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1、DNA转化【摘要】：本实验首先通过CaCl2法将大肠杆菌DH5a制成感受态细胞，然后将带有氨苄青霉素抗性基因的pUC-19质粒转化进该感受态细胞，最后将转化后的细胞接种到含氨苄青霉素的LB培养基上培养，没有被转化的菌不能生长，而被转化了的大肠杆菌可以正常生长，形成蓝色菌落。【关键词】CaCl2法 感受态细胞 DNA转化 质粒pUC19 Vector 大肠杆菌DH5aDNA TransformationLiu wang（School of Life Science,Lanzhou University）Abstract:In this experiment, we firstly made E.
2、 coli DH5a into competent cells by the CaCl2 method, and then the plasmid with the ampicillin resistance gene of pUC-19 was transformed into these competent cells, finally we inoculated the transformed cells on LB solid medium. The bacteria that have not been transformed can not grow, but the bacter
3、ia have been transformed can grow into blue colonies.Key words CaCl2 method DNA transformation plasmid pUC19 Vector E.coli DH5引言：DNA转化是将外源DNA分子导入原核细胞的过程。能够接受外源DNA的细胞称为感受态细胞，一般细菌很难接受外源DNA分子，需用适当的方法处理将受体细菌制成感受态细胞。制备感受态细胞最常用的的方法有CaCl2法、电击法、病毒法等，本实验采用CaCl2法制备感受态细胞，从而完成DNA的转化。实验原理本实验首先通过CaCl2法将大肠杆菌DH5a制成
4、感受态细胞，然后将带有氨苄青霉素抗性基因的pUC-19质粒转化进该感受态细胞，pUC-19质粒带有氨苄青霉素抗性基因，而宿主菌DH5对氨苄青霉素没有抗性。在用pUC-19质粒转化DH5 后，涂布到含有氨苄青霉素的培养基上培养，没有被转化的菌不能生长，而被转化了的菌可以正常生长，形成蓝色菌落。实验试剂、器材和材料1试剂LB液体培养基 LB固体培养基 200mg/mL IPTG 80mg/mL X-gal 50mg/mL氨苄青霉素 0.1mol/L CaCl22器材高压灭菌锅 恒温振荡培养箱 恒温培养箱 台式离心机 超净工作台3实验材料大肠杆菌DH5 质粒pUC19 Vector方法和步骤1.制作
5、选择平板按配方配好LB固体培养基，经高压灭菌后，冷却至50，加入氨苄青霉素使其最终浓度为60g/mL，倒两个平板。分别在两个平板的培养基的表面涂布40l X-gal贮备液（80mg/ml）和4l IPTG贮备液（200mg/ml），室温下放置34h。2.制备感受态细胞2.1取大肠杆菌DH5划线培养过夜的单菌落接种到20mlLB液体培养基中，置37摇床于280rpm振摇培养约3-4h。 2.2将细菌转移到一个无菌离心管中，冰上放置10min，使培养物冷却到0。 2.3以4000rpm离心10min，回收细胞，弃上清，将管倒置使残留的痕量培养液尽量流尽。2.4以1.5ml冰冷的0.1mol/L C
6、aCl2悬浮沉淀。2.5以2000rpm离心10min，回收细胞且使培养液流尽。2.6取1ml冰冷的0.1mol/L CaCl2悬浮细胞，将细胞分成200l一份，装入Eppendorf管中，置4冰箱备用。此时的细胞为感受态细胞。3. DNA转化3.1取2管200l的感受态细胞，1管中加入1l的pUC-19 DNA ，另1管为不加质粒DNA的对照，轻轻旋转以混匀内容物，冰上放置30min。3.2将管放到42水浴中1.5min，不要摇。然后在冰浴中迅速冷却 2min。(热激反应)3.3每管加入100l LB培养基，37水浴中温育45min。 4.观察结果倒置平皿37培养12-16h，第二天上午观察
7、结果，记录现象，并计算转化率。（转化率= 菌落数ug DNA)。实验结果图1 转化平板（右）及对照平板（左）菌落生长情况 实验结果：左侧对照平板中没有菌落出现，右侧转化平板中有数以千万计的蓝色菌落。结果分析：右侧平板上转化后的大肠杆菌DH5含外源质粒pUC19 Vector，pUC-19质粒带有氨苄青霉素抗性基因，故其能在含有氨苄青霉素的培养基上生长；左侧平板上未经转化的宿主菌DH5对氨苄青霉素没有抗性，不能在含有氨苄青霉素的培养基上生长。质粒载体与Lac Z基因上缺失近操纵基因区段的-半乳糖苷酶阴性的大肠杆菌突变体通过-互补作用形成有活性的-半乳糖苷酶，将底物X-gal水解生成蓝色产物，故菌
8、落为蓝色。实验讨论1. 蓝白斑筛选的原理是什么？ pUC-19质粒带有一个大肠杆菌DNA的短区段, 其中含有-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的调控序列和头146个氨基酸的编码信息。 DH5宿主菌染色体上带有Lac Z的C端部分编码信息，它们编码的肽段各自都不具有酶活性, 但它们在同一细胞内可以通过非共价键结合起来, 形成具有-半乳糖苷酶活性的蛋白质。有活性的-半乳糖苷酶，将底物X-gal水解生成蓝色产物，故菌落为蓝色。当外源DNA片段插入到质粒的多克隆位点后，将产生无-互补能力的质粒，由这种重组质粒转化的大肠杆菌形成白色菌落。（本实验未制备重组质粒，故没有形成白色菌落。）2. 对照平板中如果出现
9、菌落会是哪些原因?可能原因：（1）对照平板中忘记加入氨苄青霉素或浓度不够。（2）空气中有氨苄青霉素抗性的细菌污染了对照平板。（3）接种用的接种棒混错，故将转化后的细菌带入了对照平板。3实验组菌落没有转蓝是什么原因？可能原因：（1）实验平板中忘记加入底物X-gal或其浓度过小。（2）空气中有氨苄青霉素抗性的细菌污染了对照平板。但这种细菌没有将底物X-gal水解生成蓝色产物的能力，故形成白色菌落。4. 实验和对照组均出现菌落是怎么回事？ 实验平板上转化后的大肠杆菌DH5含外源质粒pUC19 Vector，pUC-19质粒带有氨苄青霉素抗性基因，故其能在含有氨苄青霉素的培养基上生长。对照平板上未经转化的宿主菌DH5对氨苄青霉素没有抗性，不能在含有氨苄青霉素的培养基上生长。若对照组也出现菌落，可能的原因有：（1）对照平板中忘记加入氨苄青霉素或浓度不够。（2）空气中有氨苄青霉素抗性的细菌污染了对照平板。（3）接种用的接种棒混错，故将转化后的细菌带入了对照平板。【参考文献】 生物化学与分子生物学实验 主编 沈建敏 兰州大学出版社 现代分子生物学 主编 朱玉贤 李毅 郑晓峰 高等教育出版社【感谢】 感谢沈喜、张华、易静老师的清晰讲解与耐心指导；感谢全班同学间的相互合作；感谢同组同学的真诚帮助，有了大家的合作与相互帮助，才能顺利完成此次实验。