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1、茶黄素绿色高效制备技术研究一、项目可行性报告（一）立项的背景和意义1、 项目背景茶叶是浙江省大宗特色优势农产品之一，茶叶资源的高值化深加工是促进浙江省茶产业发展、茶农增收的重要途径。目前，茶叶资源高值化利用的重点之一是研发茶黄素绿色高效制备技术。在过去的30多年里，我国和浙江省大力发展名优茶，成功地促进了茶叶生产从量的扩张向质的提高转变，极大的提高了茶业经济效益，有力推动了农业增效、农民增收，但是要走可持续发展的道路，就必须考虑手工采摘难、难以规模化、品质不稳定等问题。如何提高茶叶资源的高值化利用效率，名优茶生产的规模化、机械化采制，以及夏秋茶的高值化开发利用，都将是非常有效的途径。名优茶采摘
2、后，在茶树体内物质快速转化和外部气温的双重作用下，尽管夏秋茶鲜叶中的氨基酸、芳香物质等内含物迅速降低，但咖啡碱和茶多酚等内含物显著增加，且多酚氧化酶和过氧化物酶的酶活也比春茶有所提高，而这恰恰为高生物活性、高附加值的茶黄素、茶红素等功能性成分的形成创造了良好的条件。茶黄素一类由茶多酚类物质（主要是儿茶素类物质）经过酶促或非酶促氧化聚合的产物，可从由绿茶转化得到，由于具有防治心脑血管系统疾病、抗病毒、抗菌、抗氧化、抗癌等多种生物活性，被誉为茶叶中“软黄金”，已成为了茶叶功能性成分分离、纯化与临床应用研究的焦点。现有的茶黄素分离制备方法，仍以传统的有毒有害有机溶剂萃取法或树脂吸附分离法为主，由于大
3、量使用氯仿和乙酸乙酯等有毒有害的有机溶剂，因此存在有毒有害有机溶剂残留、污染环境、成本高、茶黄素含量低等问题，远远不能满足国内外市场对绿色、健康、高活性产品的需求，因此，非常有必要开展茶黄素的绿色高效制备技术研究。2、 立项意义浙江省在茶黄素的提取利用和产业化方面有良好的基础，现有浙江派诺生物技术有限公司、杭州茗宝食品有限公司、易晓食品（衢州）有限公司、杭州英仕利生物科技有限公司、杭州禾田生物技术有限公司、龙游茗皇天然食品开发有限公司、浙江东方茶业科技有限公司等10余家茶黄素生产企业。但是，这些企业基本上使用有机溶剂萃取、树脂吸附分离法等工艺，用到大量的乙酸乙酯、氯仿等有机溶剂。不仅茶黄素产品
4、易出现有机溶剂残留，而且有10%-30%的乙酸乙酯和三氯甲烷不能回收，散发到企业周边的环境中，对环境和人体健康产生不良的影响。因此，必须将绿色加工、高值化利用的理念应用于茶黄素制备，开展高质量茶黄素的绿色制备技术研究，开发活性更高的茶黄素系列产品，不仅能够充分利用茶叶资源、提高茶叶经济附加值，还可改善茶黄素生产对环境的影响、丰富茶黄素产品的种类、提高茶黄素产品的质量，促进茶叶深加工产业的绿色生产。（二） 国内外研究现状和发展趋势1、国内外研究现状目前，工业上生产茶黄素的常用工艺流程为“茶叶匀浆发酵分离纯化干燥茶黄素”。现在常用的制备方法，主要包括两种即酶促氧化发酵法和化学氧化法，因酶促氧化发酵
5、法具有反应条件温和、酶专一性、无化学试剂污染等特点，现有企业多采用茶鲜叶匀浆酶促发酵法为主，即以茶叶中的茶多酚类物质为底物，以茶叶中固有的多酚氧化酶为酶源，进行匀浆发酵，得到的茶黄素含量不高。国内外部分学者研究表明，水果中也存在较多的与茶叶中类似的多酚氧化酶，因此探索了辅助添加外源酶进行酶促氧化，也取得了良好的效果，可将其应用于茶黄素的高效制备中。匀浆发酵后的茶黄素发酵液中，含有大量的悬浮颗粒、多糖、蛋白质、胶质等物质，如不进行预处理，将会影响后续步骤的顺利进行，降低生产效率，增加生产成本。目前工业上主要使用絮凝剂进行前处理，但存在二次污染问题。最近提出的有机超滤膜过滤去除悬浮颗粒及大分子方法
6、，因为有机超滤膜的膜孔极易被堵塞，易造成通量的急剧下降，很难以清洗的方法来恢复其通量，因而在实际应用时存在较大困难。现代新技术所生产的无机膜等材料，具有稳定性好、孔径分布窄、机械强度高、不易被污染等优点，可应用于初步除杂、甚至实现部分分离、浓缩的功能，在茶叶深加工领域也得到了专家的认可，并开始探讨其应用价值与经济效益。分离纯化茶黄素的方法中，液相色谱制备法、凝胶柱层析法、高速逆流色谱法等主要应用于制备少量的儿茶素单体；现行工业化制备茶黄素的方法，依然集中在有机溶剂萃取法。有机溶剂萃取法作为传统的制备茶黄素方法，在加工过程中须使用大量的乙酸乙酯、三氯甲烷或二氯甲烷等有机溶剂，因而存在一些相关问题
7、：（1）产品有毒溶剂残留高，安全性差；（2）需要对不同有机溶剂进行回收，生产过程能耗大、生产成本较高、设备投资较高；（3）大量有机溶剂的使用和排放，易对环境造成污染。吸附柱层析法制备茶黄素是一种较新的方法，具有选择性强、路线简单、操作方便、能耗较低等优点，生产过程中试剂易回收、加工成本低，符合绿色环保工艺的发展趋势。但目前在茶黄素生产企业中，吸附柱层析法使用较多的乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷或二氯甲烷等有毒有害有机溶剂作为洗脱剂，极少使用绿色、环保、安全的洗脱剂。综上所述，现有茶黄素生产工艺存在制备率低、环境污染严重、能耗高、有机溶剂残留等缺点，非常有必要在现阶段结合环保、高效的观念，以绿色高效制
8、备技术对茶黄素的生产工艺进行改进和提升，开发绿色、健康、安全的高质量茶黄素产品。2、发展趋势茶黄素自被发现以来，一直被作为影响红茶汤色、滋味和叶底等品质的主要化学成分；直到20世纪90年代，茶黄素的生物活性和药理功能得到较广泛的研究以后，引起了茶学、食品、加工和医学等相关领域学者的重视。目前在美国已有以茶黄素为主要功效成分的保健食品（如Theaflavin）推向市场，日本、英国等也越来越关注茶黄素的保健功效，茶黄素的生产和利用已成为茶叶功能性成分研究和开发利用的新热点之一。就茶黄素的工业化生产来看，国内现有10余家企业在生产该类产品，其产品最高可含60%茶黄素，综合来看，仍存在茶黄素制备用有毒
9、有害溶剂过多、茶黄素含量较低等缺陷。因此，绿色、健康、新型的高质量茶黄素产品的绿色高效制备技术研发已成为必然趋势。项目申请单位是国内最早研究和工业化提取茶叶功能性成分的单位，已经在茶黄素单体、茶多酚、儿茶素单体、茶色素、茶皂素、茶籽油等方面取得了显著的成绩，具备雄厚的研究开发经验与实力，能够胜任茶黄素绿色高效制备研究开发的需要。（三）项目主要研究开发内容、技术关键及主要创新点1、 主要研究开发内容(1) 茶叶匀浆外源酶辅助发酵关键技术研究以茶鲜叶为原料，研究茶叶匀浆外源酶辅助发酵的处理条件，包括茶鲜叶用量、外源酶源添加量、反应温度、反应时间、等关键技术因素，获得茶叶匀浆外源酶辅助发酵关键技术。
10、(2) 茶叶匀浆外源酶辅助发酵液膜处理技术研究选择合适的超滤膜管和陶瓷膜管，通过研究体系温度、溶液浓度、操作压差、不同膜孔径等膜过滤、浓缩茶叶匀浆外源酶辅助发酵液的工艺条件，以及各种膜材料的清洗方法，比较能耗和茶黄素截留率，确立分离去除悬浮颗粒及大分子的膜分离技术。(3) 吸附柱层析绿色制备高质量茶黄素的工艺技术研究采用绿色、高效的洗脱液，采用静态吸附法和动态吸附法，考察不同规格的吸附柱层析填料对茶黄素的吸附容量以及吸附特性，筛选出适用的树脂种类，并通过研究不同料液浓度、不同洗脱流速、不同洗脱液浓度、不同洗脱体积对茶黄素的吸附和洗脱曲线，确定最佳的吸附条件和洗脱方法，建立吸附树脂绿色分离制备高
11、质量茶黄素的工艺技术。2、 技术关键(1) 茶叶匀浆外源酶辅助发酵关键技术；(2) 茶叶匀浆外源酶辅助发酵液的不同膜管处理关键技术；(3) 吸附树脂绿色制备高质量茶黄素的工艺技术。3、 主要创新点在茶鲜叶匀浆发酵体系中，通过添加果汁匀浆液的形式，添加促进茶黄素合成的外源酶类，并采用绿色、高效的洗脱液，吸附柱层析绿色制备高质量茶黄素，不仅可得到含量较高的茶黄素类物质，而且在整个工艺过程中不使用任何有毒有害有机溶剂。（四）项目预期目标1、 主要技术经济指标(1) 提出一套茶黄素绿色高效制备技术及工艺；(2) 开发出高质量茶黄素产品，其中茶黄素总含量70%，乙酸乙酯含量0.001%；(3) 申请1-
12、2项发明专利，在国内核心期刊发表1-2篇论文。2、 应用或产业化前景茶黄素的主要应用于食品、保健品、药品等的原料，近年来生产类持续上升，而这些企业基本上使用传统的生产工艺，排放大量的乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷或二氯甲烷等有毒有害有机溶剂。如开发出高质量茶黄素绿色高效制备技术与工艺，整个工艺流程中不使用有毒有害有机溶剂，将避免溶剂的排放，有利于环境保护和食品安全。此外，开发的绿色制备技术，将有效提高茶黄素产品的质量和技术指标，高纯度茶黄素的价格将由现在的800元/公斤上升到1200元/公斤。若将该技术应用于生产实践，形成年产30吨茶黄素产品（茶黄素70%），可实现产值9000万元以上，利润2000
13、万元。如将高质量茶黄素进一步开发成保健食品或药品，还将大幅度增加儿茶素糖苷的产值和利润。（五）项目实施方案、技术路线、组织方式与课题分解1、实施方案(1) 茶叶匀浆外源酶辅助发酵关键技术研究以茶鲜叶为原料，研究茶叶匀浆外源酶辅助发酵的处理条件，包括茶鲜叶用量（50kg、100kg、150kg、200kg）、外源酶源添加量(100g、300g、500g、700克)、发酵温度（25、35、45、55）、发酵时间（30min、60min、90min、120min、150min）等关键技术因素，通过比较分析浸提后的茶黄素得率和纯度，确定最佳的茶叶匀浆外源酶辅助发酵关键技术参数。(2) 茶叶匀浆外源酶辅
14、助发酵液的不同膜管处理技术1）膜管的选择：取一定量的茶叶匀浆外源酶辅助发酵液，用三种不同孔径的膜管在相同条件下进行膜过滤，检测膜通量变、茶黄素截留率、过滤液澄清度，选择最大通量的膜。2）过滤操作条件的选择：研究陶瓷膜过滤茶叶匀浆外源酶辅助发酵液的工艺条件，考察体系温度、溶液浓度、操作压差、不同膜孔径等因素，以提高实际应用时的膜通量。在单因素试验的基础上，开展正交试验。3）膜污染的清洗：先以高速水流冲洗污染物，再以选择的清洗溶液分别洗涤，考察各种膜材料的清洗方法，并观测各种清洗溶液清洗后膜的恢复能力。4）膜浓缩条件的研究：在一定的操作压力下，分别选择不同种类的膜材料处理茶叶匀浆外源酶辅助发酵液，
15、比较能耗和茶黄素截留率，确定合适的膜。(3) 吸附柱层析绿色制备高质量茶黄素的工艺技术研究1）取各种不同种类和规格的树脂，以经膜过滤处理溶液为样品溶液，采用乙醇等无毒无害溶液，考察各种树脂对茶黄素的吸附容量以及吸附特性，并考察各种成分的解吸附特性，从而筛选出适用的树脂种类。2）选用对茶黄素组分具有高选择性的吸附树脂进行动态吸附实验研究，研究不同料液浓度、不同流速、不同高径比下的吸附树脂柱对茶黄素组分的吸附曲线，确定最佳的吸附条件。3）选用对茶黄素组分具有高选择性的吸附树脂进行动态洗脱实验，研究不同洗脱方式、不同乙醇浓度下的各种茶黄素的洗脱曲线，确定最佳洗脱方法。4）固定床吸附法工艺参数验证实验
16、：在前面研究的基础上，经多次固定床吸附实验验证，确定固定床吸附法绿色分离制备茶黄素生产工艺参数。2、技术路线3、组织方式与课题分解项目由本单位承担，制定详细的年度计划方案，积极开展项目年中考核和年终考核，以有效的科研管理方式组织实施。（六）计划进度安排本项目分2年组织实施（2012年7月2014年6月），具体计划进度安排如下：2012年7月-2013年6月：开展茶叶匀浆辅助酶发酵技术研究，包括外源酶的酶源筛选、茶叶匀浆辅助酶发酵技术参数比较分析实验；开展茶叶匀浆辅助酶发酵溶液膜处理技术研究；开展无毒无害洗脱液筛选研究。2013年7月-2014年6月：开展茶黄素的绿色高效分离制备技术研究，包括吸
17、附柱层析填料筛选、吸附柱层析绿色分离制备参数比较优化等，茶黄素绿色制备工艺流程的设计、优化及放大试验；申请专利，撰写论文和总结报告，并准备项目验收。（七）现有工作基础和条件1、 现有工作基础申请单位在国内率先开展茶叶中功能性成分的提取和应用研究，已经在茶多酚和儿茶素的理化性质、分析方法、分离制备、生物活性、功能性产品等方面开展过大量的研究工作，并对茶叶精深加工中的提取技术、超临界流体CO2萃取技术、膜分离浓缩技术、酶工程技术、喷雾干燥技术等前端技术进行了系统研究，取得了重要进展，至今已获得多项国家、省部级奖项，具备雄厚的研究开发经验和实力，能满足 茶黄素绿色高效制备技术研究开发的需要。就茶黄素
18、而言，项目申请单位也开展过大量的研究工作。早在七十年代，针对茶黄素的分析方法、红茶中茶黄素类化合物的含量、儿茶素氧化形成茶黄素的氧化机理开展了大量研究工作；八十年代，针对红茶制造技术，提高红茶中茶黄素的含量、提高红茶品质等开展了许多研究工作；九十年代，针对茶叶黄色素的提取制备技术及其在食品加工中的应用、茶黄素单体成分的分离技术，以及茶黄素、儿茶素等的生物活性功能等方面，开展了大量研究工作。近5年来，继续在高茶黄素红茶品种的引进和培育、茶黄素形成的调控技术、茶黄素的绿色分离纯化技术、茶黄素的医药保健功能等方面开展研究工作。2、 现有仪器设备和能力状况项目申请单位拥有先进的仪器设备，包括Water
19、s半制备型高效液相色谱仪（HPLC）、Agilent分析型高效液相色谱仪、高速逆流色谱仪（HSCCC）、岛津UV-2401紫外可见分光光度计、-80超低温冰箱、高速冷冻离心机、Agilent气质联用仪GC/MS、成套的茶叶加工设备（超滤、反渗透）等，能够满足课题实验的需要。拥有茶叶天然产物提取、膜分离浓缩、喷雾干燥等实验设备，能够满足项目深入研究和生产的需要。二、经费概算本项目申请总经费共计20万元，其中向省科技厅申请经费20万元，详见经费概算列表和经费概算说明。（一）经费概算列表省级科技计划项目经费概算表项目名称：茶黄素绿色高效制备技术研究 金额单位：万元 概算科目名称合计省财政拨款经费自筹
20、经费（1）（2）（3）（4）一、经费支出（合计）20.0 20.0 0.0（一）直接费用18.5 18.5 0.01、设备费0.0 0.0 0.0（1）购置设备费0.0 0.0 0.0（2）试制设备费0.0 0.0 0.0（3）设备租赁费0.0 0.0 0.02、材料费7.3 7.3 0.03、测试化验加工费1.8 1.8 0.04、燃料动力费1.0 1.0 0.05、差旅费2.8 2.8 0.06、会议费 1.2 1.2 0.07、合作协作研究与交流费1.0 1.0 0.08、出版/文献/信息传播/知识产权事务费1.6 1.6 0.09、劳务费0.9 0.9 0.010、专家咨询费0.9 0
21、.9 0.0（二）间接费用1.5 1.5 0.011、管理费0.9 0.9 0.012、激励费0.6 0.6 0.0（三）其他0.0 0.0 0.013、其他费用明细说明二、经费来源（合计）1、申请省财政经费20.02、自筹经费0.0（1）单位自有货币资金0.0（2）地方、部门配套拨款0.0（3）其他资金0.0注：支出概算按照经费开支范围确定的支出科目和不同经费来源编列，同一支出科目一般不同时在财政拨款经费和自筹经费中概算。（二）经费概算说明1设备费0.00万元 由于项目承担单位可满足本项目实施所用仪器设备的需要，所以不计划购置新设备。2、材料费7.30万元用于购买茶鲜叶、茶多酚、儿茶素标准品
22、、试剂等材料产生的费用。茶鲜叶：200kg30 元/ kg=6000元；茶多酚：100kg150 元/ kg=15000元；色谱填料：30kg1000 元/ kg=30000元；儿茶素、茶黄素标准品13000元；试剂：9000元。3、测试化验加工费1.80万元用于茶黄素绿色制备底物和产物的分析检测和数据处理。分析测试费：90个样品200元/个=18000元。4、燃料动力费1.00万元 使用电、水、热等相关费用。电费7000元，水费3000元。5、会议费1.20万元 拟组织课题组成员，参加3次国内外学术性会议和研讨会，每次会务费及相关费用4000元，交流茶黄素绿色制备技术研究成果。 6、差旅费2
23、.80万元 用于因项目调研、购买实验材料等产生的交通费、差旅费等。7、合作、协作研究与交流费1.00万元用于邀请专家开展学术交流和项目合作、进行茶黄素合成分析协作研究等产生的费用。8、出版/文献/信息传播/知识产权事务费1.60万元 版面费7000元、资料费1000元、通信费3000元、专利费5000元，合计16000元。9、人员劳务费0.9万元 用于支付研究生补助、临时工劳动报酬等费用。900元/人次*10人次=9000元。10、专家咨询费0.9万元 用于咨询茶黄素绿色制备方面专家产生的相关费用。1000元/人次*9人次=9000元。11、管理费0.90万元用于项目组织实施费用。12、激励费0.60元用于项目激励的费用。8