结核分枝杆菌药敏试验结果的判读.pdf

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1、1 结核分枝杆菌药敏试验结果的判读结核分枝杆菌药敏试验结果的判读 国家结核病临床实验室国家结核病临床实验室 结核病耐药问题提高了临床对结核病耐药问题提高了临床对DSTDST的需求的需求 MDR XDR TDR DR Increasing Trend Any one or more Other than MDR/XDR INH and RIF MDR Plus Quinolone and Aminoglyocside Almost all the drugs 2 3 药物敏感性试验的方法药物敏感性试验的方法 一、表型药敏试验一、表型药敏试验 固体培养基药敏试验：绝对浓度法固体培养基药敏试验：绝对

2、浓度法; ; 比例法比例法 液体培养基药敏试验：液体培养基药敏试验：MGITMGIT960; BacT/ALERT 960; BacT/ALERT 3D3D； MICMIC测定：药敏板法测定：药敏板法 二、分子药敏试验二、分子药敏试验 基因测序基因测序 间接基因测序法间接基因测序法: : 线性探针杂交技术；基因线性探针杂交技术；基因芯片；芯片；GeneXpert；HRM 4 1. 同一份患者不同时间留取的标本结果不一致同一份患者不同时间留取的标本结果不一致 2. 同一份患者不同的方法间结果不一致同一份患者不同的方法间结果不一致 药敏试验结果的不一致问题药敏试验结果的不一致问题 5 比例法和绝对

3、浓度法的选择比例法和绝对浓度法的选择 6 绝对浓度法与比例法的差别绝对浓度法与比例法的差别 差异差异比例法比例法绝对浓度法绝对浓度法 接种菌量接种菌量1010-4 -4 mg mg和和1010-6 -6 mg mg1010-3 -3 mg mg 培养基药物浓度培养基药物浓度 IHN：0.2g /ml SM：4.0g /ml RFP：40g /ml EMB：2.0g /ml KM: 30g /ml OFLX: 3g /ml IHN：1，10g /ml SM：10，100g /ml RFP：50，250g /ml EMB：5，50g /ml KM: 30g /ml OFLX: 3g /ml 报告结

4、果时间报告结果时间4-64-6周周4 4周周 7 绝对浓度法和比例法药敏试验出现结果差异绝对浓度法和比例法药敏试验出现结果差异 刘宇红.中华结核和呼吸杂志.2000 用两种药敏试验方法测定了用两种药敏试验方法测定了360360株结核分枝杆菌对株结核分枝杆菌对H H、R R、S S、E E的药敏性的药敏性, , 两种方法的符合率：两种方法的符合率： H 81.1% H 81.1% R 92.5% R 92.5% S 83.6% S 83.6% E 98.6% E 98.6% 比例法诊断耐药的比例高于绝对浓度法比例法诊断耐药的比例高于绝对浓度法 对两种方法不符合的菌株的对两种方法不符合的菌株的MI

5、CMIC测定显示：这些菌株对相应药物的测定显示：这些菌株对相应药物的MICMIC值都值都 接近临界值。接近临界值。 8 (1)能够最大限度的区分临床上可能的敏感株和可能 的耐药株； (2)这个浓度应该是血和组织浓度可以达到的； (3)当以这个浓度诊断细菌学耐药时，可能会出现临 床反应性降低。 耐药诊断临界值的确定耐药诊断临界值的确定: : 9 可能敏感株和可能耐药株的可能敏感株和可能耐药株的MIC分布情况分布情况 （1） Minimal inhibitory concentrations (MIC) Frequency of strains Clinically susceptible str

6、ains (PS) Clinically resistant strains (PR) Break Point MIC 10 可能敏感株和可能耐药株的可能敏感株和可能耐药株的MIC分布情况分布情况 （2） Minimal inhibitory concentrations (MIC) Frequency of strains Clinically susceptible strains (PS) Clinically resistant strains (PR)Break point MIC 11 可能敏感株和可能耐药株的可能敏感株和可能耐药株的MIC分布情况分布情况 （3） Minimal

7、inhibitory concentrations (MIC) Frequency of strains PSPR ?Break Point MIC 12 不同药物的表型药敏试验结果的可靠性不同药物的表型药敏试验结果的可靠性 差异较大差异较大 一般认为，以固体培养基为基础的一般认为，以固体培养基为基础的DSTDST，诊断利福平和，诊断利福平和 异烟肼耐药的准确性最高，链霉素和乙胺丁醇次之，而一异烟肼耐药的准确性最高，链霉素和乙胺丁醇次之，而一 些临界浓度与药物最低抑菌浓度些临界浓度与药物最低抑菌浓度(MIC)(MIC)接近，或是临床疗效接近，或是临床疗效 不显著的药物（如二线抗结核药物）的药敏

8、试验结果需要不显著的药物（如二线抗结核药物）的药敏试验结果需要 慎重解读。慎重解读。 13 表型药敏试验表型药敏试验 V.S.V.S. 14 固体罗氏培养基法与液体培养基法固体罗氏培养基法与液体培养基法DST的比较的比较 不同方法不同方法药物种类药物种类 价格价格 （）（） 从培养到获得从培养到获得DSTDST 结果结果 罗氏培养基罗氏培养基多种（除多种（除PZAPZA外）外） 1515元元/ /药药2-32-3个月个月 液体培养基液体培养基多种（包括多种（包括PZAPZA） 100100元元/ /药药2-42-4周周 微孔板法药敏试验微孔板法药敏试验 1.1. 包含的药物种类较多包含的药物种

9、类较多，包括，包括是包括了一些新型的抗结核药是包括了一些新型的抗结核药 物，如物，如莫西沙莫西沙星，克拉霉素，阿莫西林星，克拉霉素，阿莫西林/ /克拉维酸钾、氯克拉维酸钾、氯 法齐明。法齐明。 2.2. 获得耐药浓度，发现中度敏感获得耐药浓度，发现中度敏感/ /低度耐药菌株。低度耐药菌株。 3.3. 缩短缩短报告结果报告结果时间。一般时间。一般2 2周周，特殊情况下特殊情况下3 3周报告结果。周报告结果。 4.4. 提高了标准化程度。药敏培养板的制备实现了标准化，结提高了标准化程度。药敏培养板的制备实现了标准化，结 果的读取依赖专业设备，有利于质量控制。果的读取依赖专业设备，有利于质量控制。

10、板式药敏试验的技术特点：板式药敏试验的技术特点： 17 以固体药敏试验为对照评估板式药敏试验结果以固体药敏试验为对照评估板式药敏试验结果 70人份对照药物符合率统计人份对照药物符合率统计 总数总数/ 份份 符合数符合数/ 份份 符合率符合率备注（微孔板对罗氏）备注（微孔板对罗氏） TCH7070100%- PNB7070100%- SM706897.10%2人份敏感对耐药（ 人份敏感对耐药（长到第二孔长到第二孔）：）：18012、17076 INH706998.60%17993（ （0.8浓度敏感对浓度敏感对1浓度敏感浓度敏感） EMB706897.10%2人份敏感对耐药 人份敏感对耐药179

11、99、18044 RFP706998.60%1人份敏感对耐药 人份敏感对耐药18026(NTM) RFT7070100%- LFX70 5781.40% 10份是中敏对耐药 份是中敏对耐药17076、17081、17082、17085、18013、18014、18026、18043、18049、 18051， ，3份是敏感对耐药份是敏感对耐药18002、18015、18050 AM706796%3人份中敏对敏感 人份中敏对敏感18012、18026、18039 CM706288.60% 3人份中敏对敏感 人份中敏对敏感18038、18026、18002 ，5人份中敏对耐药人份中敏对耐药1803

12、9、18033、18015、18014、 18013 PAS706897.10%1人份中敏对敏感、 人份中敏对敏感、1人份无法判读（跳孔）对敏感人份无法判读（跳孔）对敏感 RFB705984.30%2人份中敏对敏感， 人份中敏对敏感，9人份中敏对耐药人份中敏对耐药 PTO/ET O 706694.30%4人份中敏对耐药 人份中敏对耐药 18 V.S. V.s. 分子药敏试验分子药敏试验 基因芯片 HAIN Test GeneXpert 19 结核分枝杆菌耐药机制结核分枝杆菌耐药机制 p基因型耐药：相关的耐药基因发生突变，是生长活跃的细菌 的主要耐药机制，导致疗效降低。 p表型耐药或药物耐受：由

13、于一些表观遗传学改变，如蛋白表 达水平变化，蛋白修饰等导致的持留菌对药物的敏感性降低， 导致治疗的周期延长、复发。 分子药敏技术的特点分子药敏技术的特点 检测耐药相关基因的突变情况。 PCR扩增目的基因是前提。 一般可以在标本获取后几个小时内完成检测。 方法的灵敏度和特异度主要取决于被检测的耐药基因与耐药 的相关性，但生产工艺也对结果的准确性至关重要。 来自不同厂家的产品检测的原理一致，所不同的是结果的展 示方式。 线性探针杂交技术线性探针杂交技术 Line Probe Assay（LPA） Visual result reading for GenoType MTBDRplus 基因分型结果

14、判读基因分型结果判读 SubgroupSensitivitySpecificity Rifampicin88.698.8 Isoniazid79.398.8 MDR- 李强.中国防痨杂志.2009 First reported data from China on HAIN LPA* *179 clinical isolates 城市城市sensitivityspecificityPPVNPV （95%CI）（95%CI）（95%CI）（95%CI） 城市一城市一60% (22.3697.64%) 95.53% (89.6100%) 65.22% (27.07100%) 94.48% (87.

15、96100%) 城市二城市二67.27% (42.9691.58%) 96.28% (91.85100%) 78.72% (55.79100%) 93.5% (87.8199.19%) 城市三城市三66.67% (23.99100%) 98.63% (96.5100%) 66.67% (23.99100%) 98.63% (96.5100%) 城市四城市四71.43% (33.56100%) 98.83% (96.6100%) 78.95% (43.02100%) 98.26% (95.56100%) 合计合计66.39% (49.7583.03%) 97.72% (96.0899.36%)

16、73.83% (57.5190.15%) 96.78% (94.8598.71%) 与传统药敏试验相比与传统药敏试验相比Hain LPA Hain LPA 诊断诊断MDRMDR的可靠性的可靠性 评估（盖茨项目）评估（盖茨项目） 基因芯片技术基因芯片技术 Microarray/Bio-Chips 芯片结果图例 分组分组敏感性敏感性特异性特异性 Rifampicin92.097.2 Isoniazid77.496.9 MDR74.698.0 3 3个中心实验室评价芯片结果个中心实验室评价芯片结果 周杨.中华检验医学杂志.2011 *1186 isolates consist of 800 RFP

17、resistant strains,797 INH resistant strains,791MDR strains,and 380 RFP-INH sensitive strains. 芯片芯片敏感性敏感性特异性特异性PPVNPV MDR (初治初治) 63.64%98.16% 50.0% 98.94% MDR (复治复治) 82.61%86.21%70.37%92.59% RFP 耐药耐药 (初治初治) 90.48%98.38%76.0%99.46 RFP 耐药耐药 (复治）复治） 91.18%91.49%88.57%93.48% INH 耐药耐药 (初治初治) 68.97%93.66%4

18、6.51%97.42% INH 耐药耐药 (复治复治) 92.59%87.04%78.13%95.92% 李卫彬.中华临床医师杂志.2012 一个地市级实验室的芯片评价结果一个地市级实验室的芯片评价结果 全自动的利福平耐药检测实时全自动的利福平耐药检测实时PCRPCR体系体系 （Xpert MTB/RIF） Migration Health Department31 32 Xpert MTB/RIF 的的诊诊断效率断效率 敏感性敏感性 涂涂+/培培+ 敏感性敏感性 涂涂-/培培+ 特异性特异性 (非非结结核病核病) 诊诊断断 MDR的敏感性的敏感性 诊诊断利福平敏感的特异性断利福平敏感的特异性

19、 97.8% 73.1% 99.0% 96.5% 99.5% 对培养阳性的标本诊断的总的敏感性为 92.1% 利福平耐药是 MDR的一个很好的标志 国家结核确 诊病例 非结核 病例 样本（例数）对照方法敏感性 (95%CI) 特异性(95%CI) 法国32NA淋巴结(16)；胸水(7)；骨(5)培养（液体、固体 ） 53.1%(34.7- 70.9) NA 西班牙41299活检组织(18)；CSF(6)；胃 液(4)；脓性分泌物(5)； 培养（液体、固体 ） 95.1%(83.5- 99.4) 100%(98.8- 100) 南非205胸水（25）培养（液体）25%(8.7- 49.1) 10

20、0%(47.8- 100) 德国45476组织(30)；胃液(8)；尿(5)培养（液体、固体 ） 77.3%(60.5- 87.1) 98.2%(96- 98.9) 南非3018淋巴结针吸活检组织涂片、病理阳性和/ 或培养（液体、固 体） 96.6%(86.6- 100) 88.9%(69.6- 100) 西班牙10841胸水(26)；淋巴结(34)；脓 肿吸出物(17)；组织(12) 培养（液体、固体 ） 58.3%(48.5- 67.8) 100%(91.4- 100) 印度283250组织活检标本(25)；脓(98) ；体液(24) 联合涂片、培养和 临床 80.6%(75.5- 85.

21、0) 99.6%(97.8- 100) 土耳其48128胸水，淋巴结，CSF，尿， 皮肤活检标本，心包积液 培养（液体、固体 ）或临床诊断 54.2%(40.3- 67.4) 100%(97.2- 100) 意大利2681206活检物(94)，胸水(18)，胃 液61)，脓(55)，CSF(14)， 尿(16)，腹水，关节液，心 包积液(10) 培养（液体、固体 ）或临床诊断 81.3%(76.2- 85.8) 99.8%(99.4- 100) Xpert MTB/RIF 对肺外结核的诊断效率对肺外结核的诊断效率 Lancet,2013,vol 13:349 结核定义及报告的新框架 Xpert

22、 MTB/RIFXpert MTB/RIF是结核细菌学确认是结核细菌学确认 方法之一；方法之一； 利福平耐药结核利福平耐药结核(RR-TB)(RR-TB)成为耐药成为耐药 结核的新名词；结核的新名词； 表型药敏试验会漏检一些真正的耐表型药敏试验会漏检一些真正的耐 药株。对于药株。对于XpertXpert诊断的利福平耐诊断的利福平耐 药，无需用其他方法确认，分子诊药，无需用其他方法确认，分子诊 断结果与疗效更一致断结果与疗效更一致 高分辨率熔解曲线技术高分辨率熔解曲线技术 (High Resolution Melting(High Resolution Melting，HRM)HRM) Wild

23、- type Mutant- type Mutant/Wil d-type 高分辨率熔解曲线技术（高分辨率熔解曲线技术（High Resolution MeltingHigh Resolution Melting，HRMHRM） 在一定环境下，DNA双链在其长度和序列一定时，Tm值也一定，是其固有性质， 当发生错配时，Tm值下降，下降的幅度与发生错配的碱基数目、类型和位置有关。 匹配度最好时，Tm值最高 发生错配后，Tm值下降 既有野生又有突变时，出现两个熔解峰 探针游离时为淬灭状态 BioRad CFX96 Qiagen RG6000 Roche Lightcycler 480 适配机型 S

24、LAN 96P 技术比较技术比较 39 不同分子药敏检测的结果不一致不同分子药敏检测的结果不一致 在排除了系统误差后，任一分子技术诊断耐药，应该 首先考虑耐药。 p不同方法覆盖的基因数量不同、探针位置不同 p不同方法检测异质性菌群中耐药菌的敏感程度不同 p不同次反应条件不一致的问题 40 No. of cases identified on 1stXpert assay (%) No. of cases identified on 2ndXpert assay (%) No. of RIF-resistant cases35(100%)0(0) No. of RIF-susceptible c

25、ases99(100%)0(0) 对对134134个重复个重复Xpert MTB/RIFXpert MTB/RIF测试的结果分析测试的结果分析 41 表型药敏试验和分子药敏试验结果不一致表型药敏试验和分子药敏试验结果不一致 V.S. 42 工作原理工作原理 传统药敏传统药敏 细菌表型特征的变化细菌表型特征的变化 分子生物学技术分子生物学技术基因突变基因突变 鉴于分子药敏的工作原理，任何一种方法都无法检测出 100%的耐药株。 菌群中存在敏感菌与耐药菌的混合时，尤其在耐药菌比例 较低时，比如低于10%，分子药敏技术常无法检测出耐药， 而比例法药敏试验能够检出1%菌群比例的耐药。 传统药敏试验自身

26、存在很多问题，其结果也存在可靠性问 题。 分子药敏结果与传统药敏试验的结果不一致的原因分析分子药敏结果与传统药敏试验的结果不一致的原因分析 异质性问题异质性问题 一个菌群中既存在敏感株，也存在耐药株。引起异质性 的原因有2种可能：1、再感染；2、发生耐药的早期阶段。 异质性带来的问题： 1、不同时间表型DST结果不一致。 2、表型药敏试验与分子药敏试验结果不一致。 如何理解不同方法间DST结果存在差异 Pang Y.IJTL,2014 吡嗪酰胺耐药与pncA,rpsA基因突变 Gu Y, et al, Diagn Microbiol Infect Dis (2016) MDRMDR菌株对菌株对

27、PZAPZA的敏感性的敏感性 PZAPZA敏感和耐药菌株的基因突变情况敏感和耐药菌株的基因突变情况 以表型药敏试验结果作对照，单独检测以表型药敏试验结果作对照，单独检测pncA pncA 基因诊断耐药的敏感性、基因诊断耐药的敏感性、 特异性、特异性、PPVPPV和和NPVNPV分别为分别为 85.4% 85.4%、91.7%91.7%、93.3%,82.1%93.3%,82.1%；而联合检测；而联合检测 pncA+rpsApncA+rpsA基因后分别为基因后分别为92.7%92.7%、83.3%83.3%、 88.4% 88.4% 、89.3%89.3%。 诊断的角度评价pncA和rpsA基因

28、突变的检测 (1)PZA发挥作用所需的酸性条件能够抑制结核分枝杆菌的生长。当 PH=5.5时，约20%25%结核分枝杆菌临床分离株不能生长；在PH=6.0时， 约3.5%的临床分离株不能生长； (2) 菌体接种量过大导致PH值的升高，使PZase失活，从而导致假耐药 的结果。接种菌体量大于107CFU/ml时，培养8天后培养基的PH值接近中 性；当菌体量小于107CFU/ml，培养8天后，几乎没有改变； (3)对数生长期的菌比静止期的菌更容易出现PZA耐药结果。PZA对相同 cfu值的MTB的杀菌浓度处于对数生长期的菌高于静止期的菌，原因可能 是年老的细胞新陈代谢更弱，而PZA对静止期MTB细

29、胞的作用较强。 影响影响PZAPZA表型药物敏感性实验表型药物敏感性实验可靠性的可靠性的因素因素 126126株结核分枝杆菌临床分离株对株结核分枝杆菌临床分离株对LFX, MFX LFX, MFX 和和OFLXOFLX的的 MICMIC值分布值分布 喹诺酮类药物的交叉耐药情况及耐药基因突变情况喹诺酮类药物的交叉耐药情况及耐药基因突变情况 R:resistant; S:susceptible; M0.75: MOX DST with the CC at 0.75g/ml. M2.0: MOX DST with the CC at 2g/ml. 54 54株株OFLXOFLX耐药株对其它喹诺酮类药

30、物的耐药情况耐药株对其它喹诺酮类药物的耐药情况 （绝对浓度法）（绝对浓度法） gyrAgyrA和和gyrBgyrB的基因突变情况的基因突变情况 52 不同表型药敏试验方法的结果存在差异，菌株理论上讲必定不同表型药敏试验方法的结果存在差异，菌株理论上讲必定 是耐药程度比较低的菌株。低度耐药与临床疗效间的联系，需是耐药程度比较低的菌株。低度耐药与临床疗效间的联系，需 要开展系统性研究进行评估。要开展系统性研究进行评估。 表型药敏试验与分子药敏诊断的结果存在差异，理论上讲分表型药敏试验与分子药敏诊断的结果存在差异，理论上讲分 子方法诊断的耐药可靠性要高于表型药敏试验，但分子药敏诊子方法诊断的耐药可靠性要高于表型药敏试验，但分子药敏诊 断敏感而表型药敏诊断耐药时，要考虑被检测基因在耐药菌株断敏感而表型药敏诊断耐药时，要考虑被检测基因在耐药菌株 中突变率的问题。中突变率的问题。 分子诊断的敏感性可能比我们所了解的比例要高。分子诊断的敏感性可能比我们所了解的比例要高。 小结：小结： 53