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1、基于文献 Adaptive Evolution of Eye Degenerationin the Mexican Blind Cavefish 的报告,关于墨西哥丽脂鲤的研究,关于墨西哥丽脂鲤Astyanax fasciatus mexicanus,别称：乔氏丽脂鲤。 墨西哥丽脂鲤分类学上隶属于脊椎动物门辐鳍鱼纲脂鲤目脂鲤科丽脂鲤属，产于墨西哥。 墨西哥丽脂鲤是仅有的几种未被列入濒危物种的穴居动物之一。它们可以被买卖，可以作为一种稀奇的观赏鱼被养在水族馆中。,体长大约8厘米，身披银色鳞片，鳍部呈现奶油色。,世界范围内约80种不同的洞穴鱼类是从地表生活的祖先演化而来的，但大多数情况下，它们的祖
2、先已经消失了。 墨西哥丽脂鲤，被认为是从如今还能够在墨西哥格兰德河中看到的普通脂鲤进化而来的洞穴鱼种。跟它的祖先相比，很多性状都难以区别，除了洞穴种视觉和体色的退化。,为什么研究墨西哥丽脂鲤,已知的洞穴动物有很多种，其中鱼类也非常多，但是墨西哥丽脂鲤是绝好的研究材料，因为它与自己现存的祖先之间保留了很紧密的联系。同时拥有演化生物的祖先和派生形式能使我们很好的研究演化。 美国马里兰大学的杰弗里教授等生物学家第一次找出了这种鱼在行为、基因和演化之间的关系，他们研究行为学和基因学上的改变是如何导致墨西哥丽脂鲤的演化，该研究是研究生物演化的一个范例。,洞穴鱼是浮游鱼演化而来的证据,墨西哥丽脂鲤的洞穴种
3、和地表种是完全可以交配的，尽管在自然环境下两者的生活环境是被隔离的，这种对立的差异说明洞穴类型可能是在一万年前由地表种类演化而来。造成这种演化的契机也许是一些地表鱼被洪水冲入洞穴，从而在洞穴开始生活，渐渐产生了适应性进化。,行为学的研究,伴随着对洞穴生活的适应，地表鱼的特征性行为逐渐消失了，这种变化被认为可能是导致视觉退化的第二因素。 洞穴鱼和地表鱼的许多行为都是不同的，其中觅食行为的显著改变进化中非常重要的一个环节。,地表种通常通过视觉在水层中觅食，当需要在黑暗环境中在底层觅食时，它们的体轴几乎与地面垂直，然后轻轻的转动身体搜索一个很有限的区域。 洞穴鱼几乎从不在水层中觅食，它们在水底觅食时
4、，体轴与水底呈45角，这使得它们不用像地表鱼那样转动身体就能扫描底部一个较大的区域,与这种觅食行为相适应的是洞穴鱼的头部和口部也出现了与地表鱼不同的性状。 洞穴鱼口的尺寸更大，并增加了口部和咽部的嗅觉器以及颌齿的数量，颅脑神经丘数量和区域的都有所增加，可能是为了在黑暗中游泳时避开障碍物。骨骼结构也有一些改变，包括颅骨的尺寸、形状和组织，个别的围眶骨都发生了改变。与地表鱼相比，洞穴鱼的脊椎要少1或2节，身体的形状也更加扁平。 这种适应性可能是在洞穴中的岩石碎屑中搜寻食物更有效的一种策略，在室内实验室的模拟自然条件下，同时生活在一个黑暗的鱼缸，洞穴鱼类比它们的地表祖先要更加容易找到食物,发育学的研
5、究,进化的改变最先始于发育。因此，发育学的研究可以为研究动物的进化提供线索。 1958年卡恩第一次对丽脂鲤的地表种和洞穴种在发育过程中做了比较，在组织学的研究中她发现洞穴种的胚胎中是有眼球原基的，在幼体时期却消失了。,脊椎动物眼的发育过程都是相似的，其中一个形态学的特征是眼泡的出现，即在发育中脑的左右边缘各出现一个突起的泡状组织，随着眼泡外胚层细胞的扩展，向心端伸展成视柄，陷入末端的细胞形成视杯。与此同时，位于外胚层视泡边缘的细胞层还是变厚形成晶状体基板。眼部原基由晶状体、视杯层和位于内部的视网膜和位于外部的上皮色素细胞层共同构成。士兵细胞在发育的晚些时候连接视网膜和脑部视区的轴突神经。,这个
6、时期被认为是眼睛发育的重要的增殖阶段，处在晶状体和视杯中的细胞一直处在分裂期，而在视网膜中大量的细胞分化成不同的细胞层。 眼睛发育的第二个时期被称作生长周期，因为每个组织都从干细胞中得到大量的细胞。在硬骨鱼中，眼睛的生长周期贯穿一生，好像它们的眼睛对身体的比例一直在增加一样。,发育中的眼睛从颅脑中的神经嵴中获得新的细胞，这些细胞移动进视区中对形成晶状体外的组织和视杯做出贡献。虹膜和睫状体部分是神经嵴的衍生物，角膜由外胚层表面的细胞和渗透进外胚层的神经嵴细胞联合发展而来。连接眼睛外层细胞和内部结构的是一层软骨组织，即巩膜，是由迁移的颅脑神经嵴细胞发育而来的。,起初洞穴鱼的眼睛发育似乎和地表鱼一样
7、遵循这一过程。只是洞穴鱼的眼原基相对地表种要小一些。 从生长周期开始，洞穴鱼的眼部发育开始与地表鱼背道而驰。 首先，初级和次级纤维细胞并不完全分化，并且，位于中央的晶状体蛋白纤维也不形成。 其次，尽管在视网膜中神经细胞和神经胶质细胞都分化出现，视紫红质细在视杆细胞中的表达似乎也没有明显缺陷，但是色素细胞并不分化。 最后，角膜、虹膜和睫状体并不发育，尽管神经细胞移动进入视区，巩膜出现，但并不是像地表种那样的的软骨质，而是完全骨化僵硬的。,在洞穴鱼眼睛发育的生长周期，眼睛结构的缺失和身体其他部分的迅速分化导致眼睛被身体其他组织淹没，证据是洞穴鱼类消失的眼睛都被边缘的皮肤覆盖围绕。,眼部退化过程的研
8、究,发育学的研究向我们展示了洞穴鱼的眼睛消失是一个连续的过程，这些证据不足以支持由于基因丧失功能引起的眼部退化的进化模型。 研究眼部进化的方式可以提供更多的眼部退化的线索，尽管早期对眼睛的退化主要基于部分结构的组织学研究和超微结构分析，但是没有在时间和空间的参数上描述这一过程。,新的研究实用端粒标记的方法分析凋亡的细胞，分步再现了眼睛退化的过程,图为洞穴鱼发育36小时的胚胎，用末端标记法可以看到晶状体首先出现了细胞凋亡。即为箭头标注的位置,同一时期的地表种的晶状体细胞处在分化增殖的状态，而洞穴鱼的晶状体细胞更倾向于凋亡。 继晶状体细胞之后，洞穴鱼的眼部其他组织也开始出现凋亡的细胞，然后，视网膜
9、的细胞开始凋亡，一旦凋亡开始，随后在发育中的晶状体和视网膜中细胞就开始连续不断的进行下去,用PCNA标记DNA分子的方法显示了，在洞穴鱼的发育过程中，眼部在正确的位置也会产生新生的细胞，视网膜和晶状体的细胞也在不断进行着增殖，但是由于眼部组织整体的体积并没有增加，所以凋亡首先在新生的细胞中开始，因此新生的细胞并没有对眼睛的形成产生作用，它们在分化前就已经死亡了。最终，由于细胞凋亡的速度远大于细胞分化的速度，导致在成体的洞穴鱼没有晶状体的产生。但是由于发育期的细胞增殖，视网膜或多或少还有一些残存。,晶状体移植实验的研究,为了确定究竟是晶状体还是眼部其他组织在细胞凋亡中起主要作用，可以用晶状体移植
10、实验来研究。 在地表种的晶状体泡刚形成之时，将其取出并移植到处在同一发育阶段的洞穴鱼的视杯中。同样的，把洞穴鱼的晶状体泡移植进地表鱼的视杯中。为了便于对比，移植只在一边的眼睛中进行，留下另一边的眼睛。,实验结果显示：移植了地表种眼原基的洞穴鱼胚胎的眼睛并不退化，并且继续生长，视网膜和感光细胞也正常分化，角膜、睫状体以及虹膜也会按时发生，巩膜也会正常僵化，所有特征都显示与正常的地表种眼睛发育一样。相反，被移植了洞穴鱼眼原基的地表种胚胎眼睛发育变得迟缓，开始细胞凋亡，最终被身体其它组织淹没。 最终结果是被移植的一侧都显示出完全不同的表现型，地表种被移植的一侧显出眼部缺失的现象，洞穴种被移植的一侧则
11、发育出了完整的眼。,如图所示：移植实验的结果,A图所示是洞穴鱼的正常一侧，B图所示是被移植地表鱼眼原基的一侧。,E图所示是地表鱼正常的一侧，F图所示是被移植洞穴鱼眼原基的一侧。,因为晶状体的发育是自主的，这些结果说明晶状体细胞凋亡是眼睛退化的主要原因。 在地表鱼的发育期间，晶状体产生一种信号导致眼睛一步步发育和分化，在洞穴鱼中可能是这种信号的缺失导致眼部退化。 实验结果也说明洞穴鱼的晶状体凋亡是早就预设的，至少是在移植前就已经预设好了。,基因表达模式的研究,对于基因的研究，首先是采用显示分析表达的DNA序列的差异，然后通过微芯片比较地表鱼和洞穴鱼的转录本的差异，令人意外的是，两种结果都显示洞穴
12、鱼的很多基因表达水平要高于地表鱼。这个结果使得一些学者提出的洞穴鱼的眼睛退化是为了减少能量损耗的理论失去了证据。 最新的研究方法是先比较候选基因（筛选出对眼睛发育有重要作用的基因），目前已经比较了包括转录因子、编码蛋白质的结构基因等150多个个体的基因。 后面将详细讨论个别基因的表达模式。,原位杂交检测的结果显示大多数基因的表达模式并没有显著的变化，例如，在洞穴鱼的晶状体和视网膜中，转录因子Prox1的表达是正常的。视蛋白基因在洞穴鱼中也是正常表达的。这些结果显示了，在洞穴鱼类的眼睛发育中，功能基因甚至包括控制区的结构基因的功能是不会发生改变的。 但是，在洞穴鱼中，有一些基因有着特殊的表达模式
13、。 一个基因具有Hsp90分子伴侣，正常情况下在洞穴鱼和地表鱼中都会表达。然而，当洞穴鱼开始进行细胞凋亡时，它的表达异常活跃。研究显示，当它的表达被抑制后，洞穴鱼的细胞凋亡也会停止，视网膜会在一定程度上恢复分化。这个结果说明Hsp90的活化作用是洞穴鱼眼部退化和晶状体细胞凋亡的必需条件。但是具体作用还不清楚。,K图所显示的是地表鱼胚胎眼部截面中hsp90的表达区域 L图显示的是同一时期洞穴鱼胚胎眼部截面hsp90的表达区域。可以看出在洞穴鱼中，hsp90的表达要活跃的多。,在脊椎动物包括斑马鱼的神经胚时期，pax6会在晶状体基板和视泡原基中表达，可见pax6编码的转录因子在调节眼部发育中有着非
14、常重要的作用。眼泡的结构有视杯和视柄两个部分组成，这两个部分分别受到pax6和pax2的调节作用。Pax6作用于视杯的发育，而pax2控制视柄的发育。推测这两个转录因子之间有着拮抗作用。这就能够解释杰弗里教授曾经观察到的，在洞穴鱼的眼部发育中，视杯缺失后，能在腹侧形成更大的视柄区域这一现象。,山本等人发现，在洞穴鱼的眼部发育中，pax6的表达模式相对于地表鱼果然是有着细微的变化。第一，在洞穴鱼的晶状体基板中，pax6的表达有所减少；其次，对比地表鱼和洞穴鱼的pax6的表达区域，洞穴鱼的相对更小。这表明在洞穴鱼的胚胎中，pax6基因的表达模式有所缓和。 与之相应的是pax2的表达模式的改变，在最
15、近几年的研究中，山本等人发现pax2a在洞穴鱼胚胎中的表达区域在尺寸上有所增加。 因此推测，洞穴鱼眼睛退化的机制之一是pax6和pax2的相互作用导致视泡结构改变。,从图上能更加清楚的看到这种改变,E图显示的是地表鱼pax6的表达区域，F图显示的则是洞穴鱼的表达区域。 G和H是从另一个切面看pax2a的表达区域。Pax2a的表达区域在视泡（optic vesicles）基部。,Hedenhog 信号的重要作用,对于脊椎动物的眼睛发育过程，还有一个设想，假定视杯最初形成于中间的信号区域，然后被胚胎中间出现的Hh信号分开，形成两部分，继而发育成两个眼睛。因此，在正常的眼睛发育过程中，Hh信号阻断p
16、ax6在中间区域的表达，是形成两边正常眼睛的必要条件。支持这一论断根据是，在人类和小鼠身上，Shh（脊椎动物体内的Hh信号基因）的突变会导致独眼畸形，即在中间位置发育成一只单独的眼。,在硬骨鱼中，有两个Hh信号基因：Shh和twhh,这两个基因有重叠的表达模式，因此在硬骨鱼中，这两个基因的正常表达可能是两边眼睛完全分开的必要条件。 详细对比洞穴鱼和地表鱼这两种基因的表达区域，可以发现，在神经胚阶段，shh和twhh的表达区域在洞穴鱼的胚胎中有一个扩充。在洞穴鱼中，shh基因表达最宽的地方有十个细胞的宽度，而在地表鱼中，只有六个细胞。,A图显示的是地表鱼的shh信号基因表达的区域。B图显示同一时
17、期洞穴鱼的表达区域。可以看出洞穴鱼的表达区域要略微大一些。,通过功能性的实验可以了解这种表达区域的扩增有着什么样的意义。 山本等人将hhmRNA注射到地表鱼卵和早期卵裂的胚胎一侧，然后，shh的表达在胚胎中线上开始扩充，在眼泡里表达的pax6被抑制，随后的发育中，shh的表达不对称扩充，在扩充表达的一侧，眼睛的发育开始改变，形成的眼泡更小，腹侧结构缺失。当这些胚胎长成后，被注射的一侧眼睛缺失，集中光线照射也不引起反应。,通过增加hh基因的表达水平使得地表鱼最终模拟出洞穴鱼的表型，说明Hh信号在眼睛的发育中有着很重要的作用。 通过末端标记法拍摄被注射的胚胎的图像显示晶状体的凋亡发生在被注射的一侧
18、，意味着Hh信号可能控制着晶状体细胞凋亡之后的眼睛退化的过程。 尽管hh基因是怎样控制晶状体细胞凋亡的 还不是很清楚，但是hsp90的活跃表达说明它可能是hh信号下游的重要目标产物。,左侧被注射了的地表鱼的胚胎,E图中蓝色区域是shh信号基因的表达区域，红色是pax6的表达区域。 图上可以看出pax6的表达在左侧，也就是被注射的一侧被抑制，发育中形成的眼部结构要小与没有被注射的一侧。,结论,对于洞穴动物的眼睛退化，历史上有过很多假说，这些假说在或多或少都有一些支持的论据或者实验数据，也有很多学者深信不疑。 但是，本文中所提到的实验却在某些程度上都否定了这些假说，包括中性突变假说，能量节约假说。
19、自然选择假说看上去似乎要更可信一些，但是也有一些现象是它无法解释的。,中性突变假说认为眼睛的退化来源于形成眼睛的基因的随即突变导致功能消失，随后由于遗传漂移的作用保持了下来。然而试验表示，大多数作用眼部的基因并没有失去功能，有些甚至更加活跃。而且在洞穴鱼中并不是一直没有眼睛，在胚胎期是有正常的眼原基形成的，这都是中性假说无法解释的。,能量节约假说认为在洞穴种的动物生存压力要大于其他生境，因此身体将会向着节省能量消耗的方向发展，眼睛是极度复杂的器官，不形成眼睛可以节省很多能量用于其他有用的器官形成。但是实验证实细胞凋亡实际上耗损的能量不比分化要少。而且如果为了节省能量，就不会在胚胎期形成眼原基，
20、又在后期凋亡，这种方式并不节约。,从本篇文献的实验结果来看，眼部退化更多的来自于基因多效性的结果。在动物体内的基因多效性是一个很普遍的现象，其本质是发展进化的一个权衡，即一个基因同其他基因作用的积极影响和消极影响都存在，而自然选择使得生物体自觉的保持积极的作用，间接的抵消消极的作用。,基于这些理论，杰弗里教授提出了一个新的假说来解释基因多效性在眼部的回归演化中的作用。HH信号对于许多基因的表达有着重要的调节作用，能够让这些基因在许多器官例如牙齿、味蕾、颅面结构能形态发生产生积极的作用，但是相反的却会改变和的表达模式，使得眼原基中的细胞出现凋亡，最终导致眼部的缺失。这在其他生物中是致命的，但是重要的是生活在洞穴黑暗环境下的鱼类似乎不受眼睛缺失的影响能够继续生存，甚至可以由于其他器官的发达生存的更好，从而被自然选择留下。,杰弗里的假说有一定的可信性，但是也缺少实验证据的支持，如果能够验证信号在洞穴鱼的其他器官中发育有着重要的积极作用的，就能够为这个假说提供支持。但是是否所有洞穴鱼类都与墨西哥丽脂鲤有着相似的情况就不得而知了。,谢谢,