研究揭示骨髓干细胞有分化成多种细胞的潜能。 骨髓干细胞将有可能成为治疗遗传病或变性性疾病的理想来 源细胞。1 9 6 8年,F r i d e n s t e i n等提出了在骨髓中存在能贴附 塑料培养皿, 呈长棱形成纤维细胞样的细胞, 培养时呈克隆生 长, 能形成C F U - F(c o l o n y
9、f o r m i n gu n i t sf i b r o b l a s t i c) , 这种细 胞具有多向分化潜能, 称这类细胞为骨髓间充质干细胞(m e s - e n c h y m a l s t e mc e l l s,M S C s) 、 骨髓间质干细胞, 也称骨髓基质 干细胞(m a r r o ws t r o m a ls t e mc e l l s,M S S C s) 。1 8 6 9年G o u - j o n观察到自体红骨髓异位移植后具有成骨作用。M S C s是 存在于骨髓中非造血干细胞的另一种干细胞, 具有多向分化 潜能, 不仅能分化为造血实质支持造血
10、, 还可分化为多种造血 以外的组织细胞。特别是中胚层和神经外胚层来源的组织细 胞。在实验条件控制下能分化成肌细胞、 成骨细胞、 脂肪细 胞、 神经细胞、 心肌细胞、 肺细胞等。骨髓间充质干细胞可聚 集成均匀的集落, 细胞表面蛋白如S H 2、S H 3、C D 2 9、C D 4 4、 C D 7 1、C D 9 0、C D 1 0 6、C D 1 2 0 a、C D 1 2 4等 呈 阳 性, 但C D 1 4、 C D 3 4和C D 4 5造血谱系标记则呈阴性。 5期 康新勤, 臧伟进, 宋土生, 等.大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及其形态观察 图1 骨髓贴壁细胞原代培养第7d F i g
11、 . 17 t h - d a yp r i m a r yc u l t u r eo fb o n em a r r o ww e l l - a d h e r e dc e l l s(1 0 0) 图2 骨髓间充质干细胞原代培养第1 4d F i g . 21 4 t h - d a yp r i m a r yc u l t u r eo fm a r r o wm e s e n c h y m a l s t e mc e l l s(1 0 0) 骨髓中间充质干细胞(M S C s) 的含量较低, 约为0. 0 0 1% 0. 0 1% 6。目前用于分离 M S C的方法主要
12、有四种: 贴壁 法 7、 流式细胞仪分离法8,9、 密度梯度离心法1 0和免疫磁珠 法。贴壁细胞分离法是最早的方法,是根据M S C具有在塑料 组织培养瓶中贴壁生长的特性对其进行分离; 但所得细胞的 成分复杂, 骨髓间充质干细胞的纯度不足。密度梯度离心法 是根据M S C与其他细胞的密度不同而采用P e r c o l l将其分离 出来; 使用P e r c o l l分离液密度梯度离心的方法, 能有效地将 红细胞、 白细胞和间充质干细胞分离开来, 同时操作简便快 速, 对细胞的活性影响较小。流式细胞仪分离的方法则是根 据M S C的细胞体积小、 相对缺少颗粒的特性对它进行分选。 应用单克隆抗
13、体免疫磁珠分离系统或流式细胞仪技术, 对细 胞的活性影响较大, 甚至导致细胞完全失去活性 1 1。如果采 用梯度密度离心法、 免疫磁珠法和流式细胞仪法分离单个核 细胞, 首先需要一定量的骨髓组织, 其次也需要有特殊的仪器 设备。1只1月龄S D大鼠两只股骨和胫骨骨髓组织含量较 少。经过穿刺吸取或本实验所采用的剪去骨端用培养液冲洗 所能得到的骨髓组织就更少。大鼠骨髓组织量少不足以采用 以上几种方式分离间充质干细胞。对初次培养者来说, 贴壁 法分离骨髓间充质干细胞操作简单易掌握, 不易发生污染, 是 一个较好的分离方法。贴壁分离法根据骨髓中间充质干细胞 贴壁生长, 而血细胞和造血干细胞悬浮生长的特
14、性将其分离 开来。用贴壁分离法分离出的骨髓间充质干细胞均一性不及 其他方法, 但其分化诱导特性不受影响。 在培养过程中出现的“ 细胞边集现象” 可能是因为细胞在 培养换液过程中边沿部分容易与塑料培养板黏附, 贴壁容易 所致。分离的骨髓间充质干细胞需要做生物化学分析、 免疫 组化和体内分化等进一步验证。 参考文献: 1D a v i dT o s h,J o n a t h a nM WS l a c k.H o wc e l l s c h a n g e t h e i rp h e n o - t y p eJ.N a t u r eR e vM o lC e l lB i o l,2 0
15、 0 2,3:1 8 7-1 9 4. 2S h i n j iM a k i n o,K e i i c h iF u k u d a,S h u n i c h i r o uM i y o s h i,e t a l. C a r - d i o m y o c y t e sc a nb eg e n e r a t e df r o m m a r r o ws t r o m a lc e l l si nv i t r o J. JC l i nI n v e s t,1 9 9 9,1 0 3(5) :6 9 7-7 0 5. 3R o b e r tE,M o r a y m
16、 aR,L i s aK,e t a l.M u l t i p o t e n ta d u l tp r o g e n i - t o rc e l l sf r o m b o n em a r r o wd i f f e r e n t i a t ei n t of u n c t i o n a lh e p a t o - c y t e - l i k ec e l l sJ. JC l i nI n v e s t,2 0 0 2,1 0 9(1 0) :1 2 9 1-1 3 0 2. 4D a v i dCH,W i l l i a m DH,A n g e l i
17、n eM a r t i n - S t u d d a r d .B o n em a r - r o wa sas o u r c eo f e n d o t h e l i a l c e l l sa n dn e uN - e x p r e s s i n gc e l l sa f - t e rs t r o k eJ. S t r o k e,2 0 0 2,3 3:1 3 6 2-1 3 7 8. 5D a r r e l lNK,M aB e i y a n g,W e l l i n g t o nV,e t a l. B o n em a r r o w - d e
18、 - r i v e dc e l l sa sp r o g e n i t o r so f l u n ga l v e o l a re p i t h e l i u mJ.D e v e l - o p m e n t,2 0 0 11 2 8,5 1 8 1-5 1 8 8. 6P i t t e n g e rMF,M a c k a yAM,B e c kS C,e t a l.M u l t i l i n a g ep o t e n - t i a l o fa d u l th u m a nm e s e n c h y m a ls t e mc e l lJ.S
19、 c i e n c e,1 9 9 9, 2 8 4(5 4 1 1) :1 4 3-1 4 7. 7Z o h a r R,S o d e kJ,M cC u l l o c hC A.C h a r a c t e r i z a t i o no fs t r o m a l p r o g e n i t o rc e l l se n r i c h e db yf l o wc y t o m e t r yJ.B l o o d,1 9 9 7,9 0 (9) :3 4 7 1-3 4 8 1. 8F o r t i e rL A,N i x o nA J,W i l l i
20、a m sJ,e t a l. I s o l a t i o na n dc h o n d r o - c y t i cd i f f e r e n t i a t i o no fe q u i n eb o n em a r r o w - d e r i v e dm e s e n c h y m a l s t e mc e l l sJ.AmJV e tR e s,1 9 9 8,5 9(9) :1 1 8 2-1 1 8 7. 9G h i l z o nR,M cC u l l o c hC A,Z o h a rR. S t r o m a lm e s e n c
21、h y m a l p r o - g e n i t o rc e l l s i np r o c e s s c i t a t i o nJ.L e u kL y m p h o m a,1 9 9 9,3 2(3 -4) :2 1 1-2 2 1. 1 0N u t t a l lME,P a t t o n A J,O l i v e r aD L,e ta l.H u m a nt r a b e c u l a r b o n ec e l l s a r e a b l e t oe x p r e s sb o t ho s t e o b l a s t i c a n
22、da d i p o c y t i cp h e - n o t y p e:i m p l i c a t i o n sf o ro s t e o p e n i cd i s o r d e r sJ. JB o n e M i n e r R e s,1 9 9 8,1 3(3) :3 7 1-3 8 2. 1 1F r i e d e n s t e i nA J,C h a i l a k l y a nR K,G e r a s i m o vUV. B o n em a r r o w o s t e o g e n i cs t e mc e l l:i nv i t r oc u l t i v a t i o na n dt r a n s p l a n t a t i o ni n d i f f u s i o nc h a m b e r sJ. C e l lT i s s u eK i n e t,1 9 8 7,2 0:2 6 3-2 7 2. ( 编辑 邱 芬) 915