迷迭香吸嗅对血管性痴呆大鼠学习记忆及海马内5-ht和gaba含量的影响.pdf

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1、 分类号： 密级： U D C ： 编号： 学 位 论 文 迷迭香吸嗅对血管性痴呆大鼠学习记忆及海迷迭香吸嗅对血管性痴呆大鼠学习记忆及海 马内马内 5 5- -HTHT 和和 GABAGABA 含量的影响含量的影响 The Effect of Rosemary Treatment on Learning and Memorys Improvement and content of 5-HT and GABA of Hippocampus through Olfactory Pathway in VD Rats 窦窦 云云 龙龙 指导教师姓名 高晓平 副教授 安徽医科大学第一附属医院康复科 李光

2、武 副教授 安徽医科大学神经生物研究所 申请学位级别 硕士 专 业 名 称 康复医学与理疗学 提交论文日期 2013-3-19 论文答辩日期 2013-5-22 学位授予单位和日期 安徽医科大学 答辩委员会主席 评 阅 人 2013 年 05 月 安徽医科大学安徽医科大学 Anhui Medical University 硕士学位论文硕士学位论文 迷迭香吸嗅对血管性痴呆大鼠学习记忆及海马内 5-HT 和 GABA 含量的影响 The Effect of Rosemary Treatment on Learning and Memorys Improvement and content of 5

3、-HT and GABA of Hippocampus through Olfactory Pathway in VD Rats 作者姓名 窦云龙 指导教师 高晓平 副教授 安徽医科大学第一附属医院康复医学科 李光武 副教授 安徽医科大学神经生物研究所 学科专业 康复医学与理疗学 研究方向 脑卒中的基础及临床康复研究 论文工作时间 2011 年 10 月至 2013 年 3 月 学位论文原创性声明 本人所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果。 与我一同工作的同志对本研究所做的

4、任何贡献均已 在论文中作了明确说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 日 期： 学位论文使用授权声明 本人完全了解安徽医科大学有关保留、使用学位论文的规定：学校有权保留 学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版， 有权允许 论文进入学校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索， 有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。愿意将本人的学位论文提交中国博士 学位论文全文数据库 、 中国优秀硕士学位论文全文数据库和中国学位论文 全文数据库中全文发表，并可以以电子、网络及其他数字媒体形式公开出版， 并同意编入 CNKI中国知识资源总库 ，在中国博硕士学位论文评价数据库 中使

5、用和在互联网上传播。保密的学位论文在解密后适用本规定。 学位论文作者签名： 导师签名： 日期： 日期： 1 目 录 英文缩略词表 4 中文摘要 5 英文摘要 7 1 前言 . 9 1.1 血管性痴呆的概况 9 1.2 芳香疗法的研究进展 9 1.3 嗅觉通路的概况 . 10 1.4 VD 大鼠造模和学习记忆观察的方法 12 1.5 海马与学习记忆 . 13 1.6 神经递质 5-HT 和 GABA . 14 2 材料与方法 15 2.1 实验动物 . 15 2.2 主要试剂与器材 . 15 2.2.1 试剂 15 2.2.2 器材 15 2.2.3 主要溶液的配制 16 2.3 动物模型制备与

6、分组 . 16 2.3.1 实验动物模型的建立 16 2.3.2 模型大鼠水迷宫筛查 17 2.3.3 动物模型的分组 18 2 2.4 给药方式 . 18 2.5 神经行为学观察 . 19 2.6 形态学观察 . 19 2.6.1 石蜡切片 19 2.6.3 免疫组化 21 2.6.4 细胞计数 22 2.7 统计学分析 . 22 3 结果 22 3.1 水迷宫实验结果 . 22 3.1.1 术后 4 周水迷宫的结果 22 3.1.2 用药后水迷宫结果 23 3.2 HE 染色结果 24 3.3 免疫组化结果 . 24 4 讨论 25 4.1 慢性脑缺血对学习记忆的影响 . 25 4.2 学

7、习记忆障碍的神经递质紊乱机制 . 26 4.3 嗅觉给药通路 . 27 4.4 芳香治疗的精油吸嗅 . 28 4.5 迷迭香吸嗅改善 VD 大鼠学习记忆 29 5 结论 . 30 参考文献 30 3 附录 35 本人简历 41 致谢 43 综述 44 安徽医科大学硕士学位论文 4 英文缩略词表 英文缩写 英文全称 中文全称 2VO 2-vessel occlusion 双血管阻断法 VD vascular dementia 血管性痴呆 5 -HT 5- hydroxytryptamine 五羟色胺 GABA gamma-aminobutyric acid -氨基丁酸 HE hematoxyli

8、n-eosin 苏木精-伊红 AD Alzheimers Disease 阿尔茨海默病 NMDA N-methyl-Daspartic acid N-甲基-D-天冬氨酸 CCA common carotid artery 颈总动脉 PBS Phosphate Buffer Solution 磷酸盐缓冲液 ASP Aspartic Acid 天冬氨酸 Glu Glutamate 谷氨酸 CNS central nervous system 中枢神经系统 AMPA alpha-amino-3-hydroxy-5-rnethyliso xazole-4-propionic acid -氨基-3-羧基

9、-5-甲基异恶 唑-4-丙酸 LTP 1ong-term potentiation 长时程增强 Ach acetylcholine 乙酰胆碱 AchE acetylcholinesterase 乙酰胆碱酯酶 ChAT choline acetyltransferase 乙酰胆碱转移酶 DA dopamine 多巴胺 安徽医科大学硕士学位论文 5 迷迭香吸嗅对血管性痴呆大鼠学习记忆及海马内 5-HT 和 GABA 含量的影响 中文摘要 目的 本实验采用改良的双侧颈总动脉结扎法建立血管性痴呆大鼠模型，观察迷迭香吸 嗅后血管性痴呆大鼠学习记忆功能的改善情况；并通过免疫组化法检测迷迭香吸 嗅后实验大鼠

10、海马内 5-HT 和 GABA 含量的变化情况，初步探讨迷迭香吸入的作 用机制及临床应用价值。 方法 1. VD 大鼠模型制备： 将健康的 SD 大鼠用改良的 2VO 法造成 VD 模型， 即先结扎左 侧颈总动脉，1 周后用同样的方法结扎右侧颈总动脉。 2. 模型大鼠水迷宫筛查：手术后 4 周时，初步筛选并存活的模型大鼠 16 只，正 常大鼠和假手术大鼠各 8 只。 通过 Morris 水迷宫测定 24 只大鼠的空间学习记忆成 绩，记录定位航行实验中大鼠找到安全平台的时间（即逃避潜伏期）和空间探索 实验中大鼠穿越原平台所在位置的次数 （即穿台次数） 为实验指标， 时间均以 120s 为限。 2

11、.分组及给药：将造模成功的大鼠随机分为模型组和迷迭香组，另设正常组和假 手术组对照。 （1） 迷迭香组 （n=8） : 每天上、 下午分别予以 1%浓度的迷迭香吸嗅， 每次 30min； （2）VD 模型组（n=8） ：使用蒸馏水替迷迭香精油，其他同迷迭香组； （3）假手术组（n=8）：假手术组分离出 2 侧颈总动脉但不予结扎，余实验步骤 同 VD 模型组； （4）正常组（n=8）：不做任何手术处理，余实验步骤同模型组。 3. 神经行为学和形态学观察 在用药后 5 周时，再次使用 Morris 水迷宫测定大鼠的空间学习记忆成绩，水迷 安徽医科大学硕士学位论文 6 宫实验的方法同前。在神经行为学

12、实验结束后，将全部大鼠断头取脑，制作石 蜡切片，进行 HE 染色观察大鼠海马区的病理形态学变化，再用免疫组化法观察大 鼠海马区 5-HT 和 GABA 含量的变化情况。 结果 1.术后 4 周时， 手术组的逃避潜伏期明显长于正常组， 差异有统计学意义(P0.05)； 穿台次数显著少于正常组,差异有显著统计学意义（P0.05）；假手术组和正常组 相比，潜伏期与穿台次数均无明显差异（P0.05） 。 2.用药 5 周时，迷迭香吸嗅组的逃避潜伏期短于模型组，差异有统计学意义 (P0.05)；穿台次数显著多于模型组（P0.05）。模型组大鼠的逃避潜伏期明显 长于正常组,差异有显著统计学意义（P0.05

13、）；穿台次数显著少于正常组,差异 有显著统计学意义（P0.05）。 3.免疫组化结果中，模型组的 5-HT 和 GABA 的阳性神经元较正常组明显减少 （P0.05），与模型组比较，迷迭香吸嗅组的阳性神经元数明显增多（P0.05）。 结论结论 1.改良的 2VO 法建立大鼠 VD 模型，对大鼠脑组织损伤较小且会出现明显的学习记 忆障碍，符合 VD 临床的特点。 2.迷迭香吸嗅对 VD 大鼠的学习记忆障碍有明显的改善作用。 3.迷迭香改善VD模型大鼠的学习记忆能力可能与增加海马内5-HT和GABA的含量有 关。 关键词关键词 迷迭香 血管性痴呆 学习记忆 5-羟色胺 -氨基丁酸 安徽医科大学硕士

14、学位论文 7 The Effect of Rosemary Treatment on Learning and Memorys Improvement and content of 5-HT and GABA of Hippocampus through Olfactory Pathway in VD Rats Abstract Objective In this study,we established rat VD model after chronic cerebral ischemia by modified ligaturing bilateral common carotid ar

15、tery. In order to study the effect of rosemary treatment on learning and memory impairment caused by VD through olfactory pathway. On the other hand, in order to test the changes of 5-HT and GABA in the hippocampus of VD rats after treated by rosemary with immunohistochemistry methods. Primarily to

16、study the effect and mechanism and clinical application of rosemary treated on learning and memory impairment caused by VD through olfactory pathway. Methods 1.Preparing VD rat model. Establishing rat VD model by modified ligaturing bilateral common carotid artery, namely as the left common carotid

17、occlusion with a week later ligatured the right one. 2.Model rat screened by Morris water maze. 4 weeks after the surgery ,there were 16 model rats, normal rats and sham operation rats were both 8. The learning and memory capacity of 32 rats was tested by Morris water maze .In this test ,the escapin

18、g latency of the rats to find the hidden platform in orientation navigate test and the numbers of rats crossing the former platform in spatial probe test were recorded .The time was limited within 120 seconds . 3.Dividing rats and Drug delivery. Modele rats were randomly divided into model group and

19、 rosemary group, and the normal group and the sham sham operation group were separated to control. (1) rosemary group(n=8):this group were treated with eugenol(the consistence is 1%) 3 days after surgery twice a day， and each time lasted 30 minutes . (2) VD model group (n =8): rosemary essential oil

20、 were replaced by distilled water, Then the rats in this group get the same procedures as the rosemary 安徽医科大学硕士学位论文 8 group.(3) sham operation group (n =8): the rats in this group submitted to the bilateral carotid arteries were Isolated but not ligatured, Then the experiment steps were same with VD

21、 model group;(4) normal group (n=8): the rats were not gave surgery and treated with rosemary .Then the rats in this group also got the same procedures as the VD group. Result 1. 4 weeks after surgery, there was significant differences between operation group and normal group in the latency and the

22、times through platform(P0.05). There was unsignificant differences between sham operation group and normal group in the latency and the times through platform (P0.05). 3. 5 weeks after treatment, there was significant differences between rosemary group and VD group in the latency and the times throu

23、gh the former platform (P0.05). Aslo compare to normal control group，VD group had significant differences in the latency and the numbers through the former platform (P0.05). 4. In the results of immunohistochemistry ,compare to normal control group, in the hippocampus of VD group rats were significa

24、ntly decreased (P0.05). Also the content of 5-HT and GABA in the hippocampus between the treatment group and VD group rats were significantly different(P0.05). Conclusion 1.The VD rat model produced by the modified 2VOM had less traumatic brain injury, but with significant learning and memory impair

25、ment. This is fitting with the clinical features of VD. 2. After the treatment of rosemary through olfactory pathway, learning and memory dysfunction of rats with VD could be improved. 3. The mechanism of rosemary improving learning and memory impariment of VD rats was related to the increaseing of

26、the content of 5-HT and GABA of Hippocampus. Keyword rosemary/Vascular Dementia / learning and memory /5-HT/GABA 安徽医科大学硕士学位论文 9 迷迭香吸嗅对血管性痴呆大鼠学习记忆及海马内 5-HT 和 GABA 含量的影响 1 前言 1.1 血管性痴呆的概况 血管性痴呆（vascular dementia, VD）是脑血管疾病导致的认知功能障碍临床 综合征，我国VD占痴呆的比例较高患病率仅次于阿尔茨海默病(Alzheimers Disease, AD), 是导致痴呆的第2位病因1。

27、VD患者的病情常表现波动性病程或阶梯 式恶化，认知功能呈进行性下降，伴记忆功能、定向力、注意力、语言功能、视 空间功能等认知域的缺损，往往妨碍日常生活、工作程序和社会交往等。但VD也 是迄今为止唯一可防治的痴呆, 如果早期治疗具有可逆性。VD患者多有卒中史， 约半数的脑卒中患者存在一定程度的认知功能障碍， 其中1/3会发展为明显的痴呆。 大量病理学和流行病学的研究发现脑缺血性血管病是VD的主要病因，包括完全性 和不完全梗死造成的血管损伤。脑缺血后特别是累及额叶前部的皮质下环路、海 马结构等易造成认知功能特别是学习记忆功能的下降，进而发展为痴呆。慢性脑 缺血后出现一系列的损伤级联反应，导致线粒体

28、功能失调性能量衰竭、Ca2+超载、 氧化应激、炎症反应，甚至神经元凋亡2 。目前，针对这些病理生理学机制起到 治疗性的药物是国内外研究的热点，但面市的药物存在价格昂贵、吸收不良、难 以进入血脑屏障、不良反应多、药效强烈等诸多限制。新颖的治疗方法和潜在的 药物正成为研究的趋势，目前芳香疗法已试用于VD的治疗，而研究表明吸入特定 的芳香物质可改善痴呆患者的认知功能3-4。 1.2 芳香疗法的研究进展 芳香疗法是将气味芳香的药物，如迷迭香、丁香、麝香等，制成适当的剂型， 通过吸嗅、按摩等途径，将植物的芳香物质吸人体内，发挥芳香物质所具有的生 安徽医科大学硕士学位论文 10 理和心理方面的作用，用于减

29、轻、预防或治疗人体某些疾病的治疗方法 5。芳香疗 法有时也被称为做香薰疗法，芳香物质刺激嗅觉系统是芳香疗法最简易而重要的 治疗途径。精油是最重要的芳香物质，是从芳香植物中萃取得到的挥发性成分。 精油事实上并不仅是一种油，而是植物中的天然有机化合物，成分复杂的植物精 华。在人类的感觉中，嗅觉大概是当今医学评价最不充分的一种。然而，越来越 多的研究证明了气味的原始感觉与大脑之间有着密切的联系。在应用吸入疗法时， 对抗医学利用直接的鼻脑连接作为一种最快捷的药物传送系统，还可避免外周副 作用。在欧美等西方国家，芳香治疗已成为新颖时尚的补充和替代疗法之一，鉴 于治疗的需要，一些医院已试着将芳香治疗用于治

30、疗痴呆。在芳香治疗应用于临 床治疗之前， 已有大量的研究表明人类吸入精油的芳香后认知功能会得到提升6-7。 已有研究发现，芳香物质经嗅球通路改善大鼠学习记忆的机制与皮质和海马内的 乙酰胆碱和谷氨酸含量改变有关 8-9，但尚不清楚芳香物质是否会通过同样的嗅脑 途径改善脑中的5-HT和GABA的含量。 迷迭香属于芳香开窍类药物，主要成分为二萜酚类、黄酮类、三萜类及精油 等，有激励情绪、提神醒脑、强化记忆等功效。Jimbo D等10对28例痴呆患者，在 上午应用迷迭香和柠檬香混合的芳香治疗，晚上是应用薄荷和橙子芳香混合治疗。 治疗时间为28天，治疗前后各有28天的药物导入期和药物清洗期。芳香治疗期间

31、 无其他认知功能训练，洗脱期患者不接受任何治疗。导入期和清洗期前后分别用 GBSS-J和触摸式痴呆评价量表评定四次，结果：所有的患者GBSS-J和触摸式痴呆 评价量表认知功能评分均有提高，而AD患者后者评分提高更明显。表明了迷迭香 精油混合物对改善认知功能具有一定的作用。另外曹岚、董原等 11研究发现迷迭 香气味能明显提高小鼠的因东莨菪碱影响受损的学习记忆能力。 1.3 嗅觉通路的概况 在所有的人类感觉中，嗅觉也许是当代最神秘和医学评价最不充分的领域。 大脑如何处理种类繁杂的嗅觉信号，进而辨别和记忆各种气味的工作原理仍不十 分清楚。嗅觉的形成和功能研究目前还在探索阶段，直到2004年学者才较为

32、清楚 安徽医科大学硕士学位论文 11 地阐明了嗅觉系统的工作方式12-13：气味分子激活气味受体后，受体细胞产生电 信号并传递到大脑的嗅球中，进而传到其他大脑区域，结合组成特定模式，从而 产生嗅觉感知功能，人类才能意识到如迷迭香的气味。这些发现为大脑高级功能 的研究提供了一种新的研究和探索方式。 目前的研究表明：嗅觉信号的感知和传递至少有四个不同的系统。包括初级 嗅觉系统、附属嗅觉系统、终神经系统和三叉神经系统。初级嗅觉系统的主要结 构由前向后如下：嗅球，嗅粘膜的固有层和嗅上皮（含嗅觉受体神经元） ，纤毛和 嗅皮层。有证据表明神经递质参与了嗅觉的形成和传导，然而确切机制仍不清楚。 嗅觉系统最大

33、的神经递质是氨基酸类， 包括兴奋性神经递质谷氨酸(Glutamate， Glu) 和抑制性神经递质-氨基丁酸（-aminobutyric acid，GABA） 。这两种神经递质在 嗅球、 嗅神经节、 杏仁核和中隔区表达。 胆碱能类递质乙酰胆碱(acetylcholine , Ach) 在脑区分布广泛，对嗅觉系统的功能和可塑性起着关键性作用，研究发现其还对 嗅觉的感知力起着调节作用。另外对嗅觉传导有关的神经递质还包括单胺类递质， 主要有5-羟色胺（5-hydroxytrytamine，5-HT）和多巴胺（dopamine, DA） 。而去甲 肾上腺素、环磷酸腺苷和一些神经肽也参与了嗅觉系统的传导

34、。附属嗅觉系统的 解剖结构主要由犁鼻骨系统组成。犁鼻骨系统主要由鼻中隔底部的犁鼻骨器官构 成，包括受体位点和特异的由犁鼻神经发出的传入神经，这些神经终止于附嗅球 和下丘脑区域，而下丘脑的这些区域参与了特殊行为和特殊化学感受器激素的应 答调节14。这些特殊行为反应在哺乳动物中表现为皮肤、阴道分泌各种分泌物以 及精液的行为。终神经系统是一种独立的化学感受系统，它出现在所有的脊椎动 物中15。终神经的外周嗅觉部分由疏松网状样组织组成，它们发出神经纤维穿过 鼻粘膜和筛孔内层嗅神经遍及鼻上皮组织。大部分的终神经元参与促黄体生成激 素-释放激素免疫反应，终神经由鼻直接投射到前脑的特殊区域，参与能引起与再

35、生相关的特别行为，并协调相关激素的变化。总之嗅觉系统中的初级嗅觉系统和 附属嗅觉系统有着紧密的联系，它们分别感知有气味、挥发性的物质和无气味难 以挥发的物质。从终神经感受的化学刺激物上看终神经与生殖行为有关，而三叉 神经系统对气味的冷、热和刺激性感觉功能起着重要作用16。 安徽医科大学硕士学位论文 12 嗅皮质是嗅觉的高级中枢，分为初级嗅皮质和次级嗅皮质，从嗅球发出的二 级神经元以嗅束的方式投射到初级嗅皮质的梨状区、内侧嗅皮层和杏仁核的皮层 核。初级嗅皮层再投射到下丘脑、海马、丘脑内侧、中隔区、Meynert基底核、中 脑网状系统、无名质、眶额皮质，进行嗅觉冲动的远程处理。而次级嗅皮质指内 嗅

36、区，直接接受来自初级嗅皮质的神经纤维，而不接受来自嗅球或嗅束的纤维， 投射的区域较弥散，主要在海马区，另外嗅球还直接投射到大脑的边缘系统。综 上可见嗅觉的高级中枢包括海马、杏仁核、下丘脑和边缘系统等区域，所以嗅觉 与学习、记忆以及情绪有着密切的联系。 1.4 VD 大鼠造模和学习记忆观察的方法 在动物试验中，常用来建立VD模型的方法有大脑中动脉栓塞法、颈内动脉注 射微小栓子法、4-血管阻断全脑缺血法和双侧颈总动脉结扎 (2-vessel occlusion, 2VO) 法等 。大量的实验表明双侧颈总动脉结扎法操作更加简单易行，且手术导 致脑缺血损伤的程度及死亡的率没有大脑中动脉栓塞法和4-血管

37、阻断全脑缺血法 严重 17-18。双侧颈总动脉结扎法建立的大鼠VD模型和人类VD的机制相近，是目前 最为经典的造模方法，但术后大脑供血急剧减少，Willis动脉环代偿不足导致该 方法仍有较高的死亡率。近期有研究表明改良的2VO法，即采用不同时点分别结 扎双侧颈总动脉法，可延缓大脑供血减少时间，建立的VD模型有明显的学习记忆 障碍，而无明显运动功能障碍，同时能有效减少手术导致的应激性死亡，提高VD 造模的存活率 19。 目前， Morris水迷宫实验已成为研究大鼠学习记忆能力较常用的神经行为学方 法，其是1981年由英国心理学家Richard Morris建立起来的。该实验装置的优点是 能提供大

38、量的实验参数，较系统全面地考察实验动物的空间认知过程，更客观的 反应动物的认知水平，且能较好地减少感觉和运动功能障碍对学习记忆测定的干 扰。 安徽医科大学硕士学位论文 13 1.5 海马与学习记忆 一般认为大脑皮层联络区、海马及其邻近结构、杏仁核和脑干网状结构是记 忆形成的脑区。而海马结构的作用尤为突出。海马结构是边缘系统的重要组成部 分，包括海马、齿状回、下托和固嗅皮质。海马的形状似中药海马，故而得名。 海马位于侧脑室下角的底和内侧壁， 前端较膨大， 称海马角， 其被 2-3 个浅沟分开， 沟间隆起，称为海马趾；海马表面被室管膜上皮覆盖，上皮下有一层髓鞘纤维称 室床，室床纤维集中后形成白色扁

39、带称海马伞，构成穹窿系统的起始，其自海马 趾伸向压部，续于穹窿角。根据细胞构成的不同可将海马分为三层：从海马裂到 脑室依次为分子层，椎体细胞层和多形层。依据细胞形态，不同皮质区发育差异 和各种纤维通路的不同，又可在横断面上将海马分为 CA1、CA2、CA3 和 CA4 四 个区。CA4 区邻接齿状回，内有大的椎体细胞；CA3 区有来自齿状回颗粒细胞的 轴突；CA2 区内有少量轴突；CA1 区内含有小的椎体细胞。一般认为海马结构神 经元中的锥体细胞和齿状回颗粒细胞与学习记忆的关系最为密切。 大量的科学研究以及临床脑损伤和脑电图的资料表明，学习和记忆都是在皮 质和皮质下大量神经元的高度配合下完成的

40、。越是复杂的学习记忆，越需要高水 平的神经结构的相互作用。目前认为，记忆的形成是通过海马的神经环路实现： 海马通过穹窿连至下丘脑的乳头体，再通过乳头丘脑束至丘脑前核；丘脑前核发 出纤维投射至扣带；扣带回最后发出纤维回到海马。海马环路活动能促进学习和 记忆，因为环路活动不仅使神经元的活动时间延长，更可使神经元的活动产生总 和而不断增强，因而使神经元之间的突触联系容易化，有利于促进学习和记忆。 许多临床资料也证明海马在学习记忆中的重要作用。在记忆记忆丧失症的患 者海马中可找到病理性变化。切除海马的患者会出现严重的并发症，并牵涉到心 理改变和新进记忆的缺失，而缺失的程度取决于切除部位的大小。当手术损

41、伤穹 窿时，也会导致患者失去近期记忆。当患者的双侧海马受到损伤，则他们可在一 段时间内集中注意力，记住一个短句或短位的数字，但当患者转移注意力时，即 使是片刻，也会完全忘记记住的短句或短位数字。因此，双侧海马受损的患者不 能学习新知识，也不能记忆新近的事物，但发病前学得的技能和生活中的经历， 安徽医科大学硕士学位论文 14 仍可保持记忆。这表明海马与近期记忆密切相关，这可能和短时记忆向短期记忆 转移过程有关。由此可见，海马并非储存记忆痕迹的主要场所，而是参与了存储 信息的选择和信息存储后的寻找和提取。 中枢神经系统的可塑性包含神经环路、神经网络和突触连接，被认为是学习 记忆的神经基础。其中突触

42、连接的可塑性是指突触对适当刺激的生物信号所产生 的形态学和生物化学的变化，是神经可塑性的核心。目前突触可塑性的主要表现 形式-长时程增强(long-term potentiation，LTP）已被公认是记忆的神经模式。LTP 是指突触前纤维受到一个短暂的高频刺激后，突触传递效率和强度增加几倍且能 持续数小时至几天的现象。LTP 的形成是通过 N-甲基-天冬氨酸（N-methyl-Daspartic acid , NMDA）受体实现的，即突触前膜受到刺激，释放兴奋性递质谷氨酸，谷氨 酸作用于突触后膜的 NMDA 受体；后膜的钙通道开放使大量钙离子进入细胞内， 产生一系列的级联反应而形成20。在学

43、习记忆形成的过程中，中枢神经递质也起 着重要的作用。这些神经递质可分为胆碱能类、单胺类和氨基酸类。胆碱能类递 质主要指 Ach，是广泛分布脑内的信息传导递质。单胺类递质主要有 DA 和 5-HT， 它们参调节记忆功能的形成。氨基酸类主要有兴奋性递质 Glu 和抑制性性递质 GABA。 1.6 神经递质 5-HT 和 GABA 5-羟色胺（5-HT）是脑内一种重要单胺类神经递质，胞体主要位于脑干的中缝 核群，它发出的纤维广泛投射于脑的各部。海马也有5-HT能神经元存在，通过5-HT 的受体中介调控靶细胞的兴奋或者抑制，进而调节学习记忆功能 21-22。去甲肾上 腺素(Norepinephrine

44、, NE)、多巴胺(DA)也属于单胺类神经递质，它们和5-HT之间相 互制约，相互平衡。5-HT参与了情感、睡眠、性行为和疼痛等生理功能的调节。 近期的研究表明5-HT对学习记忆亦起到重要调节作用，可能与通过5-HT的受体与 谷氨酸和胆碱系统相互作用有关。曲嫻等 23对血管性痴呆大鼠模型进行研究发现 VD大鼠记忆力下降的同时伴有DA和5-HT的下降。Sumiyoshi等进行临床研究发现小 剂量的5-HT1A激动剂坦度螺酮可以改善精神病患者的学习记忆能力。 -氨基丁酸（GABA）是氨基酸类神经递质，具有抑制性性作用。GABA 在中 安徽医科大学硕士学位论文 15 枢中的作用需要通过相应的受体介导

45、，在海马结构中，GABA 共有 GABAa、 GABAb、GABAc 三种受体，其中 GABAb 受体又可分为 GABAbl 和 GABAb2 两 种，GABAbl 在纹状体分布广泛，和学习记忆尤为相关。有研究表明 GABA 在脑 缺血损伤时急剧增加，能够抑制谷氨酸的毒性作用。Lo EH24发现使用 GABA 受 体激动剂，能够保护缺血的脑组织，减少神经元损伤。 本实验选择血管性痴呆大鼠为研究对象, 从神经行为学和形态学水平出发， 探 讨迷迭香对VD大鼠学习记忆能力和脑内神经递质5-HT和GABA的作用，以期为迷 迭香吸嗅治疗VD提供新的科学依据。 2 材料与方法 2.1 实验动物 健康雄性S

46、D大鼠, 体重20020g,由安徽医大学实验动物中心提供。经水迷宫 训练3d，组间逃避潜伏期无统计学差异，实验条件下自然饮食。 2.2 主要试剂与器材 2.2.1 试剂 （1）迷迭香（安徽奥德瑞生物科技公司提供，批号：1600881） ， （2）庆大霉素（ 山东圣鲁制药有限公司 ） （3）磷酸青霉素钠（哈药集团制药总厂 ） （4）兔抗5-HT抗体试剂盒（北京博士德生物工程有限公司） （5）SABC试剂盒、浓缩型DAB试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司） 。 2.2.2 器材 （1）Morris水迷宫（中国医学科学院药物研究所生产） （2）生物组织石蜡包埋机(湖北亚光医用电子仪器厂） 安徽医科

47、大学硕士学位论文 16 （3）Leica石蜡切片机（型号RM2l35，德国） （4）分析天平（上海精科，JA2003） （5）倒置相差显微镜（德国OLYMPSBX60） 2.2.3 主要溶液的配制 （1）0.1mol/L PBS配制（pH=7.3） ：PBS10g加入呈有200ml双蒸水烧杯中，用搅拌 器搅拌至完全溶解，倒入玻璃容器中，再加入双蒸水至1000ml，充分混匀，配制 成0.1mol/L PBS液。 （2）4%多聚甲醛PBS液的配制法（pH=7.3）：称取40g多聚甲醛置于玻璃容器（或 烧瓶）中，加入 0.1mol/LPBS溶液800ml，加热至60左右，持续搅拌至粉末完全 溶解，再加入4gNaOH使溶液清亮,最后补足0.1mol/L的PB至1000ml，充分混匀， 室温或4保存备用。 （3）染色液配制：苏木精2g ,1