《激流灌注式生物反应器培养猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(R98株)工艺的研究 Trial-manufacture of porcine reproductive and respiratory syndrome live vaccine with suspension and perfusion bioreactor.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《激流灌注式生物反应器培养猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(R98株)工艺的研究 Trial-manufacture of porcine reproductive and respiratory syndrome live vaccine with suspension and perfusion bioreactor.pdf（3页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、第3 5 卷第2 期 2 0 1 3 年2 月 中国预防兽医学报 C h i n e s eJ o t t r n a lo fP r e v e n t i v eV e t e r i n a r yM e d i c i n e V 0 1 3 5 N o 2 F e b 2 0 1 3 d o i ：1 0 3 9 6 9 0 i s s n 1 0 0 8 - 0 5 8 9 2 0 1 3 0 2 0 6 激流灌注式生物反应器培养猪繁殖与呼吸综合征活疫苗 ( R 9 8 株) 工艺的研究 郑朝朝，邱贞娜，李建丽，郁宏伟+ ，梁武，杨保收 ( 瑞普( 保定) 生物药业有限公司，河北保
2、定0 7 1 0 0 0 ) 摘 要：为建立猪繁殖与呼吸综合征( P R R S ) 疫苗的大规模生产工艺，本研究应用工作体积为1 0 0L 的激流灌 注式生物反应器培养M a r c 1 4 5 细胞，接种P R R S 病毒R 9 8 株( P R R S V R 9 8 ) ，进行病毒培养，结果显示，培养6d 细胞数量可增殖5 倍7 倍，单次病毒收获量相当于30 0 0 个50 0 0 个1 0L 转瓶，而且培养的P R R S V - R 9 8 各项 指标均符合规程要求。本研究在国内首次建立了应用1 0 0L 激流灌注式生物反应器制备P R R S 活疫苗的生产工 艺，为规模化培养_
3、 T - 艺的推广与使用提供了技术参数。 关键词：生物反应器；规模化培养；猪繁殖与呼吸综合征活疫苗 中图分类号：$ 8 5 2 6 5文献标识码：A文章编号：1 0 0 8 0 5 8 9 ( 2 0 1 3 ) 0 2 0 1 0 7 0 3 T r i a l m a n u f a c t u r eo fp o r c i n er e p r o d u c t i v ea n dr e s p i r a t o r ys y n d r o m e l i v ev a c c i n ew i t hs u s p e n s i o na n dp e r f u s i
4、o nb i o r e a c t o r Z H E N GZ h a o z h a o ，Q UZ h e n n a ，L IJ i a n - l i ，Y UH o n g - w e i ，L I A N GW u ，Y A N GB a o s h o u ( R i n g p u ( B a o d i n g ) B i o l o g i c a lP h a r m a c e u t i c a lC o L t d ，B a o d i n g0 7 1 0 0 0 ，C h i n a ) A b s t r a c t ：I nt h ep r e s e
5、n ts t u d y ，t h eI O O Lv o l u m eo fs u s p e n s i o na n dp e r f u s i o nb i o r e a c t o rw a sa p p l i e dt op r e p a r eM a r c - 1 4 5 c e l l sa n dt h el i v ev a c c i n ew a sp r o d u c e dw i t hp o r c i n er e p r o d u c t i v ea n dr e s p i r a t o r ys y n d r o m ev i r u
6、 s ( P R R S V ) R 9 8s t r a i n T h er e s u l t s s h o w e dt h a tn u m b e ro fc e l l si n c r e a s e db y5t o7f o l d si n6d a y sa n dt h ey i e l df r o ms i n g l ev i r u sh a r v e s tw a se q u i v a l e n tt o3 ，0 0 0t o 5 ，0 0 0 1 0Lf l a s k s ，a n dt h eP R R S VR 9 8s t r a i n s
7、 a t i s f i e sa l lt h eb i o l o g i c a lq u a l i f i c a t i o n sa n dr e q u i r e m e n t s O u rs t u d yi st h ef i r s t r e p o r t o na p p l y i n g10 0Lv o l u m eo ft o r r e n ti ns u s p e n s i o na n dp e r f u s i o nb i o r e a c t o ri nt h ep r o d u c t i o no fP R R S Va n
8、 di tp r o v i d e dt h e b a s i sf o rl a r g es c a l ec e l lc u l t u r ei nv a c c i n ep r o d u c t i o n K e yw o r d s ：b i o r e a c t o r ；s u s p e n s i o na n dp e r f u s i o nb i o r e a c t o r ；p o r c i n er e p r o d u c t i v ea n dr e s p i r a t o r ys y n d r o m el i v ev a
9、 c c i n e 应用转瓶培养细胞制备疫苗抗原的传统生产方 式，由于其自身技术局限性，已经显现出生产效率 低、能耗高等不足。应用生物反应器规模化细胞培 养制备疫苗抗原，不但能够降低生产成本，而且能 够提高产品质量，已经成为国内各兽用生物制品生 产企业关注和研究的焦点。许多生物活性物质、疫 * C o r r e s p o n d i n ga u t h o r 苗、载体 2 - 3 、药用蛋白【4 1 等均可以通过动物细胞大 规模培养制备。本研究采用最新工艺的激流式生物 反应器对猪繁殖与呼吸综合征病毒( P o r c i n e r e p r o d u c t i v ea n
10、dr e s p i r a t o r ys y n d r o m ev i r u s ，P R R S V ) 的培养工艺进行了初步探索，为该生产工艺的大规 模应用奠定了基础。 收稿日期：2 0 1 2 0 4 0 1 基金项目：河北省农业科技成果转化资金项目( 1 2 8 2 0 4 2 0 D ) 作者简介：郑朝朝( 1 9 8 3 一) ，女，河北清苑人，硕士研究生，主要从事动物生物制品研究 4 通信作者：E m a i l ：y u h o n g w e i 2 0 0 5 1 2 6 c o r n 万方数据 1 0 8中国预防兽医学报 2 0 1 3 焦 1 材料和方法
11、1 1病毒、细胞及实验动物P R R S VR 9 8 株 ( P R R S V R 9 8 ) 由瑞普( 保定) 生物药业有限公司保存； P R R S V S 1 株( P R R S V S 1 ) 强毒由南京农业大学惠赠； M a r c 1 4 5 细胞购自中国兽医药品监察所；7 日龄 P R R S V 抗体阴性健康仔猪购自顺平某猪场。 1 2 主要试剂及设备高糖D M E M 培养基购自 G i b c o 公司；葡萄糖测定试剂盒购自上海荣盛生物 药业有限公司；新生牛血清购自内蒙古金源康生物 工程有限公司；胰蛋白酶购自G i b c o 公司；A P 2 0 0 型激流灌注式多
12、功能生物反应系统为杭州安普生物 工程有限公司( 工作容积1 0 0L ) 产品。 1 3种毒的增殖将效价为1 0 7 2 T C I D m L 的 P R R S V R 9 8 种毒以P B S 稀释至2m L ，接种至培养 于1 0L 转瓶的M a r c 1 4 5 细胞中，2 支转瓶，于 3 7 培养，当细胞病变( C P E ) 达到7 5 8 0 时收 获病毒液。测定病毒效价，2 0 保存备用。 1 4 细胞复苏与转瓶培养以常规方法复苏M a r c 一14 5 细胞，传代增殖至5 0 个1 0L 转瓶。每6h 取样， 用葡萄糖检测试剂盒检测营养液中的葡萄糖浓度。 1 5 细胞罐
13、体接种与培养以常规方法消化全部细 胞，收集细胞悬液，混匀后进行细胞计数。将所得 的细胞悬液接种至反应器灌注袋内，静置吸附 4 0m i n 。吸附过程完成后加入含1 0 新生牛血清的 D M E M 培养基。按照预实验获得的数据设定设备参 数，启动细胞培养程序，进行细胞培养。 每日1 0 ：0 0 和2 2 ：0 0 取样，用葡萄糖检测试剂盒 检测营养液葡萄糖浓度。当残糖浓度低于1g L 时I s - 6 ， 开始补液或者换液m ，维持残糖浓度，并根据葡萄 糖消耗量，分析细胞生长情况。 1 6 病毒培养细胞培养至葡萄糖消耗量趋于平稳 时，表示细胞密度已达到最大。弃去培养液，用不 含血清的D M
14、 E M 冲洗，接种P R R S V R 9 8 ，静置吸 附3 0m i n 。以2 新生牛血清的D M E M 培养液按照 预试验获得的数据设定设备参数，启动病毒培养程 序，进行病毒培养。 自接毒后1 2h 开始每6h 取样测糖，每2h 取 样测培养液效价，绘制病毒效价曲线。接毒2 4h 补 充2 倍浓缩D M E M 液和2 0 L 的葡萄糖。 1 7 病毒液的收获与检验接毒后3 0h 收获病毒 液。一次性收获灌注袋内的病毒上清液，将含有纸 片载体和部分病毒液的灌注袋冻融两次后，取病毒 上清液与已收获的病毒液混合，测定病毒液效价， 根据R e e d M u n c h 法计算T C
15、l D J m L ，2 0 冷冻保 存。按照中华人民共和国兽药典( 2 0 1 0 年版) 附 录进行纯净性检验。 1 8 疫苗的制备与检验 1 8 1疫苗制备将检验合格的病毒液混合于同一 容器，加入牛乳蔗糖冻干保护剂充分摇匀，定量分 装，迅速冷冻真空干燥即得成品。 1 8 2 疫苗安全性检验按瓶签注明头份，将疫苗 用生理盐水稀释为每毫升含1 0 头份，肌肉注射7 日 龄P R R S V 抗体阴性健康仔猪3 头，每头1m L ，观 察1 4d 。 1 8 3 疫苗效力的检验用3 0 日龄P R R S V 抗体阴 性健康仔猪5 头，每头颈部肌肉注射疫苗1 头份， 同时设同日龄P R R S
16、 V 抗体阴性健康仔猪3 头作为 对照，在同等条件下饲养，接种后3 0d ，用 P R R S V S 1 株( 1 0 5 o T C I D s d m L ) 攻击，滴鼻2m L 头， 每日测定体温，连续观察2 8d 。 2结果 2 1种毒的增殖共制备生产用种毒80 0 0m L ， 经检测，种毒效价为1 0 7 3 3 T C I D d m L 。 2 2 细胞转瓶培养细胞培养7 2h 可以长成良好 单层。葡萄糖消耗量呈递增趋势，至7 2h 分散时葡 萄糖消耗量可达4g L 2 4h 。 2 3 细胞罐体接种与培养将转瓶细胞全部消化， 共收获细胞悬液1 2 5L ，细胞密度约为6 0
17、 X 1 0 s c e l l s m L 。在接种细胞后的0 4 4 8h 内葡萄糖 肖耗量 相对较少，显示细胞生长缓慢；4 8h 7 2h ，葡萄 糖消耗量逐渐增加；7 2h 后，开始补液、换液，维 持葡萄糖浓度不低于Ig m ；9 6h 1 2 0h 葡萄糖消 耗量达到峰值，显示细胞密度达到峰值；1 2 0h 1 4 4h 葡萄糖消耗量基本不变，显示细胞生长状态 相对稳定，确定1 2 0h 为最佳接毒时机( 图1 ) 。 2 4 病毒的培养、收获与检验病毒培养过程中共 补充2 倍浓缩D M E M1 0L ，葡萄糖2L 。共收获病 毒液1 0 5L 。经检验各样品病毒含量，效价最高滴
18、度出现在第2 8h ，为1 0 8 8 T C I D ，o m L ，收获的病毒液 效价为1 0 8 8T C I D 5 0 m L ( 图2 ) 。 收获的病毒液按照中华人民共和国兽药典 万方数据 第2 期 郑朝朝，等激流灌注式生物反应器培养猪繁殖与呼吸综合征活疫苗( R 9 8 株) 工艺的研究 ( 2 0 1 0 年版) 附录进行纯净性检验，无细菌、霉菌、 支原体生长和外源病毒污染；病毒液对猪安全无副 作用。 p d 1 2 44 87 2，61 2 01 4 4 C u l t u r es t a g e s 图1细胞培养阶段葡萄糖消耗量变化 F i g 1C 删衄叩妇o f 曲
19、I i n 凼位嬲n te e lc u l t u r e 咖觯 o 1 0 - 皇 弋9 5 59” 卜 当8 5 一 矗8 ； = ：7 5 - 己 ； 7 、 1 21 41 61 82 U2 2 2 42 6 2 8 3 U H O u r sp o s tv i r u si n o c u l a t i o n 图2 病毒液效价曲线 F i g 2 D y n l l n l i o Bo ft h eo fr i m s 蛔a tm 伍釉tc u l t u r et i m e s 2 5 疫苗成品的安全和效力检验接种后观察 1 4d ，所有实验仔猪精神、食欲无明显变化，无
20、异 常临床反应，疫苗安全检验合格。空白对照猪全部 发病( 3 3 ) ，而且死亡2 头，免疫猪全部保护( 5 5 ) 。 疫苗效力检验合格。 3讨论 应用该工艺生产P R R S V R 9 8 疫苗，通过在线监 控溶氧、p H 、温度、振荡器转速、培养液灌注速度 等数字化指标，将以往肉眼观察、依靠经验判定转 变成更为科学化的、数字化的判定标准，提高了精 确度，能够更好地控制细胞及病毒培养条件p ，有 利于稳定疫苗质量，提高产品批问稳定性。同时使 用一次性耗材，既减小了污染几率又极大地降低了 生产成本，符合疫苗企业生产要求。 该工艺研究中，最终收获病毒液滴度为1 0 8 8 T C I D 劬
21、m L ，而传统转瓶工艺所获病毒液滴度只能达 到1 0 7 oT C I D 5 0 m L 1 0 75T C I D m L ，滴度提高了2 0 倍6 0 倍，相当于对转瓶工艺所获病毒液进行了2 0 倍6 0 倍浓缩，此“间接浓缩作用”克服了疫苗生 产过程中活疫苗半成品浓缩导致抗原损失大、易造 成成品污染的技术难题；此外，抗原滴度的提高极 大提升了同剂量疫苗中抗原的含量，对免疫效果的 增强具有重要意义。 通过检测细胞对培养基中葡萄糖的消耗量来确 定细胞数量及状态，为规模化培养中较为常用的方 法，该工艺研究中，细胞接种至反应器后，单日耗 糖量逐渐增加，表明细胞生长处于增殖期，直至 1 2 0
22、h ，细胞耗糖量趋于稳定，表明细胞生长已处于 稳定期，细胞数量最多，从而确定为最佳接毒时 问。病毒培养过程中浓缩液和葡萄糖的补充是为 P R R S V 的增殖提供充足的营养物质，而确定接毒后 2 4h 为最佳补液时问、3 0h 为最佳收毒时问为多次 试验所得结果，对于不同病毒及细胞培养体系，该 时间需重新摸索。 检验结果显示，在该工艺研究中应用激流灌注 式生物反应器培养M a r c 1 4 5 细胞制备的P R R S V R 9 8 活疫苗安全、有效、无副作用，各项指标符合国家 要求。本研究建立的应用1 0 0L 激流灌注式生物反 应器制备P R R S V 活疫苗的生产工艺，为国内首次
23、 报道，为规模化培养工艺的推广、使用以及进一步 研究奠定了基础。 参考文献： 1 G e n z e lY ，F i s c h e rM ，R e i c h lU S e r u m f l e ei n f l u e n z aV I I I I Sp r o d u c t i o na v o i d i n gw a s h i n gs t e p sa n dm e d i u me x c h a n g ei n l a r g e - c u l t u r e J 】V a c c i n e ，2 0 0 6 ，2 4 ：3 2 6 1 3 2 7 2 2 K n
24、o pDR ，H a r r e l lH B i o r e a c t o rp r o d u c t i o no fr e c o m b i n a n th e r - p e ss i m p l e xv i r u sv e c t o r s J B i o t e c h n o lP r o g ，2 0 0 7 ，2 3 ( 3 ) ： 7 1 5 7 2 1 3 M o r r o wJR A d v a n c e si na n t i b o d ym a n u f a c t u r i n gu s i n gm a m - m a l i a nc
25、e l l s J N a tB i o t e c h n o l ，2 0 0 4 ，2 2 ：1 3 9 3 1 3 9 8 4 W u r mFM P r o d u c t i o no fr e c o m b i n a n tp r o t e i nt h e r a p e u t i c si n c u l t i v a t e dm a m m a l i a nc e l l s 【J 】N a tB i o t e c h n o l ，2 0 0 4 ，2 2 ： 1 3 9 3 1 3 9 8 5 史秀山生物反应器培养V e r o 细胞的生长代谢与限制因素
26、 研究中国热带医学，2 0 0 6 ，6 ( 1 ) ：1 3 - 1 5 6 M e n d o n c aRZ ，A r r 6 z i oSJ ，A n t o n i a z z iMM ，e ta 1 M e t a b o l i c a c t i v e - h i 【g hd e n s i t yV e r oc e l lc u l t u r e so nm i c r o c a r r i e r sf o l l o w i n g a p o p t o s i sp r e v e n t i o nb yg a l a c t o s e 9 1 u t a
27、 m i n ef e e d i n g J J B i o t e c h n o l ，2 0 0 2 ，9 7 ( 1 ) ：1 3 - 2 2 【7 王常勇采用微载体技术大规模培养组织工程种子细胞 J 生物医学工程与临床，2 0 0 2 ，6 ( 1 ) ：5 1 5 4 8 张丽旌，任邦彦，李平忠，等V e r o 细胞微载体不同培养 方法的评价 J 生物技术通讯，2 0 0 1 ，1 2 ( 2 ) ：9 9 1 0 2 【9 宋羚羚，李峦峰，郭芝香，等激流灌注式反应器大规模 培养V E R O 细胞工艺研究 c 第十三次学术研讨会论文集， 2 0 1 0 ，1 5 2 6 - 1 5 2 9 ( 本文编辑：张朝霞) 万方数据