1、地衣芽孢杆菌的别离和鉴定 摘要：为了從土壤中别离得到地衣芽孢杆菌，开展后续研究，试验采集塔里木盆地的土壤进行细菌培养，采用台盼蓝平板方法，对别离培养得到的单菌落进行生物学特性研究、生理生化试验和16SrDNA鉴定。根据?伯杰细菌鉴定手册?，初步鉴定为芽孢杆菌，提取DNA进行PCR扩增并送测序。结果说明，从塔里木盆地土壤中别离得到的细菌为地衣芽孢杆菌，说明该土壤中存在地衣芽孢杆菌，并为后续进一步研究及应用奠定根底。关键词：土壤;别离和鉴定;16SrDNA;地衣芽孢杆菌中图分类号：S-3文献标识码：A202121150052021-08-17202110757029地衣芽孢杆菌Bacillusli
2、cheniformis为革兰氏阳性菌，广泛分布于微生物混合培养物中【1】。呈杆状，芽孢为椭圆形，孢囊稍膨大，为非致病性菌，细菌最适生长温度约为50，酶的最适生长温度为37。地衣芽胞杆菌耐热、含酶量多、产酶量高的优良特性被广泛应用于工业生产中，主要用来生产淀粉酶【2】及蛋白酶【3】。芽孢杆菌具有耐酸、耐盐、耐高温等特点，这使得其可以在条件不利的情况下形成芽孢，自我保护，并在环境适宜的条件下复活。地衣芽孢杆菌在代谢过程中能产生多种酶和活性物质，具有益生保健【4】，降解农药【5】和净化水体【6】的作用。为了解塔里木盆地土壤中是否存在地衣芽孢杆菌，本试验从塔里木盆地的1份土壤中筛选出1株镜检有芽孢的单
3、菌落，对该菌株进行别离纯化，经过生理生化实验鉴定、16SrDNA基因测序，最终鉴定为地衣芽孢杆菌，且为后续开展地衣芽孢杆菌的应用研究奠定根底。1材料1.1样品采集-塔里木大学校园肥沃菜地距地表2080cm土样。1.2主要试验仪器恒温培养箱型号为GHP-9080，购自上海一恒科学仪器;小型台式高速离心机型号为Eppendorf5453，购自北京创世云博科技开展;洁净工作台型号为SW-CJ-2ED，购自上海五久自动化设备;摇床型号为ZWY-2102C，购自济南宇晗医疗器械。1.3试验药品盐酸、磷酸二氢钾、氢氧化钠、明胶、氯化钠、七水硫酸镁、淀粉、硫酸铵、卢哥氏碘液、硝酸钾、格里斯亚硝酸盐试剂、0.
4、04%酚红、Ehrlish试剂、二甲苯、DL-苯丙氨酸、10%氯化铁、磷酸二氢铵、柠檬酸钠、磷酸二氢钠、0.1%酪氨酸、台盼蓝、琼脂粉、酵母粉、酵母膏、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、浓盐酸、可溶性淀粉，均为国产;牛肉浸粉、牛肉膏、蛋白胨，均购自Sigma公司。2方法2.1细菌的别离处理2.1.1制样品稀释液取样品土壤500g置于80烘箱中烘烤24h，过筛，称取150g土壤放入烧杯中，加水至350mL，煮沸15min，过滤，取滤液，制成110浓度的悬液。另取装有无菌水的试管6支，编号10-1、10-2、10-3、10-4，10-5、10-6进行梯度稀释，移取500L10-1管中土壤悬液于10-2管中混
5、匀，然后移取500L10-2管中土壤悬液于10-3管中混匀，直至稀释到10-6管，另取500L10-6管中液体弃去。2.1.2培养从10-4、10-5、10-6管的稀释液中取150L滴加到台盼蓝选择培养基平板上，用涂布棒均匀涂布，并将培养基倒置培养于37恒温箱中，培养24h。2.1.3别离单菌落挑取有透明圈的单菌落，接种于灭菌的LB液体培养基中，置于37，180rpm摇床中培养6h。2.1.4纯化采用平板涂布法，用微量移液器分别移取20L、50L、100L、150L、200L均匀涂布于LB固体培养基上，37恒温培养24h，并重复此步骤屡次到达纯化。2.2生物学特性研究2.2.1菌落培养特征在台
6、盼蓝选择培养基上进行培养，观察并记录。2.2.2菌体形态观察挑取培养的单菌落，进行革兰染色与孔雀石绿染色，镜检，观察形态。2.2.3革兰染色【7】用接种环挑取LB平板上生长的单菌落，在滴有蒸馏水的载玻片上均匀涂开，将涂好的玻片用酒精灯火焰固定，在涂片处用结晶紫染色液处理1min，用水冲洗干净;碘液处理1min，用水冲洗干净;95%的乙醇脱色处理30s，用水冲洗干净;沙黄复染15s，用水冲净，烘干，油镜下观察。2.2.4孔雀石绿染色8切片用饱和的孔雀石绿水溶液染10min，蒸馏水冲洗;0.5%番红复染30s;水洗，吸干;镜检，芽孢呈绿色，菌体和芽孢囊呈微红色。2.2.5血平板试验采用-多浪绵羊血
7、制作血平板，将菌株接种于血平板上，观察溶血现象。2.3細菌的生化鉴定地衣芽孢杆菌鉴定参考?常见细菌系统鉴定手册?9及?伯杰细菌鉴定手册?10的方法，对别离的细菌进行鉴定。2.3.1柠檬酸盐利用试验无菌条件下，将单菌落接种于柠檬酸盐培养基中，37恒温培养37d，观察颜色变化。2.3.2丙酸盐利用试验将菌种划线接种于丙酸盐培养基上，37恒温培养，连续3代移种，观察颜色变化。2.3.3淀粉水解试验用接种环取菌种涂布在培养基外表，37恒温培养2448h，取出后滴加碘液，观察菌落周围变化。2.3.4卵黄卵磷脂酶试验接种环取少量幼龄菌种培养1824h涂布于卵黄卵磷脂酶平板上，37恒温培养2448h，观察菌
8、落四周是否出现不透明区。2.3.5硝酸盐复原试验取纯培养物接种于硝酸盐培养基中，37培养1824h，参加试剂35滴，30s内出现红色为阳性。2.3.6吲哚试验将菌种接种于蛋白胨水培养基中，37恒温培养24h后，取出参加2mL二甲苯，摇匀静置，沿试管壁缓慢参加Ehrlish试剂2mL，静置，观察颜色变化。2.4地衣芽孢杆菌16SrDNA的鉴定2.4.1基因组DNA的提取细菌DNA提取方法按照北京全式金生物技术DNA提取试剂盒M10208说明书进行操作。2.4.216SrDNA基因扩增选择通用引物扩增芽孢杆菌16SrDNA的全长序列。细菌通用引物序列为27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCT
9、CAG-3和1492R：5-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3，进行PCR扩增。PCR扩增体系：DNA模板1L;上游引物和下游引物各1L;EasyTaqSuperMix25L，参加ddH2O补至50L。PCR扩增程序：94预变性5min;94变性30s，55退火30s;72延伸90s;35个循环;72再延伸10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳。2.4.3纯化和测序PCR产物经纯化后与pMD19-T载体连接，送由北京天一辉远测序，将测定的序列通过NCBI/BLAST工具进行序列比对，确定其具体的菌属。3结果与分析3.1细菌的培养对菌液用无菌水分别进行6个梯度稀释，置于台盼蓝筛选平
10、板上。结果说明，随着稀释倍数的增大平板上生长的菌落数减少，逐渐出现单菌落。3.2细菌形态挑取白色透明圈的单菌落，进行革兰染色，镜检结果见图1，待检菌革兰染色呈阳性，菌体呈直杆状，两端钝圆。孔雀石绿染色镜检结果见图2。3.3菌落形态及血平板毒力测试将该菌接种于LB固体培养基上，观察菌落呈圆形、扁平、外表粗糙，边缘不整齐，灰白不透明，培养24h后菌落趋于相互融合，菌苔外表出现山丘状和裂叶状见图3;将该菌划线接种于血平板上，培养24h后，未出现溶血环，观察落菌形态边缘光滑，不规那么，外表湿润，无透明或不透明的灰白色小菌落见图4。3.4生理生化实验鉴定结果3.4.1丙酸盐利用、柠檬酸盐利用实验结果在丙
11、酸盐利用试验中，将菌种划线接种于丙酸盐培养基上，培养基变蓝，实验结果为阳性;在柠檬酸盐的利用试验中，适温培养4d后，培养基对光旋转呈蓝色，实验结果为阳性。3.4.2淀粉、卵黄卵磷脂、硝酸盐复原试验结果将该菌接种于淀粉培养基培养24h后，滴加碘液，菌落周围出现不变色透明圈，淀粉水解呈阳性;将该菌接种到卵黄卵磷脂培养基培养24h后，观察菌落四周有浑浊环出现，表示卵磷脂分解成脂肪，说明别离纯化的菌株中含有卵磷脂酶;将该菌接种到硝酸盐复原为亚硝酸盐培养基24h后，滴加试剂，30s内出现红色，说明该菌能将硝酸盐复原;将该菌接种到吲哚培养基中恒温培养24h后，取出参加二甲苯和Ehrlish试剂，培养基不变
12、色，实验结果为阴性。3.4.3生化试验鉴定结果淀粉水解试验、丙酸盐利用试验、卵黄卵磷脂酶试验、硝酸盐复原试验、吲哚试验、柠檬酸盐利用试验等生物化学试验鉴定结果见表1。3.516SrDNA的鉴定结果由图5可以看出，成功扩增了该菌的16SrDNA的基因序列。3.5.216SrDNA克隆鉴定结果该细菌16SrDNA的基因序列与pMD19-T连接后转化DH5，提取质粒送测序，阳性克隆鉴定如图6。3.5.316SrDNA的序列进化树同源性分析结果将测序所得序列去掉相关的载体序列后，得到该菌的全长16SrDNA序列信息。该菌株的16SrDNA长度为1500bp，将其结果提交到NCBI数据库进行核酸比对后，
13、建立进化树。分析说明，该菌株与登录号为KU986668、CP025226、MK063874、MN493780、MG97702的地衣芽孢杆菌处于同一分支，且根据同源性分析，该菌株与登录号为KU986668、CP025226、MK063874、MN493780、MG97702的地衣芽孢杆菌同源性为100%，进化树分析结果见图7，同源性比较见表2。根据上述结果，可以确定该菌株为地衣芽孢杆菌。4结论与讨论面对土壤中庞大的微生物群体，通过对一份土壤进行高温烘烤处理，培养获得单菌落，取该菌落在台盼蓝平板上培养，反复纯化，最终挑选长出白色透明圈的菌落作为实验出发用菌，进行革兰染色和孔雀石绿染色镜检后，观察细
14、菌形态呈杆状，两端钝圆，芽孢中生，孢囊稍膨大，确定别离得到1株芽孢杆菌。通过参考?常见细菌系统鉴定手册?及?伯杰细菌鉴定手册?，又结合地衣芽孢杆菌所特有的能够利用丙酸盐的特性，初步鉴定为地衣芽孢杆菌。同时，对该菌进行柠檬酸盐利用试验、淀粉水解试验、明胶液化试验、硝酸盐复原试验等一系列的生化鉴定试验。试验结果说明，该菌具备地衣芽孢杆菌的不可形成吲哚、不可水解酪氨酸、不具有苯丙氨酸脱氢酶的生化特征，由此可以初步断定该菌为地衣芽孢杆菌。最终通过对该菌进行DNA提取、PCR扩增、纯化及测序，将其16SrDNA基因序列信息进行建立进化树及同源性分析，进一步确定该菌为地衣芽孢杆菌。地衣芽孢杆菌在较高温度下
15、仍能生长繁殖，并且能够产生淀粉酶和蛋白酶，对有些有害菌如葡萄球菌、白色念珠菌具有明显的抑制作用。然而，近年来对地衣芽孢杆菌的研究进展仍报道得比较少，虽已证实其拥有良好的使用效果，但具体作用机理机制尚不明确，且其研究主要集中在抗菌特性方面，未来可利用基因工程将该菌的优良特性与其它菌结合，构建和表达出一种更优良的基因，并将其应用到更加廣泛的领域中。试验结果进一步丰富了我国地衣芽孢杆菌的研究进展，为地衣芽孢杆菌的进一步研究及应用奠定根底。参考文献【1】覃建忠，邓正春，周诗彪，等.大豆施用含地衣芽孢杆菌生物活化酶磷肥试验J.作物研究，2021，3107：722-723.【2】莫静燕，陈献忠，王正祥.地
16、衣芽孢杆菌原生质体的制备、再生及转化研究J.生物技术，202105：75-77.【3】王利杰，余晓斌，方银兵，等.可抑制致病菌的益生菌筛选及抑菌物质的初步确定J.生物技术通报，2021，3311：123-129.【4】KimY，ChoJY，KuKJH，etal.IdentificationandantimicrobialactivityofphenylaceticacidproducedbyBacillusLicheniformisisolatedfromfermentedSoybean，Chnngkook-JangJ.CurrentMicrobiology，2021，484：312-317.
17、5】MandalMD，MandalS，PalNK.Plasmid-mediateddimethoatedegradationbyBacillusLicheniformisisolatedfromafreshwaterfishLabeorohitaJ.BioMedResearchInternational，2021，253：280-286.【6】李木明.降解有机质芽孢杆菌的筛选及其净化模拟污染水体的特性D.泉州：华侨大学，2021.【7】黄荔丰.微课“革兰染色的教学设计J.课程教育研究，202141：19.8樊佳，韩煦，陶榆玮，等.芽孢染色实验中枯草杆菌最正确培养条件探索J.实验技术与管理，2021，3503：58-61.9东秀珠，蔡妙英.常见细菌鉴定手册M.北京：北京科学教育出版社，2021.10伯杰细菌鉴定手册M.第九版.科学出版社，1994.周康
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