一个新的人类睾丸特异性基因—TDRG1的cDNA克隆及表达分析.pdf

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1、中南大学 博士学位论文 一个新的人类睾丸特异性基因TDRG1的cDNA克隆及表达分析 姓名：阳建福 申请学位级别：博士 专业：外科学 指导教师：蒋先镇 20060501 摘要 越来越多的研究表明，生精障碍是导致男性不育的重要因素之 。精子生成是一个复杂的细胞发育与分化的过程，受一个由多个基 因参与的基因网络的高度调控，这些基因可能既存在性染色体上，也 存在常染色体上。分离生精相关基因是男性不育研究中的一个重要课 题，研究和发现这些基因，对于阐明精子发生的机制具有重要的生理 和病理学意义。 本课题运用了一种发现人类新基因的新策略“数据库消减杂交” ( D i g i t a lD i f f e

2、 r e n t i a lD i s p l a y ，D D D ) 即通过计算机对不同 文库进行比较来发现在统计学意义上存在明显转录差异基因的定量 分析方法，结合R T P C R 、N o r t h e r n 杂交等实验验证成功克隆了一个 人类睾丸组织特异性表达的新基因，并探讨了其与精子发生的关系。 本研究分为2 个部分，其主要实验方法及实验结果如下： 第一部分：数据库消减杂交方法克隆人类睾丸组织特异性表达新 基因T D R G I 1 新基因的电子克隆 美国N C B I 的U n i g e n e 数据库中拥有大量的表达序列标签( E S T ) ， 它们来源于不同组织、不同

3、细胞、不同病理状态下所构建的c D N A 文 库，己成为人们寻找新基因的重要标志物。D i g i t a lD i f f e r e n t i a l D i s p l a y ( D D D ) 是一种利用U n i g e n e 数据库中的E S T s 进行数种平行 材料之间的比较的方法。运用该方法，我们进行了两种平行材料之间 的比较：挑选9 个人类睾丸组织来源的e D N A 序列文库作为检测子， 并将之归为p o o lA ；将7 6 个人类其他组织或细胞株来源的c D N A 文 库序列作为驱赶子，并将之归为p o o lB ；通过p o o lA ：p o o lB

4、之 间的比值来计算倍数差异，并以1 0 倍的差异为筛选标准，经数据 库杂交筛选获得在统计学意义上存在差异显示的克隆重叠群。 在获得的2 9 个全新克隆重叠群中，H s 1 8 0 1 9 7 是其中一个其差 异表达最显著的克隆重叠群，生物信息学分析显示其代表一个新基 因，我们将之作为本课题的研究重点。H s 1 8 0 1 9 7 包括3 个E S T ，运 用E S T 拼接工具进行序列匹配、整合，获得了一个新的未知序列 c o n t i g l 。将c o n t i g l 与E S TH u m a n 数据库比较，发现该序列包含另 一个E S TB C 0 7 1 8 2 0 ，充

5、分利用生物信息学数据库及相关软件，并通 过完整E S T 数据库和人类基因组图谱双重校对，最终获得新基因的全 长c D N A 。 2 新基因的实验克隆 新基因的电子克隆成功后，需通过实验验证该方法的可行性和准 确性。通过实验克隆和D N A 序列分析表明预测的新基因阅读框完全正 确。经人多组织的R T P C R 初步证实该序列在睾丸组织中特异性表达。 经N o r t h e r n 杂交证实了新基因确切的转录本大小，再次验证了该基 因在已检测组织中具有睾丸组织特异性表达的特征。 3 新基因的生物信息学分析 新基因经人类基因命名委员会( H G N C ) 命名为T D R G l ( T

6、 e s t i s D e v e l o p m e n tR e l a t e dG e n e1 ) ，G e n B a n k 登录号为D Q l 6 8 9 9 2 。 T D R G l 基因c D N A 全长为1 1 9 7 b p ，开放阅读框为5 0 4 8 0 6 b p ，定 位在染色体6 p 2 1 卜2 1 2 ，包含2 个外显子，基因组跨越1 8 k b 。该 基因编码由1 0 0 个氨基酸组成的、分子量为1 0 4 7 2 O D a 的蛋白质，与 己知蛋白质无明显同源性，表明T D R G l 基因及其产物均为全新的。生 物信息学预测T D R G l

7、蛋白在细胞内的定位主要表现为：4 7 8 的可能 性位于细胞核内和3 0 4 定位在线粒体。氨基酸分析表明它无信号肽 序列和跨膜区序列，推测其可能是一非分泌型蛋白。 上述结果表明T D R G l 基因具有一个完整基因所必备的各项特征， 多组织的N o r t h e r nb l o t s 和半定量R T P C R 表明该基因在已检测组织 中具有睾丸组织特异性表达的特征。这些结果显示利用数据库消减杂 交方法分离睾丸组织特异性表达基因是成功的。 第二部分：T D R G I 基因功能的初步研究 新基因的表达谱分析是一个重要的推测新基因功能的手段。研究 基因表达与否、何时表达、在什么部位表达

8、能为新基因的功能研究提 供有用的线索。 1 T D R G ! 基因在人睾丸组织不同发育时期的表达分析 在证实了T D R G l 基因具有睾丸组织特异性的基础上，本部分首先 运用半定量R T P C R 技术研究了T D R G l 基因在人睾丸组织不同发育时 期的表达特征，结果发现T D R G l 基因在时空表达上具有发育阶段特异 性，即在正常胚胎睾丸组织中不表达，至成年期睾丸组织中开始启动 该基因的表达，在成年期该基因表达最强，而在老年睾丸组织中表达 明显减弱。 许多在睾丸中表达的基因经常具有细胞类型特异性或发育阶段 特异性，反映了组织在发育过程中的需求。睾丸不同发育阶段差异表 达的基

9、因在某种意义上与睾丸发育特别是精子发生过程密切相关。 T D R G Im R N A 在睾丸组织中的表达模式具有明显的发育阶段特异性， 提示该基因在睾丸生殖细胞的发育过程中扮演重要角色，可能参与精 子生成的过程。 2T D R G I 基因在睾丸组织生殖细胞中的表达分析 为了进一步明确T D R G I 基因在睾丸组织生殖细胞中的表达特点 及其可能的功能作用，采用经地高辛标记的T D R G Im R N A 特异的多聚 寡核苷酸探针，与人类睾丸组织进行原位杂交。发现T D R G Im R N A 在 精母细胞及精细胞中有明显表达，而在支持细胞、间质细胞中无表达， 具有明显的生精细胞特异性

10、。隐睾症患者睾丸组织中T D R G Im R N A 的 表达缺失。 精子生成包括连续的有丝分裂、减数分裂和减数分裂后阶段。其 中精原细胞处于减数分裂前阶段，精母细胞处于减数分裂开始阶段， 而精细胞处于减数分裂后阶段。T D R G Im R N A 在人睾丸曲细精管中生 精细胞特异性表达的特点表明，该基因在精子生成的不同阶段存在差 异表达，它可能参与控制男性正常精子形成的开始阶段，并在减数分 裂后期精子的发育过程中起作用。 小结：本研究运用数据库消减杂交方法这一新策略结合实验手段成功 克隆了一个人类睾丸生精细胞相关的新基因T D R G I ，并采用N o r t h e r n b l

11、o t 、半定量R T P C R 、组织原位杂交等多种方法联合对T D R G I 基因 的表达特征及可能的功能进行了综合研究，各方法之问相互印证，结 果可靠。我们认为，T D R G I 基因是一个具有重要生理功能的新基因， 它可能在人类精子的生成及生殖细胞的发育过程中具有重要作用。 关键词基因克隆，数据库消减杂交，逆转录聚合酶反应，睾丸特异 性表达基因，精子生成 I I I A B S T R A C T I t i sb e c o m i n gi n c r e a s i n g l yc l e a rt h a tm u l t i p l eg e n e t i ca l

12、 t e r a t i o n so r d e f e c t sa r er e s p o n s i b l ef o rm a l ep r i m a r yi n f e r t i l i t ym o s to fw h i c hd u et o o b s t r u c t i o no fs p e r m a t o g e n e s i s S p e r m a t o g e n e s i si sac o m p l e xp r o c e s so f c e l l d e v e l o p m e n ta n dd i f f e r e

13、n t i a t i o n T h i sp r o c e s sr e q u i r e st h eh i g h l y r e g u l a t e de x p r e s s i o n o fm u l t i p l e g e n e s l o c a t e do nb o t ht h es e x c h r o m o s o m e sa n dt h ea u t o s o m e s D i s c o v e r yo fs p e r m a t o g e n e s i s - r e l a t e d g e n e si s am a

14、 j o rc h a l l e n g ef a c i n gm a l ei n f e r t i l i t yr e s e a r c h C l o n i n go f n e wt e s t i s - s p e c i f i cg e n er e l a t e dt os p e r m a t o g e n e s i si so fm o m e n t o u s p h y s i o l o g i c a la n dp a t h o l o g i c a ls i g n i f i c a n c et ou n d e r s t a

15、n dt h em o l e c u l a r m e c h a n i s mo fs p e r m a t o g e n e s i s I nt h i ss t u d y , an e ws t r a t e g yD i g i t a lD i f f e r e n t i a lD i s p l a y ( D D D ) o f t h eN a t i o n a lC e n t e rf o rB i o t e c h n o l o g yI n f o r m a t i o n ( N C B I ) ，w h i c hi sa s t a t

16、 i s t i c a lm e t h o dt oq u a n t i t a t et h e t r a n s c r i p tl e v e l s ，w a s u s e dt o d e t e r m i n et h ef o l dd i f f e r e n c e sb e t w e e nt h el i b r a r i e sb e i n gc o m p a r e d W e h a v es u c c e e d e dc l o n i n gan o v e lh u m a nt e s t i s s p e c i f i cg

17、 e n ea n ds t u d i e d t h er e l a t i o n s h i po fn e wg e n ea n ds p e r m a t o g e n e s i sw i t hD D Dc o m b i n e d w i t hl a b o r a t o r ye x p e r i m e n t ss u c ha sR T - P C R ，N o r t h e r nb l o t s ，e ta 1 T h e r e a r et w op a r t si nt h i ss t u d y , a n dt h ef o l

18、l o w i n ga r ei t sm a i ne x p e r i m e n t a l m e t h o d sa n dr e s u l t s ： P a r tII d e n t i f i c a t i o na n de x p r e s s i o no fan o v e lh u m a nt e s t i s s p e c i f i c g e n eT D R G l 、珂D i g i t a lD i f f e r e n t i a lD i s p l a y 1C l o n i n gi ns i l i c oo fn e w

19、g e n e T h eU n i g e n ed a t a b a s e o fN C B Ih a st h o u s a n d so fe x p r e s s e d s e q u e n c e s ，b o t hk n o w na n dn o v e l ，i nt h ef o r mo fe x p r e s s e ds e q u e n c et a g s ( E S T s ) ，d e r i v e df r o md i v e r s en o r m a l ，p a t h o l o g i c a l o rt u m o rc

20、 D N A l i b r a r i e s ，o f f e ra na t t r a c t i v es t a r t i n gp o i n tf o rg e n ed i s c o v e r y T h eD D D ，a d a t a - m i n i n gt o o l ，t a k e sa d v a n t a g eo ft h eU n i G e n ed a t a b a s eb yc o m p a r i n g ag r e a tn u m b e ro fE S T sf r o md i f f e r e n tl i b r

21、 a r i e s w h i c hw e r ea s s i g n e dt oa p a r t i c u l a rU n i G e n ec l u s t e r D D Dw a sp e r f o r m e db e t w e e n9t e s t i s d e r i v e d E S Tl i b r a r i e s ( p o o lA o rn a m e d “t e s t e r ) a n d7 6d i f f e r e n tt i s s u e d e r i v e d E S Tl i b r a r i e s ( p

22、o o lB o rn a m e d “d r i v e r ) F o l dd i f f e r e n c e sw e r e c a l c u l a t e db yu s i n gt h er a t i oo fp o o lA ：p o o lB S t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n t h i t so f 三1 0 - f o l dd i r i t e r e n c e sw e r ec o m p l i e d T ov a l i d a t et h eu s eo fD D Da p p r

23、o a c h e si n g e n ed i s c o v e r y , t h e c o n t i g I d e r i v e df r o mH S 1 8 0 1 9 7w h i c hi n c l u d e d3 E S T sa n dw a s p r e d i c t e dt ob et e s t i s s p e c i f i ca n dr e p r e s e n t e dan o v e lg e n ew a sc h o s e n f o rf u r t h e rs t u d y U s i n gt h eB L A S

24、 Tp r o g r a m ，aE S TB C 0 718 2 0c o n t a i n e di nt h e h o m o l o g yc o n t i g ls e q u e n c ew a sa t t a i n e d T h e nac D N As e q u e n c ew a s o b t a i n e db yb i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i s 2L a b o r a t o r yc l o n i n go fn e wg e n e A f t e rs u c c e e d e di

25、n c l o n i n g i ns i l i c oo fn e wg e n e ，i tn e e d st h e e x p e r i m e n t s t o v e r i f y t h e f e a s i b i l i t y a n d a c c u r a c y o ft h i s m e t h o d E x p e r i m e n t a la n a l y s e sa n dD N As e q u e n c i n gs h o w e dt h a tt h e p r e d i c t e dO R Fs e q u e n

26、 c eo fn e wg e n ew a sr i g h t M u l t i t i s s u er e v e r s e t r a n s c r i p t a s ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c f i o n ( R T - P C R _ a n a l y s i so fm R N Aw a s p r o v e di tt ob et e s t i s - s p e c i f i cg e n e N o r t h e r nb l o t sw a su s e dt ov e r i f yt h e d

27、e f i n i t es i z eo fn e wg e n e St r a n s c r i p t e dp r o d u c ta n dt h ec h a r a c t e ro ft h i s n e wg e n e St i s s u e s p e c i f i ce x p r e s s i o ni nt e s t i sa m o n ga l lt h et e s t e dt i s s u e s o n c em o r e 3B i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i so fn e wg e n

28、 e T h en e wg e n ew a sn a m e dt e s t i sd e v e l o p m e n tr e l a t e dg e n eI ( T D R G l ) b y H u m a nG e n eN o m e n c l a t u r e C o m m i t t e e ( H G N C ) a n dG e n b a n k a c c e s s i o nn u m b e ri sD Q l 6 8 9 9 2 T h eT D R G c D N Ai Sl19 7b pi nl e n g t ha n dc o n t

29、a i n sa3 0 3b pO R F t h a ts t a r t sa t p o s i t i o n5 0 4b pa n de n d sa tp o s i t i o n8 0 6b p 1 1 1 ep u t a t i v e p r o t e i ne n c o d e db yt h i sg e n ew a s10 0a m i n oa c i dw i t hat h e o r e t i c a lm a s s o f10 4 7 2 0D a T h en e w g e n eT D R G ，c o n s i s t so f t w

30、 oe x o n s w h i c hs p a n a p p r o x i m a t e l y1 8k bo nt h eh u m a nc h r o m o s o m e6 p 2 1 ，l - 6 p 2 1 2 T h e s e s e q u e n c e sa r en o th o m o l o g o u st oa n yk n o w nf u n c t i o n a ld o m a i n sa n da n y k n o w np r o t e i nr e p r e s e n t e di nG e n B a n k P S O

31、 R Ta n a l y s i ss h o w e dt h a t T D R G Jw a sp r o p o s e dt ob el o c a t e di nt h en u c l e u sa n dm i t o c h o n d r i a l e v e nt h o u g hn on u c l e a rc o n s e n s u ss i g n a lw a sf o u n di ni t ss e q u e n c e A ss h o w nb yt h ep r e v i o u sr e s u l t s ，T D R G lp o

32、 s s e s s e sa l lt h en e c e s s a r y c h a r a c t e r sa sac o m p l e t e g e n e T h e r e s u l t so fN o r t h e mB l o t i n ga n d s e m i q u a n t i t a t i v eR T - P C Rs h o w e dt h a tT D R G li Sat e s t i s s p e c i f i cg e n e V T h e s er e s u l t ss u g g e s t e dt h a to

33、 u ra p p r o a c hf o rt h ei s o l a t i o no ff u l l - l e n g t h c D N Ao fn o v e lh u m a nt e s t i c u l a rg e r mc e l la s s o c i a t e dg e n e sb yD D Dw a s s u c c e s s f u l P a r t P r e l i m i n a r yf u n o t i o ns t u d yo fT D R G l A n a l y s i so ft h ee x p r e s s i o

34、 np a t t e r no f n o v e lg e n ei sa l s oa ni m p o r t a n t p a t h w a yf o ri n f e r e n c eo f i t sf u n c t i o n 1A n l y s i so fT D R G le x p r e s s i o n sa td e f f e r e n td e v e l o p i n gs t a g e so f h u m a nt e s t i s B a s e do nt h ep r e v i o u ss t u d y ，d i s t r

35、 i b u t i o no fT D R G lm R N Ai nt h e s p a t i a l a n dt e m p o r a le x p r e s s i o np a t t e mo fn o r m a lh u m a nt e s t i sw a s s t u d i e db yR e a l T i m eR T - P C R T h er e s u l t sd i s p l a y e dd e v e l o p m e n t a l s t a g e s p e c i f i cg e n e f o rT D R G I T

36、h eT D R G lm R N Ae x p r e s s i o nw a s i n i t i a t e di nt h et e s t i so fa d u l t ，a n dw a ss i g n i f i c a n t l yd o w nr e g u l a t e di n t e s t i so ft h ea g e d B u tt h el a c ko fe x p r e s s i o nw a ss e e ni nn o r m a lf e t a l t e s t i s M a n yg e n e se x p r e s s

37、 e di nt e s t i so f t e nh a v et h ec h a r a c t e r so fc e l l t y p e - s p e c i f i ca n dd e v e l o p m e n t a ls t a g e - - s p e c i f i cw h i c hr e f l e c tt h ed e m a n d s o ft h ed e v e l o p m e n ti nt i s s u e s T h e r ea r ec l o s e l yr e l a t i o n s h i pb e t w e

38、e nt h e d i f f e r e n t d e v e l o p m e n t a ls t a g e s p e c i f i cg e n e a n d s p e r m a t o g e n e s i s I t s u g g e s t e d t h a tT D R G lg e n ep l a ya ni m p o r t a n tr o l e i ng e r mc e l l d e v e l o p m e n t ，a n db ec o n c e m e d w i t ht h es p e r m a t o g e n

39、e s i s 2A n l y s i so fT D R G l e x p r e s s i o n si ng e r mc e l l so fh u m a nt e s t i s I no r d e rt oi n v e s t i g a t et h ed i s t r i b u t i o no ft h eT D R G lm R N Ai n t e s t i c u l a rg e r mc e l lc o m p a r t m e n t s ，i ns i t uh y b r i d i z a t i o nw i t hT D R G l

40、 m R N A p r o b er e v e a l e dt h a tt h ee x p r e s s i o no fT D R G lm R N A v a r i e dw i m t h es e m i n i f e r o u sc y c l ed u r i n gs p e r m a t o g e n e s i si nt h em a t u r eh u m a nt e s t i s T h e b r o w ng r a n u l e so f h y b r i d i z a t i o ns i g n a lw e r ef o u

41、 n di ns p e r m a t o c y t e s ， s p e r m a t i d s ，n oe x p r e s s i o ni ns e r t o l i Sc e l l sa n dl e y d i g Sc e l l s T h e r ew a s n oe x p r e s s i o no fT D R G lm R N Ai nt h et e s t i so fa na d u l tc r y p t o r c h i d i s m p a t i e n t S p e r m a t o g e n e s i si sac

42、o m p l e xd e v e l o p m e n t a lp r o c e s st h a tc o n s i s t so f t h r e ep r i n c i p l ep h a s e s ：m i t o t i cp r o l i f e r a t i o nf o rs t e mc e l lr e n e w a l ；m e i o s i s b y w h i c h d i p l o i ds p e r m a t o c y t e sd e v e l o p t o h a p l o i ds p e r m a t i d

43、 s ； s p e r m i o g e n e s i sd u r i n gw h i c hr o u n ds p e r m a t i d s d i f f e r e n t i a t ea n da r e r e l e a s e da sm a t u r es p e r m a t o z o ai n t ot h el u m e no ft h es e m i n i f e r o u st u b u l e T h ep r e d o m i n a n ts t a g e s p e c i f i ce x p r e s s i o

44、no ft h eT D R G lg e n es u g g e s t e d t h a ti tw o u l db ei n v o l v e di nd e v e l o p m e n to ft e s t i c u l a rm a t u r a t i o n T h e r e s u l t ss h o w e dt h a tT D R G Jg e n ep e r f o r m sf u n c t i o nb y d i f f e r e n t e x p r e s s i o ni nd i f f e r e n ts t a g e

45、so f t e s t i c u l a rg e r mc e l l I tm a y b e t a k ep a r ti n t h em e i o s i so fs p e r m a t o g e n e s i sa n db e i n gs w i t c h e do na tap r e c i s es t a g e o fn o r m a ls p e r m a t o g e n e s i si na d u l t s a n di n v o l v e di nt h ep r o c e s so f p o s t m e i o t

46、i cm a t u r a t i o ns t a g e so f h u m a ns p e r m a t o g e n e s i s C o n c l u s i o n ：I d e n t i f i c a t i o no f7 D 贝G 1c o n f i r m e dD D Dt ob ean o v e l c o m p u t a t i o n a lb i o l o g y - b a s e da p p r o a c h w h i c hC a n i d e n t i f y t h e t e s t i s s p e c i f

47、 i ce x p r e s s i o ng e n e s N o r t h e r nb l o t s ，s e m i - q u a n t i a t i v eR T - P C R a n d 加s i t uh y b r i d i z a t i o nw e r eu s e dt or e s e a r c ht h ee x p r e s s i o np a R e ma n d f u n c t i o no fT D R G J A I lt h er e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tT D R G

48、 lm i g h tp l a y a ni m p o r t a n tr o l ei ns p e r m a t o g e n e s i sa n dt h ep r o c e s so fm a l eg e r mc e l l s m a t u r a t i o n K E YW O R D S g e n ec l o n i n g ，D i g i t a lD i f f e r e n t i a lD i s p l a y , R T - P C R ， t e s t i s s p e c i f i ce x p r e s s i o n ，s

49、 p e r m a t o g e n e s i s V I I 专业名词缩写中英文对照表 X I 原创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的 地方外，论文中不包含其它人已经发表或撰写过的研究成果，也不包 含为获得中南大学或其它单位的学位或证书而使用过的材料。与我共 同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。 关于学位论文使用授权说明 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有 权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅：学校可以公布学位论 文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文； 学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。 作者签名：卫些导师签期：丛年j 二月翌曰 博士学位论文 第一章前言 第一章前言 根据W H O ( 1 9 8 6 ) 人类生殖