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1、肺炎链球菌的分离和鉴定,概 述,肺炎链球菌（S.pneumoniae），俗称肺炎球菌（pneumococcus）。经常寄居于正常人的鼻咽腔中，一般不致病，只形成带菌状态。当机体免疫力下降时才致病。尤其在呼吸道病毒感染后或婴幼儿、老年体弱者易发生肺炎链球菌性肺部感染。,肺炎链球菌不产生外毒素，主要靠荚膜侵袭力致病。肺炎链球菌主要引起人类大叶性肺炎，肺炎后可继发胸膜炎、脓胸，也可引起中耳炎、乳突炎、副鼻窦炎、支气管炎、心内膜炎、腹膜炎、关节炎、脑膜炎和败血症等。,细菌学检验不仅对疾病的病原学诊断有重要价值，同时对临床治疗的药物选择也具有十分重要意义。,一、生物学性状,1. 形态与染色,肺炎链球菌革
2、兰染色呈阳性。球形或矛头状，成双排列，少呈链状。在组织中可形成荚膜（人工培养荚膜逐渐消失），无鞭毛及芽孢。,2. 培养特点,（1） 培养基 肺炎链球菌对营养要求较高，需采用质量好的哥伦比亚血液平板（ 5马血或羊血） 。,（2）分离培养,1）标本处理 及时将采集标本接种到适当的培养基上是提高分离率的前提。因为，肺炎链球菌对干燥、对寒冷的抵抗力均较弱，在标本离开机体暴露于外界复杂的环境中，其存活率十分低，不及时接种适当培养基是导致分离率低的主要原因。,2）选择性分离培养基,培养基中添加5g/ml庆大霉素有利于肺炎链球菌的分离。,3） 培养环境,510CO2、35培养2448h。,（3）肺炎链球菌的
3、菌落形态,在营养丰富的培养基上，肺炎链球菌形成扁平、中间有凹陷的典型菌落，少数菌可呈粘液型菌落。,肺炎链球菌,肺炎链球菌,肺炎链球菌,3.抗原结构,（1）种属特异性抗原：为菌体多糖抗原，存在于肺炎链球菌的细胞壁。 （2）型特异性抗原：是存在于肺炎链球菌荚膜中的一种多糖多聚体，可溶于水，据此抗原可将肺炎链球菌分为、等个型，其中、型致病性最强。 （3）菌体核蛋白抗原：存在于菌体深部，为蛋白质，无特异性。,二、肺炎链球菌鉴定,肺炎链球菌的鉴定，主要应与甲型溶血性链球菌鉴别。其中以胆汁溶菌试验、菊糖发酵和optochin试验最为常用。必要时可作荚膜肿胀试验或小鼠毒力试验加以鉴别。在上述试验中，肺炎链球
4、菌均应阳性，而甲型溶血性链球菌为阴性。也可用特异性单克隆乳胶或自动化仪器等相应鉴定卡作鉴定。,肺 炎 链 球 菌 鉴 定 要 点,革 兰 阳 性 双 球 菌， 矛 头 状， 不 呈 链； 血 平 皿 菌 落 呈 草 绿 溶 血， 湿 润， 菌 落 表 面 无 小 白 点； 培 养 时 间 长 出 现 脐 窝 状； 胆汁溶解试验阳性； 荚膜肿胀试验阳性； 乳 胶 单 克 隆 抗 体 凝 集 阳 性。,1. 溶血性检查,肺炎链球菌在厌氧或二氧化碳环境中溶血能力大大加强，草绿色溶血环很大，可与其他草绿色链球菌相区别。,2. Optochin(OP，奥普托欣)敏感试验,该药对肺炎链球菌的作用机制是干扰
5、其叶酸的合成。 optochin敏感试验方法是药敏试验。挑取被检菌，密涂于血平板上，贴上含5g/片的optochin纸片，置510%CO2的大气中（或烛缸），35孵育过夜。抑菌环直径=14mm为敏感，推断为肺炎链球菌。抑菌环直径14mm时参照胆汁溶菌试验。肺炎链球菌的抑制圈直径常在20mm以上，甲型溶血性链球菌（约98%）小于12mm。,也有例外，我们在实际工作中检出过耐optochin的肺炎链球菌，并发现大多数的缓症链球菌和部分口腔链球菌对optochin的抑菌环直径=14mm。应注意鉴别。 但大多数肺炎链球菌对苯唑西林（Oxacillin,OX）是敏感的(除外PRP)，而缓症链球菌和口腔链
6、球菌对OX耐药。这可作为辅助鉴别点。,肺炎链球菌,肺炎链球菌,3. 胆汁溶菌试验,自溶酶是一种L-丙氨酸-N-乙酰胞壁酰胺酶，能切断肽聚糖上L-丙氨酸与N-乙酰胞壁酸间的连接键，从而破坏细胞壁，使菌溶解。 自溶酶在菌生长的稳定期被激活，也可被胆汁或胆盐等活性物质激活，从而促进培养物中的菌体溶解。肺炎链球菌胆汁溶菌试验为阳性，甲型溶血性链球菌的胆汁溶菌试验为阴性。,（1）试管法: 取新鲜培养物分装于两支试管内（每支1ml），其中一支加入10%的去氧胆酸钠溶液0.1ml或纯牛胆汁0.2ml，另一支加入无菌盐水两滴（对照），15min后，阳性者细菌被溶解，试管内液体呈透明状，阴性者无变化。,（2）平
7、皿法: 加一滴10%的去氧胆酸钠溶液或纯牛胆汁于被检菌菌苔上，15min后，阳性者细菌菌苔被溶解，阴性者无变化。试验应有已知肺炎链球菌作阳性对照。,胆溶阴性,4.乳胶凝集试验,结果准确、快速、特异性高。,5. 荚膜肿胀试验,取一滴抗血清与一滴菌悬液混匀，加少量美蓝液混合后加盖片，室温1020min后，用油镜检查，如查到菌体呈兰色，周围绕有界限明显未染色的膨大空白圈为阳性。可用于肺炎链球菌的分型。,6. 凝集试验,包括血清凝集试验、SPA（葡萄球菌蛋白A）协同凝集试验、反向乳胶凝集试验等方法。,表1 非溶血链球菌的鉴别, 菌 种 Optochin 胆汁 胆 汁 6.5%NaCl 吡咯烷 卫星现象
8、 CAMP 血清群 敏 感 溶菌 七叶苷 肉汤 酮 酶 肺炎链球菌 + + 牛链球菌 + D 无乳链球菌 d + B 草绿色链球菌 营养变异链球菌 + + *d.不同菌株,三、肺炎链球菌的药敏试验,K-B法：采用Mueller-Hinton琼脂5羊血培养基。直接菌落悬液法(0.5麦氏单位菌液，在15分钟内接种完)作为接种液。 稀释法：包括琼脂稀释法、肉汤稀释法和Etest法。 培养条件：为35 、5CO2培养2024小时。质控菌株ATCC 49619。,4.肺炎链球菌感染的治疗,青霉素G敏感均可直接用青霉素G进行治疗; 青霉素G中度耐药株可用大剂量青霉素G进行治疗； 如重度耐药可选用三代头孢菌素加万古霉素或利福平进行治疗。,总 结,1. 肺炎链球菌寄居于人的上呼吸道中，是条件 致病菌； 2.肺炎链球菌对营养要求较高，在含有新鲜血液 的培养基中生长良好； 3.以optochin 试验和胆汁溶菌试验将肺炎链球菌 与其他溶血链球菌相区别； 4. 血清学鉴定特异性高； 5. 要注意对PRP和MDR的检测。,谢谢！,