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1、第十七章 流式细胞仪分析技术及应用,第一节 概述 一、工作原理 二、散射光的测定 三、荧光测量 四、细胞分选原理,第二节 数据的显示与分析 一、参数 二、数据显示方式 三、设门分析技术,第三节 流式细胞仪免疫分析的技术要求 一、免疫检测样品制备 二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色 三、免疫胶乳颗粒的应用 四、流式细胞免疫学技术的质量控制,第四节 流式细胞术在免疫学检查中的应用 一、淋巴细胞及其亚群的分析 二、淋巴细胞功能分析 三、淋巴造血系统分化抗原及白血病免疫分型 四、肿瘤耐药相关蛋白分析 五、AIDS病检测中的应用 六、自身免疫性疾病相关HLA抗原分析 七、移植免疫中的应用,思考题 小
2、结,流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。,流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。,细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量,流式细胞术的特点,流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分类收集的高技术。,第一节 概述,流式细胞仪常
3、检测的细胞特性,流式细胞仪由液流系统、光学与信号转换测试系统和信号处理及放大的计算机系统三大基本结构组成。在对细胞悬液中的单个细胞或其超微结构进行多参数快速自动分析过程中，每秒钟能测量数千个至数万个细胞，能在分析过程中按实验设计要求对特定细胞进行分析，带分选系统的流式细胞仪还可按实验设计要求分选出具相同特征的同类型细胞，用于培养或进一步研究。流式细胞技术所具有的分析和分选功能主要涉及光学原理、光电转换原理和测试原理三部分。,采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率； 利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性； 用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的
4、多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析的精确性。,一、工作原理,（1） 液流系统 （2） 光学系统 （3） 数据处理系统,1.流式细胞仪的基本结构,由样本和鞘液组成 待测细胞 单个细胞的悬液 荧光染料标记的单抗对其染色 受清洁气体压力 从样品管进入流动室形成样本流。 鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹在样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置保证检测的精确性，同时防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。,（1）液流系统,液流系统示意图,FCM的液流系统（如何形成单个细胞流）,样本管,鞘液管,激光光源：气冷式氩离子激光器。激光束波长为488nm。 分色反光镜：反射较长波长
5、的光，通过较短波长的光。 光束成形器：两十字交叉放置的透镜。将激光器发射的激光束聚焦成高15m，宽57m的椭圆光斑。 透镜组：将激光和荧光形成平行光，除去离散的室内光。 滤片：长通、短通、带通滤片三种，有525nmBP，575nmBP，620nmBP，675nmBP 4种。 光电倍增管：FS, SS（散射光），FL1, FL2, FL3, FL4（荧光），主要作用是检测荧光和散射光，同时将光学信号转换成电脉冲(数字数据)信号。,（2）光学系统,光学系统示意图,主要由计算机及其软件组成,（3）数据处理系统,基本工作原理,标记了特异性荧光染料的单细胞悬液和鞘液，分别经硅化管进入流动室，形成鞘液包裹
6、细胞悬液的稳态单细胞液柱，该液柱以稳定的层流形式通过喷嘴的高速射下，液柱与水平方向高度聚焦的激光束垂直相交，单个细胞上标记的荧光染料在通过激光光斑时被激发而产生特异性荧光，同时，由于混合细胞群中细胞大小和胞内颗粒的多少会被激发而产生不同的散射光。在入射光束与液柱垂直的方向有荧光检测系统和散射光感受系统，用于收集荧光信号和侧向散射光信号，前向散射光感受器在前向小角探测接受前向光信号。被接收的光电信号被光电倍增管转换成电压脉冲和积分脉冲，该信号进入计算机系统进行数据转换、储存、分析、处理，采用相应软件程序对结果进行综合分析，并以图像和数据显示于荧光屏上。,基本工作原理,基本过程,流式细胞仪与显微镜
7、的区别,细胞在液柱中与激光束相交时向周围360立体角方向散射的光线信号，其强弱与细胞大小、形状、胞内颗粒折射等有关，主要分为前向散射光和侧向散射光。,二、散射光的测定,前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0.510)向前方散射的讯号。用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。,前向散射光示意图,侧向散射光（side scatter, SS）：激光束照射细胞时，光以90角散射的讯号，SS信号的强弱与细胞或其他颗粒形状及粒度呈正比。用于检测细胞内部结构属性。,侧向散射光示意图,测得的FS与SS信号通过计算机处理，可得到FS-
8、SS二维点图，由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选。 此为血细胞分类的基本原理，但不能分析表面分子。,淋巴细胞,单核细胞,中性粒细胞,光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群,荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。 每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤光片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管。 选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。 采用荧光检测器检测特定荧光的特定发射波长。,三、荧光测量,荧光染料的特性,激发波长(EXCITING) 发射波长(EMISS
9、ION),常用的荧光物质,(一)荧光信号测量与放大器,荧光信号的放大测定通常使用线性放大器和对数放大器。 线性放大器用于测量信号强度变化范围较少时的信号或代表生物学线性过程的信号。 对数放大器用于测量信号强度变化范围较大且较光谱信号较复杂的信号，在免疫测量中最常使用。,目前使用的流式细胞仪至少能用一个激光束检测三色甚至四色激发荧光信号。从而使仪器的检测特异性及精确性进一步提高。 最常用于单克隆抗体标记的三种荧光染料分别是FITC、PE(藻红蛋白)、ECD 或PeCy5，其均能在488nm激光下发出525、575、620nm或675nm的绿色、橙色、橙红色或红色荧光。,荧光补偿,通过流式细胞仪进
10、行细胞分选主要是在对具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进行。,四、细胞分选原理,压电晶体,产生机械振动,不充电,充电,（一）分选基本原理,分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬液中细胞的含量成正比。 分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞的百分率。 分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。 分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。与分选速度成反比。,（二）分选的技术要求,参数：FS,SS,FL。 数据显示方式 （单参数直方图 、双参数散点图 、二维等高图 、假三维等高图 、三参数散点图 ）。 设门分析
11、技术。,第二节 数据的显示与分析,FS：反映颗粒的大小。 SS：反映颗粒内部结构的复杂程度、表面的 光滑度。 FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少。,一、参数,单参数直方图 双参数直方图:点图 二维等高图 假三维等高图 三参数直方图 多参数分析,直方图分析,设门分析:REGION和GATE设置,二、数据显示方式,由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。,（一）单参数直方图,单参数直方图,双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。 双参数信号通常采用对数信号，最常用的是点密图，在
12、图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。,（二）双参数直方图,1.双参数直方图点图,双参数直方图点图,2.二维等高图,由类似地图上的等高线组成，其本质也是双参数直方图。 等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即“等高”。 曲线层次越高(越里面的线) 所代表的细胞数愈多。 等高线越密集则表示细胞数变化率越大。,二维等高图,3. 假三维等高图,在二维等高图的基础上作出的三维立体图，由于图中的一维不是参数，而是细胞数。可做全方位的旋转或倾斜，以观察细节。,（三）三参数散点图,三维坐标均为参数，而非细胞数。以点图为显示方式，同样可做全方位旋转以
13、便仔细观察。,多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激发光激发后，得到的荧光信号和散射光信号可根据需要进行组合分析。,（四）流式细胞仪的多参数分析,Gate设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。,根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字门。,三、设门分析技术,A 淋巴细胞 B 单核细胞 C 中性粒细胞,A、B、C均为任意形状门,线性门,Region设置 区域（region, R）与门(gate, G ) 是两个相关的概念，区域可与门对应，但是也可以包含于门中
14、。,D1 CD4+/CD3- D2 CD4+/CD3+ D3 CD4- /CD3- D4 CD4- /CD3+,如十字门分析时，由四个区域构成，即G=D1+D2+D3+D4。,样本制备 标记染色 液相芯片技术 质量控制,第四节 流式细胞仪免疫分析的技术要求,外周血淋巴细胞样品的制备 分离单个核细胞 培养细胞的样品制备 蛋白酶消化 机械吹打 使贴壁细胞脱落 洗涤 尼龙网过滤,一、免疫检测样品制备,新鲜实体组织单细胞悬液的制备 机械法 酶处理法 化学试剂处理法 表面活性剂处理法 单细胞悬液的保存 深低温保存法（一年） 乙醇或甲醇保存法（2周） 甲醛或多聚甲醛保存法（2月）,适用条件: 有较高的量子
15、产额和消光系数； 对488nm的激发光波长有较强的吸收； 发射光波长与激发光波长之间有较大的波长差； 易与标记单抗结合而不影响抗体的特异性。,二、常用的荧光染料与标记染色,激光,细胞悬液,异硫氰酸荧光素,得州红,能量传递复合染料,藻胆蛋白类,（一）几种常见的荧光染料,常用的几类荧光染料,用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在488nm激发光照射下，通过一个荧光染料被激发后产生的发射波长再激发另一荧光染料产生荧光信号，从而检测到该特定荧光信号。,能量传递复合染料,488nm,575nm,670nm 红色荧光,花青苷5,藻红蛋白,能量传递复合染料机制,荧光染料与细胞成分的四种结合方式 结构
16、亲和式 嵌入结合 共价键结合 荧光标记抗体特异性结合 免疫荧光标记方法 直接标记:干扰少,但需购买多种单抗。 间接标记:步骤多,干扰多,不需标记多种抗体。 组合标记：,（二）免疫荧光标记,免疫胶乳颗粒的应用即液相芯片技术是把微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色，把针对不同检测物的乳胶微球混合后再加入待测标本，在悬液中微球与待检物质特异性结合，加入荧光标记的报告分子或特异性抗体，经激光照射后不同待测物产生不同颜色（定性），并通过测定微球上的荧光强度对被测物的量进行定量分析。因检测速度极快，所以又有“液相芯片”之称 。,三、免疫胶乳颗粒技术的应用,微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色（固相
17、芯片是用探针在芯片上的坐标位置给基因的特异性编码；而液相芯片则是用颜色来编码）,通过对标记不同荧光素分子的检测，实现FCM对可溶性物质的定量分析。,适当的制备方式 处理红细胞 实体组织来源标本用机械法 温度2537，pH7.07.2,四、流式细胞免疫学技术的质量控制,（一）单细胞悬液制备的质控,温度 pH 染料浓度 固定剂,（二）免疫荧光染色的质控,光路与流路校正: 确保激光光路与样品流处于正交状态，减少变异（CV）。 PMT（光电倍增管）校准: 保证样品检测时仪器处于最佳灵敏度工作状态。 绝对计数校准: 保证计数的准确性。,Flow-check,Flow-set,Flow-count,（三）
18、仪器操作的质控,同型对照：即免疫荧光标记中的阴性对照，选用相同源性的未标记单抗作为同型对照来调整及设置电压，以保证特异性。 全程质量控制：采用的质控物Immuno-Trol Cells 是全血质控品，与待测标本一起标记和检测，结果达标定靶值，提示本次实验结果可靠。,（四）免疫检测的质控,流式细胞术目前已广泛地被应用于免疫学基础研究和逐步进入临床应用各方面，用流式细胞仪对细胞表面的抗原成分进行标记分析，可区别多种细胞的特性，为细胞免疫的研究增加了有效的手段和帮助。,第四节 在免疫学检验中的应用,T淋巴细胞及其亚群分析 Th(CD3+CD4+CD8-T); Tc(CD3+CD4-CD8+T) B淋
19、巴细胞及其亚群分析 B1(CD19+CD5+):产生IgM型自身抗体, 参与免疫调节、与自身免疫病的发生有关。 B2(CD19+CD5-):受外来抗原刺激, 产生高亲和性特异性抗体。 NK细胞分析 NK(CD3-CD16+CD56+),一、淋巴细胞及其亚群的分析,细胞介导细胞毒性试验(死细胞与活细胞比例) 细胞内细胞因子测定,二、淋巴细胞功能分析,三、淋巴造血系统及白血病免疫分型,对淋巴瘤和白血病进行多色免疫分型。 用于选择化疗方案、判断预后及检出微小残留病变。,CD4+Th细胞、CD4+/CD8+比例,MDR(+)表示对化疗药物耐药,四、肿瘤耐药基因分析,五、AIDS病检测中的应用,HLA-
20、B27可出现在58%97%的强直性脊椎炎(As) 患者。,六、自身免疫病相关HLA抗原分析,FCM作为一个强大的技术平台，已应用于多个领域，其在移植免疫分析中的应用也越来越广泛。目前移植免疫中的FCM应用主要包括流式细胞术的交叉配型（Flow cytometry cross-matching, FCXM）和群体反应性抗体（Panel reactive antibody, PRA）检测。,七、移植免疫中的应用,小 结,流式细胞术（FCM）是在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，从分子水平上获取多种信号实现对单个细胞进行定量分析或纯化分选。 FCM分析中前向散射光反映颗粒的大小；侧
21、向散射光反映颗粒内部结构复杂程度、表面的光滑程度；荧光反映颗粒被染上荧光部分数量的多少，根据其标记的抗原分子不同，即反映了不同抗原分子的表达情况。 同型对照为免疫荧光标记中的阴性对照，可使荧光标记单抗的信号保持其特异性。 对各项工作环节和仪器性能进行严格的质量控制和规范化操作，是保证FCM分析中各项检测数据和指标可靠性的关键。,思考题,流式细胞仪的分析检测原理是什么？ 流式细胞仪分析中前向散射光、侧向散射光和荧光的检测意义。 何谓荧光补偿？何谓“液相芯片”技术？ 细胞分选的基本原理。 FCM分析中有哪些数据显示方式，如何解读结果及其设门分析的意义？ 如何进行FCM分析检测样品的制备？ 流式细胞分析前如何验证仪器工作状态，采用何种校正物？ 流式细胞免疫分析的质量控制包括哪些方面？ 流式细胞术有哪些临床应用价值？ 流式细胞仪分析中常见的荧光素有那些？他们的特性如何？,