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1、WHO人精液实验室检查及处理手册 （第5版） 精子形态学部分解读,浙江省人类精子库 姚康寿 主任医师,背景,全球精液检测标准化的需求，WHO制定了人类精液实验室操作手册，用于临床实验室和科研。,第一版 1980年,第二版 1987年,第三版 1992年,第四版 1999年,第五版 2010年,中文翻译本,标准方法,可选择试验,研究性试验,精子制备,精子冷冻,精液分析,精子制备,质量保证,WHO 5th主要内容,附录,正常形态精子： 通过观察来自女性生殖道，特别是经房事后试验从宫颈粘液或从卵子透明带表面回收的精子有助于定义具备潜在受精能力的精子。 使用这些标准，对所有男性而言，其正常形态精子百分
2、率的范围大致为0-30%，很少超过25% 。 这个低数据自然产生一个低的临界值 （仅为3-5%）。 经过“透明带选择”的精子，正常形态率仍然低，约8-25%。,WHO不同版本精子形态学内容比较,精子形态学分析包括以下步骤,精液涂片的制备 固定和染色 封片 精子形态评估（应制备双份涂片重复评估，每张涂片应评估至少200个精子） 。 双份片评估（百分率）结果比较（差异是否在可接受范围内，如果不可接受，重新读片） 。 取平均值，报告结果,精液涂片的制备,充分混匀精液样本。 快速取样，避免精子从混悬的精液样本中沉降。 重复取样前，再次混匀精液样本。 根据精液样本具体不同情况，采用不同的涂片方式。,（a
3、） 对于未稀释的精液，采用拉薄技术，将一滴精液（S）沿成角的载玻片背侧边缘展开，向前拖拉制成涂片。 （b） 对于洗涤的精液，采用滴管法，水平持滴管（P）推进，将一滴精子悬液（SS），沿载玻片的表面展开。,正常精液标本,使用拉薄技术，取一滴精液在载玻片的表面上涂片。 磨砂载玻片的两面，用不起毛软纸擦干净。 用HB或No.2铅笔，在载玻片的磨砂处标记上身份编号、日期。 根据精子密度，取5-10l的精液滴在载玻片的一端。用第二张载玻片作为拉片，沿着载玻片的表面拖拉精液滴。 涂片经空气干燥后，立即固定、染色。,一开始，可以用10l的精液，45角度，一秒钟的时间涂片。 为了减少涂片上精子间的相互重叠，如
4、果需要，可以改变上述参数（10l，45，1秒）。 精液的粘稠度越低，涂片的拉薄技术发挥得越好，拉薄技术不适用于高度粘稠的精液。,拉薄技术,精子密度低的标本 假如精子密度低于2106/ml，浓缩标本 粘稠精液标本 精浆高度粘稠时涂片往往是厚而不均，可以按与液化不良精液标本相同的处理方法或者使用洗涤的方法处理。,染色方法,推荐的染色方法有 Papanicolaou染色法 Shorr染色法 Diff-Quik染色法。,用上述三种染色方法，在光学显微镜亮视野下观察，精子头部的顶体区染成淡蓝色pale blue，顶体后区染成深蓝色dark blue，中段可能染成红色，尾部染成蓝色或淡红色reddish。
5、通常位于头部背后或中段周围的胞浆小滴染成粉红色、红色（巴氏染色）或者橘红色（Shorr染色）。,改良巴氏染色步骤,1、80%乙醇 30秒 2、50%乙醇 30秒 3、纯水 30秒 4、Harris苏木精 4分钟 5、纯水 30秒 6、酸性乙醇 48次* 7、流水洗 5分钟 8、50%乙醇 30秒 9、80%乙醇 30秒,10、95%乙醇 至少15分钟 11、橙黄G6 1分钟 12、95%乙醇 30秒 13、95%乙醇 30秒 14、95%乙醇 30秒 15、EA-50 1分钟 16、95%乙醇 30秒 17、95%乙醇 30秒 18、100%乙醇 15秒 19、100%乙醇 15秒,主要溶液的
6、作用,乙醇 固定细胞；并且使细胞脱水 苏木精 使细胞核染成蓝色 酸性乙醇 去除胞浆中非特定区域的染料 （脱色） 自来水 去除未与细胞核结合的苏木精 橙黄G-6 使胞浆染成粉红色 EA-50 使胞浆染成粉红色,WHO第4版与第5版巴氏染色主要步骤比较,1、第5版共19步，第4版共23步，减少了4个步骤。 2、由于苏木精后没有流水冲洗，导致染液残留较多，酸性乙醇的更换频率明显增加。 3、第5版染色所需时间较4版约增加10分钟以上。 4、染色效果相似。,WHO第4版与第5版巴氏染色总结,WHO第4版与第5版染色效果比较,WHO第4版,WHO第5版,Shorr染色步骤,1、流水 浸12-15次* 2、
7、苏木精 1-2分钟 3、流水 浸12-15次* 4、乙醇胺 浸10次* 5、流水 浸12-15次 6、50%乙醇 5分钟 7、Shorr溶液 3-5分钟 8、50%乙醇 5分钟 9、75%乙醇 5分钟 10、95%乙醇 5分钟,Shorr染色可以得到与巴氏染色相近的正常形态精子百分率,精子形态的快速染色程序,1、快速染液1 10秒 2、快速染液2 5秒 3、流水 浸10-15次去除多余染剂,一些用快速染色法染的涂片背景很深，染色的质量可能比巴氏染色方法差。,精子封片前的处理,有两种液体封片剂：溶于乙醇的和不溶于乙醇。 使用溶于乙醇的封片剂，染色完成后，在涂片未干的情况下立即使用该封片剂进行封片
8、。 使用不溶于乙醇的封片剂，将涂片在二甲苯中浸1分钟（在通风柜中操作），沥干1-2秒钟后立即封片，封片时应保持涂片的湿润。,精子涂片的封片,1、滴2-3小滴封片剂在载玻片上。 2、将盖玻片（24 mm 50 mm 或 24 mm 60 mm最合适）直接放置在载玻片上。 3、盖玻片先接触封片剂，从载玻片的长边开始放置，以防止产生气泡。 4、如有需要，轻轻地按压盖玻片的顶端以使气泡移到载玻片的边缘。 5、擦掉载玻片底下多余的二甲苯（如果使用二甲苯）。 6、在通风柜内，把已封片的涂片水平地放在载玻片烘干架上，或者放在吸水纸上干燥24小时。,精子形态学评估标准,在评估精子正常形态时应采用严格标准（Kr
9、uger et al.,1986; Menkveld et al., 1990; Coetzee et al., 1998）。 精子包括头、颈、中段、主段和末端。由于通过光学显微镜很难观察到精子末端，因此可以认为细胞是由头（和颈）和尾（中段和主段）组成。只有头和尾都正常的精子才认为是正常的。所有处于临界状态的精子均认为是异常。,WHO第5版与第4版精子形态判断标准比较,WHO第5版与第4版精子形态判断标准比较,WHO第5版与第4版精子形态判断标准比较,WHO第四版与第五版精子形态学评估标准比较研究,研究目的：比较WHO第四版与第五版精子形态学评估标准的变化。 研究对象： 1000个精子图片、一
10、张精子形态质控片 研究方法： 1、用WHO第四版的评估标准，对上述精子进行评估。 2、精子库9名工作人员学习第五版精子形态学评估标准及精子图谱，并进行室内质量控制，统一评估标准，工作人员之间无显著差异。 3、用WHO第五版的评估标准，对上述精子再次进行评估。 4、比较上述两种标准分析结果的差异。 研究结果： WHO第五版与第四版相比： 1、形态正常精子百分率高、头部异常率低、尾部异常率低，有显著差异； 2、颈和中段异常率、胞浆小滴率无显著差异。,两种标准评估结果比较,WHO第5版与第4版精子形态学评估标准的主要区别,1、头部外形轮廓判断变的宽松，仅要求大致成椭圆形。 2、对头部空泡的判断更严格
11、，多于2个空泡或者顶头后区空泡，都判断为异常。 3、颈部的长度有原来头部的1.5倍缩短为1倍，并且宽度比第4版要更细。 4、尾部只有尖锐的折角才判断为异常，而不再以弯曲角度90度为界限。 5、胞浆小滴的标准无差异。,5th-WHO手册精液参考值下限,精子形态学评估,正常形态精子百分率与受精率相关 异常形态精子的类型、部位和程度更重要,WHO第五版手册中精液参考值的来源,12个月内使女方妊娠的男性精液参数 4001900份精液标本（来自3大洲，8个国家） 单侧参考范围，第5 百分位数作为下限 任何精液参数的高值都不能判断生育力,WHO第5版手册中的精子图谱分析,424个 细 胞,精子：364个,
12、正常：91个,异常：262个,未评估：11个,非精子：58个,头部异常：201个,中段异常：134个,主段异常：35个,胞浆异常：12个,未分类：2个,备注： 1、第4版图谱中仅评估47个精子，其中正常精子8个，异常精子39个。 2、未评估：由于聚焦不好或精子重叠。 3、非精子细胞包括：巨噬细胞、单核细胞、降解的白细胞、上皮细胞、细菌等。,共14 Plate,1、头部外形,对于头部异常的描述,梨形 锥形 扁平底 轮廓不规则,大头针样 无定形头 小头 圆头,2、空泡,多于2个空泡,顶体后区空泡,表面有空泡,空泡20%,3、顶体,顶体70%,顶体40%,对于颈和中段异常的描述,增粗,轮廓不规则,插入,弯曲,1、中段异常,2、胞浆小滴,胞滴小于1/3（CD）,胞滴大于1/3(ERC),对于主段异常的描述,双尾,环状,卷曲,短尾,粗,弯曲,非精子细胞 （一）,退化的巨噬细胞,多核型白细胞,上皮细胞,杆 菌,单核细胞,吞噬中的巨噬细胞,退化的白细胞,巨噬细胞,精子细胞,生精细胞,精母细胞,分裂中的精母细胞,分裂中的精子细胞,退化的精子细胞,非精子细胞 （二）,未评估精子,难以聚焦,重叠,未分类细胞,Thank You !,