花生种皮蜡质和角质层与黄曲霉侵染和产毒的关系.pdf

《花生种皮蜡质和角质层与黄曲霉侵染和产毒的关系.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《花生种皮蜡质和角质层与黄曲霉侵染和产毒的关系.pdf（5页珍藏版）》请在三一文库上搜索。

1、热带亚热带植物学报 2 0 0 3 ， 1 l ( 1 ) ： 1 1 - 1 4 如 o f T r o p i c a l a n d S u b t r o p i c a l B o t a n y 花生种皮蜡质和角质层与黄曲霉侵染和产毒的关系 梁炫强 周桂元 潘瑞炽 ( 1 广东省农业科学院作物研究所， 广东 广州5 1 0 6 4 0 ； 2 华南师范大学生物系， 广东 广州 5 1 0 6 3 1 ) 擒耍： 黄曲霉侵染花生的研究表明， 种皮破损的黄曲霉毒素含量显著高于种皮完整的， 种皮对黄曲霉侵染和产毒起 着重要的屏障作用。 采用氯仿去除种皮蜡质， 用 KO H或角质酶去除种皮

2、角质层后， 种子黄曲霉感染率和黄曲霉毒素 含量显著提高。种皮蜡质和角质层同时去除的与种皮破损的黄 曲霉感染率和毒素含量差异不显著， 表明种皮的抗性 成份主要是蜡质和角质层。 种皮蜡质含量测定和种皮表面扫描 电镜观察表明， 蜡质的含量和角质层的厚度与品种的 抗性有关。抗性品种种皮蜡质含量显著高于感病品种。种皮蜡质提取物在体外抑菌效果不显著， 说明蜡质的抗性作 用主要是物理性阻止黄曲霉菌的穿透。 关诩： 花生； 黄曲霉毒素； 种皮； 蜡质； 角质层 中圈分类号 ： s 4 3 5 6 5 2 文献标识 码： A 文章编号： 1 0 0 5 3 3 9 5 ( 2 0 0 3 ) 0 1 - 0 0

3、 1 l - o 4 W a x a n d Cu t i c l e o f Pe a n u t S e e d Co a t i n Re l a t i o n t o I n f e c t i o n a n d A f l a t o x i n P r o d u c t i o n b y As p e r i l l u s f l a v u s LI A N G X u a n qi a n g Z H OU G ui y ua n P A N R ui c hi ( 1 C r o p s R e s e a r c h l n t i mt e ， G M d D

4、A c a d e m y o f A g 础 S c i e n c e s ， G t l f z h o u 5 1 0 6 4 0 ， C = h i 蛆； 2 B i o l o g y D e p a r u n e r u ， S o u t h C h i n a N o r m a l U n i v e r s i t y , G u a l o u 5 1 0 6 3 1 ， a血咀 ) Ab s t r a c t ： 1 【 1 1 e e ff e c t s o f wa x a n d c u t i c l e o f p e a n u t s e e d

5、c o a t o n r e d u c i n g t h e i n f e c ti o n an d a fl a t o x i n p r o d u c t i o n b y As p e r g i l l u s j q u s 嘴S t u d i e d E x p e r i me n ts s h o we d t h a t wh e n the Wax o n s e e d c o a t Wa S r e mo v ed wi th c h l o r o f o r m o r and c u ti c l e r e mo v ed wi th K o

6、H( o r c u t i n ase ) f u n g a l inf ecti o n r a t e and a fl a t o x i n c o n t e n t in the see d s WC e s i g n i fic an t l y inc r e a s e d Afl a t o x i n c o n t e n t in s e e d s wi th wo u n d ed see d c o a t wa s h i g h e r t h a n t ha t in int a c t see d s a ft e r b e ingino c

7、u l a t ed t l l A 倒l s S c a n n i n ge l e c t r o nmi c r o s c o p i co b s e r v a tio no n s e e d c o a t rev e a l ed t h a t mo s t o f res i s t a n t see d s w e re r o u gh in a p p e a r a n c e and h a d a d und a n t wa x d e p o s i ts o n see d s u r f a c e s I t i S indic a ted t

8、h a t theWax an dc u ti c l ep l a yan i mp o r t a n t r o l ein p rev e n t i n gf u n g a l p e n e t r a ti o n Ke y wo r d s ：P e an u t ；S e e d c o a t ；Afl a t o x i n ；W ax ；Cu ti c l e 花生在收获、 贮藏和加工过程 中极易受黄 曲霉 s p e r g i l h t s l s L i n k ) 侵染并产 生黄 曲霉 毒素 ， 从 而影响花生生产 、 加工和 出 口贸易 ， 危害人们 的健

9、 康。培育抗黄 曲霉花生品种是解决花生黄 曲霉感染 最有效和最经济的途径。自美 国和 国际半干旱作物 研究所等筛选 出抗黄 曲霉侵 染 的花生种质 资源 以 来 ， 有关抗性机制和 培育抗侵染品种成为花生研究 的热点 2 1 。 剥壳后 的花生食 品在加 工、运输和贮藏 过程 收疆 日期： 2 o o 2 o 3 - 2 5 ；接 受 日期： 2 o o 2 - o 6 _ - 2 4 基金项目： 国家。 8 6 3 计划 ( 2 0 0 1 A A 2 4 1 1 5 3 )， 广东省自然科 学基金项 目 ( 0 1 0 1 1 3 )资助 中， 易受外源病菌 ( 特别是大气 中黄 曲霉 )

10、的侵袭 ， 因此种皮成为保护种子的第一道屏障。 已有一些研究认 为玉米种 子的种皮结构 与抗 黄曲霉侵染有关 。花生种皮 由表面蜡质 、 角质层 、 一 层厚壁色素细胞 、 4 5层薄壁 组织和萎缩 的外胚 乳组成 ， 因此人们推测花生种皮在抗黄 曲霉侵染和 产毒中也应起作用【1刀 。但迄今尚未有实验证实。 本 研究主要是通 过 比较 花生种子在 人工针 刺破损前后 ， 蜡质和角质层去除前后黄 曲霉侵染率 和黄曲霉毒素的变化情况，探讨种皮的抗性机制； 通过种皮蜡质含量的测定、 种皮蜡质超显微结构 观察、去除蜡质和角质层试验和蜡质体外抑菌试 维普资讯 http:/ 1 2 热带亚热 带植物学报

11、第 1 1卷 验 ， 探讨抗黄 曲霉侵 染花生 品种固有的抗性机制和 标记， 为选育抗性 品种提供理论依据。 1材料和方法 1 1 供试 材 料 共 9个 ， 其 中 5个抗黄 曲霉侵染 的花生品种为 J 一 1 1 ， V RR 2 4 5 ， P I 3 3 7 4 9 4 ， U F 7 1 5 1 3和 湛 秋 4 8 ， 4个 高感染花 生品种粤油 5 ， 粤油 1 1 4 ， 湛 油 3 0和 汕油 5 2 3 。 按常规种植 ， 收获种子及时清洗 ， 在 3 5 - 4 0 C 下 风干 ， 置 4 下保存 ， 不用任 何杀虫剂、 杀菌剂和染 色剂处理。 黄 曲霉菌株 As 2

12、8 9 0引 自中国科学院微生物研 究所 ， 该菌株在察 氏培养基 中 2 8 下黑暗培养。接 种 时用无菌水收集培养 7 - 8 d的孢 子， 1 0 0 0 0g离 心 5 mi n ， 无 菌 水 重 悬 ， 并 调 整 孢 子 液 浓 度 为 l x l 0 。 孢 子 ml 。 1 2 实 验方 法 接种 荚果手工去壳， 每个品种选取饱满、 大 小均匀无损种子 5 0粒 ， 用 5 次氯酸钠消毒 5 mi n ， 无菌水冲洗 3次 ， 并使种子含水 量达 2 0 ， 置灭菌 培养皿 中。 每培养皿中加入 1 ml 黄 曲霉孢子悬浮液 ( 1 x l 0 。 孢子 ml )， 搅拌 ，

13、 使每粒种 子均匀粘上黄 曲 霉孢子，另设无菌水处理为对照组， 2 8 下作恒温 、 恒湿( R m 0 0 ) 暗培养 ， 3次重 复。第 7天统计感染 种子数和感染率 。 种子含水量采用 A D一 4 7 1 5红外快 速水分测定仪测定 。 种子黄 曲霉毒素 B 含量 的测定 采用 酶联 ( E L I S A ) 方法检测 ， 黄 曲霉毒素 B 测试盒购 自江 苏 省微生物研究所。将接种后培养第 7天 的 9个 品种 的种子用 7 0 乙醇表面消毒 ， 于 1 1 5 下烘干 ， 粉碎 过 2 0目筛 。 每个 品种分别准确称取 2 g样品置于磨 口试管中， 并按测试盒使用说 明检测每份

14、样 品黄 曲 霉毒素 B 含量。三次重复 。 种皮蜡 质含量 的测定 参照 R u s s i n t6 1 方法 ， 选取饱满 ， 大小均匀和无损种子 ， 小心剥取种皮。每 个 品种准确称取种皮 5 0 g ， 浸在氯仿中 6 0 S ， 取 出种 皮 ， 氯仿蒸 发后测 定种皮蜡质 的残 留量 ， 并据此推 算每个品种种皮 的蜡质含量 ( 1 a gmg 种皮 ) 。 种皮蜡质体 外抑菌鉴 定 按 R u s s i n t6 1 方法 ， 每个品种取 1 0 0 g种子浸在氯仿中 6 0 S ，取出种子， 氯仿蒸发至干后 ，残 留的蜡质用 3 ml 的氯仿再溶， 加入 已配制好的 4 5

15、 察 氏培养基中 ， 并调整每品种 蜡质 的含量 为 1 mg ml ， 倒 入培养皿 中 ， 在无菌箱 中放置 2 h ， 让氯仿挥发 。在培养皿中心加入 l 0 u l 黄 曲霉孢 子液 ( 1 0 个孢 子 ml 。 )， 置于 2 8 下黑暗 培养 ， 2 d后测量黄 曲霉菌落的直径 。以不加氯仿的 察氏培养基为对照， 3次重复。 种皮角质 层和蜡质 抗黄 曲霉 的测定 参 照 Gu o t 方法 ， 种子在 0 1 mo l L K OH液中浸 3 0 mi n去 除角质层后 ， 蒸馏水冲洗 3次， 3 5 - 4 0 C 风干 。参照 R u s s i n t 方法 ， 种子在氯

16、仿中浸 6 0 S 去除蜡质， 氯仿 自然挥发后， 1 3 种子直接接种； 1 3种子在 0 1 mo l L K OH 中浸 3 0 mi n去除角 质层 ，蒸馏水冲洗 3次， 3 5- 4 0 C风 干 ； 1 3种 子 在 室 温 下 用 角 质 层 酶 d0 0 la gml ) 处理 2 h ， 蒸馏水冲洗 3次， 3 5 - 4 0 C 风 干 。 去除种子的角质层和蜡质后，按 1 2方法测 定 种子感染率 。 种皮蜡质结构和分布的观察 种子在 3 5 下 风干 3 d ， 每个品种选发育程度一致的种仁 l 0 个 ， 在相 同的部 位 取 1删 种 皮 ， 置 于 铝 柱上 ，

17、喷上 金 钯 ( 2 0 n m厚)， 进行扫描电镜观察。 2结果和分析 2 1黄 曲霉的感染率和黄曲霉毒素 B - 含量 9个参试花生 品种接种 7 d后 ，黄 曲霉平均感 染率和产生的黄曲霉毒素 B 含量见表 1 。按国际花 生黄 曲霉感染测试标准 ， 广东地方农家种 “ 湛秋 4 8 ” 和印度花生品种 “ J 一 1 1 ”的平均感染率低 于 2 0 ， 属 高抗侵染 品种 ； 美 国品种 “ UF 7 1 5 1 3 ” ， “ VR R 2 4 5 ” 和 “ P I 3 3 7 4 9 4 F ”感 染 率低 于 3 0 ， 属 中抗 侵 染 品 种， 其它 4个 品种感染率超过

18、 7 0 ， 属高感品种 。 所有品种接种后均检测到黄 曲霉毒素 B ， 但抗 侵染品种的 B 含量明显 比感病 品种低 ，通常低 4 一 l 0倍 。抗性 品种 “ I J 1 l 5 l 3 ” 最低 ( 4 5 8 p p b )， 而感 病品种 “ 粤油 5号 ” 最高， 达 3 9 8 1 p p b( 表 1 )。 表 l接种黄 曲霉后不 同花生品种种子的平均 感染率和黄 曲霉毒素 B ， 的含量 T a b l e l I n f e c t i o n r a t e a n d a fl a t o x inB - c o n t e n t i n p e anu t s

19、e e d s o f v a r i o u s c u l ti v a r s i n o c u l a t e d、 t h A s p e r g i l l u s fl a v u s a ft e r 7 d a y s 维普资讯 http:/ 第 l 期 梁炫强等： 花生种皮蜡质和角质层与黄曲霉侵染和产毒的关系 l 3 经方差分析 ，抗 - 感品种之间黄曲霉平均感染 率和黄 曲霉毒素含量达极显著水平，表明抗 - 感 品 种对黄 曲霉侵染和产 毒的抗性存在显 著的遗传差 异 。 2 2 种 皮蜡 质 含量 与蜡 质 提取 物 采用氯仿处理花生干种子 6 0 S 后 ，经 电镜

20、扫描 观察 ( 图版 I ： K) ， 可发现种皮表面原有的蜡质层 已 不存在， 表明用氯仿处理可完全去除种皮上的蜡质 。 抗 - 感品种种皮蜡质含量测定， 经方差分析， 抗 - 感品种种皮蜡质韵含量存在显著的差异( 表 2 。所有 抗性品种种皮蜡质的含量均 比感病 品种高， 而且达 显著水平 。其 中以 “ J - l l ” 种皮蜡质含量最高， 达 2 6 5 3 u g mE 。 裹 2花 生种 皮螬质对体外抑菌 的影 响 T a b l e 2Th e e ffe c t of wa xi np e a n u t s e e dc o a to nt h e r e s i s t

21、a n c et oA W t e s t e d n v t r o 新 复极差 测验 Du n o a n ts t e s t ， q= o 0 5显著水平 ， 具有相 同字 母 表 示差异不显著 。 Me a n s inthe col u mnf o l l o w e db ythe s a me l e t t e r a r e n o t s i g n i fi c a n t l yd i ff e r e n t a c c o r d i n g t oDu n o a n ts t e s t ( q= o 0 5 ) 在含有蜡质 的培养基 中， 黄 曲霉菌落生长直

22、径 越小， 抑制效果越 明显。从表 2可见 ， 黄 曲霉在含有 9 个品种种皮蜡质提取物的培养基中产生的菌落直 径大小有一定差异 ， 但经 方差分析 ， 品种之 间， 品种 与对照之间的差异不显著 。表明花生种皮蜡质提取 物对抑制黄 曲霉 的生长并不明显，且抗 - 感 品种的 差异不显著 。 2 3去除蜡质或角质层对花生种仁黄 曲霉感染和产 毒的影响 采用 1 mm 针头将种皮刺破后 ，所有 品种黄 曲霉感染率和黄 曲霉毒素 B- 含量均显著增加 ， 表明 种皮是抗黄 曲霉侵染和产毒的重要屏障。 用氯仿去除种皮 的蜡质后 ， 所有参试 品种的种 子萌发率没有发生变化 ， 但黄 曲霉感染率和黄

23、曲霉 毒素 B- 含量均显著增加 ， 这表明去蜡能显著地提高 种子对黄曲霉感染率和产毒 的敏感性 ( 表 3 )。 抗性 品种感染率平均增加 l 倍， 黄曲霉毒素 B - 含量平均 增加 6 2倍； 而感病 品种感染程度略增加， 黄 曲霉毒 素 B- 含量平均仅增加 1 3倍 。 这表明抗性 品种种皮 蜡质在抗 黄 曲霉侵染和产 毒 中发挥 的作用 较感病 品种要大。 用 K O H处理去角质层后， 9 个品种黄曲霉毒素 B- 的累积量较未处理组平均高 5 8倍 ，比去蜡处理 组平均高 2 6倍 ( 表 3 )， 表明角质层在种皮抗性 中 发挥的作用 比蜡质大 。种皮 去角质层后 抗性和感 病

24、 品种的黄 曲霉毒素 B - 累积量分 别 比未处理组增 加 7 1和 5 5倍 ，表 明抗性品种 角质层 的抗黄 曲霉 裹 3 氯仿 、 KOH、 角质一处 理后 花生种子黄 曲霉侵 染率( I R) 和黄曲霉毒素 B 含 量( A) 的变化 T a b l e 3 C h a n g e sini n f e c t i o n r a teO R) and a fl a tox i nBI c o n t e n t ( A】 a ft e r t r e a U n e n t wi thc h l o r o f o r m， K OHand l t ina s ef o r p e

25、 a n u t s e e d s 维普资讯 http:/ 1 4 热带亚 热带植物学报 第 1 1 卷 能力 比感病品种强。 如同时去 除蜡质和角质层 ， 即用氯仿处理去蜡 质后， 再用 K0 H或角质酶处理去角质层 ， 黄 曲霉感 染率和黄 曲霉毒素 B - 含量均显著增加 ( 表 3 ) 。用 氯仿 + KOH处理和用氯仿 +角质酶处理所获 的效 果差异不显著。感病 品种处理后黄 曲霉感染率和黄 曲霉毒素 B- 含量与种子 破损处 理的差异不显 著 ； 而抗性 品种 的差异达显著水平 ， 表 明抗性品种除种 皮外还存在其它的抗性机制。 2 4 各品种的种皮螬质超显微结构的差异 在 电镜

26、下 ， 种皮表面 的蜡质呈 白色 。 从图版 I 可 见 ， 花生种皮蜡质呈不均 匀和不规 则分布 ， 大部分 品种种皮的蜡质分布于种皮气孔周 围， 品种间种皮 的蜡质结构和分布存在较大差异。 从 图版 I ： A D可见 ，感病 品种种皮 的蜡质很 少， 且稀薄。而抗性品种的蜡质较多， 且较厚， 大部 分蜡质分布于种皮气孔周 围， 并将气孔封 闭 ( 图版 I ： E - L) ， 阻止病原菌丝 的侵入。 3 结语 本研究表明花生种皮在抗黄 曲霉侵染和产毒 中发挥机械性阻碍作用， 而起作用的主要成份是种 皮的蜡质和角质层 。品种抗黄 曲霉侵染能力与种皮 表面所覆盖 的蜡质的多少、 角质层厚度

27、有关 。种皮 表面蜡质和角质层厚度可作为花生抗黄 曲霉育种 的辅助标记之一 。 参考文献 【 I 】 L i a n gXQ ( 梁 炫 强) ，P a nRC(潘 瑞炽 ) ，Bi n JH( 宾 金 华) F a c t o r s a ff e c t i n g p r e h e r v e s t a fl a tox i n p r o d u c t i o n i n p e a n u t 【 J 】 C h i n J O i l C r o p s S c i ( 中国油料作物学报) ， 2 0 0 0 ， 2 2 ( 4 ) ： 7 2 - 7 8 ( i nC in

28、n e s e ) 2 】 L i a n gXQ( 梁炫 强) ， P a nRC( 潘瑞炽) ，B i n J H( 宾金华) Ad v a nc e t he me f h a n i s m o f r e s i s t a n ce t o a fla tox i n c o n t a mi n a t i o ni np e a n u t r a c h i s h y p o g e L )【 J 】 C h i n JOi l C r o p s S c i ( 中国油料 作物学报 ) ， 2 0 0 0， 2 2 ( 3 ) ： 7 7 - 8 0 ( in C h i

29、 n e s e ) 【 3 】 B i anc h i G J ， Av a t o P S u r f a c ewa x c s f r o m g r a i n ， l e a v e s ， andh u s k s o f ma i z e ( Z e a砷 L ) 叨 C e r e a l C h e m， 1 9 8 4 ， 6 8 ： 1 5 7 7 - 1 5 8 4 4 】 Gu oB Z ，R t a in J S ， Cl e v e l andT E r o l e o fthe p e r i c a r p o f c o r n k e r n e l s

30、 t o r e d u c e i n f e c t i o n and a fl a tox i n p r o d u c t i o n b y As p e r s i U u s l $ 【 J 】 P h y top a tho l ， 1 9 9 3 ， 8 3 ： 1 4 1 7 1 4 1 8 【 5 】 G u o B z R u s s i n J S ，T h o ma sE Wa xandc u t i nl a y e r s mma i z e k e r n e l s a s s o c i a t e d t h r e s i s t a nce to

31、 a fla tox i n p r od u c t i o n b y As p e r g i U u s 伽l $ 【 J 】 J F o o d P r o t , l 9 9 5 ， 5 8( 3 ) ： 2 9 6 - 3 0 0 【 6 】R u s s i n J S ， G u oB Z ， T u b a j i k a K MCo mp a r i s o n o fk e r n e l w a x f r o m c o r ng e n o t y p e s r e s i s t a n t o r s u s c e p t i b l eto As pe

32、r g i Uu s l $ 【 J 】 P h y top a t h o l ， l 9 9 7 ， 8 7 ： 5 2 9 - 5 3 3 【 7 】 L i a n gXQ，P an RC S t u d i e s O nthe me c h a n i s m o f r e s i s t a n c eto a fla t o x i n c on t a mi n a t i 6 n an d d e ve l o p me n t o f h o s t r e s i s t a n ce p e a n u t 【 A】 I n ： S h a n d o n g P

33、e a n u t Re s e a r c h I n s ti t u t e Ne w Mi l l e n n i u m Int e r n a t i o n a l Gr o u n d n u t Wo r k s h o p 【 C】 Q i n g d a o ： 2 O 01 6 6- 7 0 图版说明 图版 I 花生种皮表面蜡质电镜扫描图 A 粤 油 5号；B 湛油 3 0 ；C 粤 油 l 1 4；D 汕 油 5 2 3 ；E P I 3 3 7 4 9 4 F ； F J 1 l ；G VR R 2 4 5 ；H UF 7 1 5 1 3 ；L湛秋 4 8 ；J J

34、 1 l ； J - I l 氯仿 处理； L V 】 匕4 5A -_ I 、 l ( ，3 0 0 0 ；J 、L ，20 0 0 Ex p l a n a t i o no f p l a t e Pl a t eI SEM o f懈O U s e e dc o a t s u r f a c e so fp nu t c u l t i v a r s A Yu c y o u 5 ：Btn y o u 3 0；CYu o y o u l I 4；DS h a n yo u 5 2 3； EPI 3 3 7 4 9 4 F；FJ - I l ：GVRR2 4 5 ；HUF7 I 5I 3； L Zh a n q i u 4 8； J J 1 l ：K J - Ilt r e a t e d、 i t h c h l o r of o r m； L VRR2 45 Ato I an dl ( 3 0 0 0 ； J andL 。 2 0 0 0 囊 逡、 维普资讯 http:/ 粱 Ll 维普资讯 http:/