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1、凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA）可以：（1）研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用；（2）可用于DNA定性和定量分析；（3）用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。实验方法原理凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分
2、离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。当检测 如转录调控因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时，依据目的RNA结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特异）， 和其它非相关的片段（非特异），来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。试剂、试剂盒-32PATPT4多聚核苷酸激酶Nucle
3、ase-Free WaterT4多聚核苷酸激酶缓冲液醋酸铵TE无水乙醇TBE buffer重蒸水甲叉双丙烯酰胺丙烯酰胺甘油过硫酸铵TEMED（四甲基乙二胺）EMSA Gel-Shift结合缓冲液溴酚蓝仪器、耗材水浴锅PCR仪离心机电泳仪电泳槽实验步骤一、探针的标记1. 如下设置探针标记的反应体系：（1）待标记探针 (1.75 pmol/微升) ：2微升。（2）T4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X) ：1微升。（3）Nuclease-Free Water ：5微升。（4）-32PATP(3 000 Ci/mmol at 10 mCi/ml) ：1微升。（5）T
4、4 Polynucleotide Kinase (5-10 u/微升) ：1微升。（6）总体积 10微升（7）按照上述反应体系依次加入各种试剂，加入同位素后，Vortex混匀，再加入T4 Polynucleotide Kinase，混匀。2. 使用水浴或PCR仪，37反应10分钟。3. 加入1微升探针标记终止液，混匀，终止探针标记反应。4. 再加入89微升TE，混匀。此时可以取少量探针用于检测标记的效率。通常标记的效率在30%以上，即总放射性的30%以上标 记到了探针上。为实验简便起见，通常不必测定探针的标记效率。5. 标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保
5、存在-20。二、 探针的纯化通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。在有些时候，纯化后的探针会改善EMSA的电泳结果。如需纯化，可以按照如 下步骤操作：1. 对于100微升标记好的探针，加入1/4体积即25微升的5 M醋酸铵，再加入2体积即200微升的无水乙醇，混匀。2. 在-70至-80沉淀1小时，或在-20沉淀过夜。3. 在4，12 000 g-16 000 g离心30分钟。小心去除上清，切不可触及沉。4. 在4，12 000 g-16 000 g离心1分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀，但不宜过分干燥。5. 加入100微升TE，完全溶解沉淀。标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一
6、般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在 -20。三、EMSA 胶的配制1. 准备好倒胶的模具。可以使用常规的灌制蛋白电泳胶的模具，或其它适当的模具。最好选择可以灌制较薄胶的模具，以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果，可以选择可灌制较大 EMSA 胶的模具。2. 按照如下配方配制20毫升4的聚丙烯酰胺凝胶(注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis对结果影响不大)。（1）TBE buffer (10X)： 1毫升。重蒸水 16.2毫升。（2）39:1 acrylamide/bisacrylamide (40%,w/v)： 2毫升。（3）80% 甘油： 625微升。（4）10% 过硫酸铵 (a
7、mmonium persulfate) ：150微升。（5）TEMED ：10微升3. 按照上述次序加入各个溶液，加入TEMED前先混匀，加入TEMED后立即混匀，并马上加入到制胶的模具中。避免产生气泡， 并加上梳齿。如果发现非常容易形成气泡，可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理。四、EMSA结合反应1. 如下设置EMSA结合反应阴性对照反应：(1）Nuclease-Free Water ：7微升。（2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升。（3）细胞核蛋白或纯化的转录因子： 0微升。（4）标记好的探针 ：1微升。（5）总体积 ：10微升。样品反应：（1）Nuclease-
8、Free Water ：5微升。（2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升。（3）细胞核蛋白或纯化的转录因子 ：2微升。（4）标记好的探针： 1微升。（5）总体积： 10微升。探针冷竞争反应：（1）Nuclease-Free Water ：4微升。（2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升。（3）细胞核蛋白或纯化的转录因子： 2微升。（4）未标记的探针： 1微升。（5）标记好的探针： 1微升。（6）总体积 ：10微升。突变探针的冷竞争反应：（1）Nuclease-Free Water ：4微升。（2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微
9、升。（3）细胞核蛋白或纯化的转录因子 ：2微升。（4）未标记的突变探针： 1微升。（5）标记好的探针： 1微升。（6）体积 ：10微升Super-shift反应：（1）Nuclease-Free Water：4微升。（2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升。（3）细胞核蛋白或纯化的转录因子：2微升。（4）目的蛋白特异抗体 ：1微升。（5）标记好的探针：1微升。（6）总体积 ：10微升。2. 按照上述顺序依次加入各种试剂，在加入标记好的探针前先混匀，并且室温(20-25)放置10分钟，从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合，或者让冷探针优先反应。然后加入标记好的探针，混
10、匀，室温(20-25)放置20分钟。3. 加入1微升EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色，10X)，混匀后立即上样。注意：有些时候溴酚蓝会影响蛋白和DNA的结合，建 议尽量使用无色的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液。如果对于使用无色上样缓冲液在上样时感觉到无法上样，可以在无色上样缓冲液里面添加极少量的蓝色的上样缓冲液，至能观察到蓝颜色即可。五、 电泳分析1. 用0.5XTBE作为电泳液。按照10V/厘米的电压预电泳10分钟。预电泳的时候如果有空余的上样孔，可以加入少量稀释好的1X 的EMSA上样缓冲液(蓝色)，以观察电压是否正常进行。2. 把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内。
11、在多余的某个上样孔内加入10微升稀释好的1X的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液 (蓝色)，用于观察电泳进行的情况。3. 按照10 V/厘米的电压电泳。确保胶的温度不超过30，如果温度升高，需要适当降低电压。电泳至EMSA/Gel-Shift上样缓 冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处，停止电泳。4. 剪一片大小和EMSA胶大小相近或略大的比较厚实的滤纸。小心取下夹有EMSA胶的胶板，用吸水纸或普通草纸大致擦干胶板边 缘的电压液。小心打开两块胶板中的上面一块(注：通常选择先移走硅烷化的那块玻璃板)，把滤纸从EMSA胶的一侧逐渐覆盖住整个EMSA胶，轻轻把滤纸和胶压紧。滤纸被胶微微浸湿后
12、(大约不足1分钟)，轻轻揭起滤纸，这时EMSA胶会被滤纸一起揭起来。把滤纸侧向下，放平，在EMSA胶的上面覆盖一层保鲜膜，确保保鲜膜和胶之间没有气泡。5. 干胶仪器上干燥EMSA胶。然后用X光片压片检测，或用其它适当仪器设备检测。其他一、常见问答1. 什么是凝胶迁移或电泳迁移率实验？凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳
13、上，分离复合物和非结合的探针。DNA复合物或RNA复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时，依据目的RNA结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特异），和其它非相关的片段（非特异），来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。2. 实验中需要用到什么试剂？凝胶迁移实验需要的结合蛋白
14、，可来源于纯化或部分纯化的蛋白，或粗的核和胞质抽提液。还必须制备同位素标记的DNA或RNA。一般，DNA核苷酸探针用32P和T4多核苷酸激酶来作末端标记，同位素标记的RNA用噬菌体RNA聚合酶和同位素标记的核苷酸在体外合成。Promega公司的Riboprobe/sup系统（a,b）可用于同位素标记的RNA的体外合成，DNA 5末端标记系统，用于制备DNA探针，结合反应所需的组分有：含盐的溶液（氯化镁，氯化钠，或氯化钾）、缓冲体系（Tris-HCl或HEPES）、还原剂（DTT）、甘油、非特异的竞争DNA（poly（dI:dC）dI:dC），也可能含非离子去污剂。在结合蛋白和同位素标记的探针作
15、用后，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物，随后将凝胶干燥并放射自显影，或用PhosphorImage/sup分析。3. 凝胶迁移实验系统提供了什么试剂？Promega公司提供一种凝胶迁移实验系统检测DNA结合蛋白，系统可作为这类实验的一种阳性对照。系统包括目的寡核苷酸，对照DNA结合蛋白，结合缓冲液，用于寡核苷酸探针末端标记所需的试剂。Core 系统包括含重组AP2蛋白（AP2抽提液）的大肠杆菌抽提液和AP2的同源寡核苷酸。AP2抽提液是从表达AP2蛋白的大肠杆菌中提取的。另外，Core系统还含SP1同源寡核苷酸，凝胶迁移结合缓冲液，和能作20次对照实验的HeLa核抽提液。Complete
16、系统含另外5个双链寡核苷酸，分别是AP1、OCT1、CREB、NF-kB、 TFIID结合位点的同源序列。这些寡核苷酸可以在末端标记后用作特异性探针，或在竞争实验中用作非特异性探针。4. 成功进行凝胶迁移实验，需要优化哪些因素？凝胶迁移实验在理论上很简单也很快速，但要成功地进行凝胶迁移实验，需要优化一些参数，这主要受结合蛋白的来源和探针结合位点特点的影响。以下是需要优化的因素：抽提液的制备（核酸酶和磷酸酶污染会使探针降解），结合蛋白的浓度，探针的浓度，非特异性探针的浓度，缓冲液的配方和pH，聚丙烯凝胶电泳的特点和电泳条件，保温时间和温度，载体蛋白，是否有辅助因子（比如锌，或镉等金属离子，或激素
17、）。总之，反应总体积应最小（20l）。为满足一般要求，结合缓冲液含4%甘油，1mM MgCl2，0.5mM EDTA，0.5mM DTT，50mM NaCl，10mM Tris-HCl（pH7.5）， 0.05mg/ml poly dI:dC，或10mM HEPES（pH7.9）， 50mM KCl，1mM DTT， 1mM EDTA，10%甘油，0.05mg/ml poly dI:dC可作为优化实验的起始。5. 在DNA探针的选择上，要考虑哪些重要因素？目的DNA的长度应小于300bp，以有利于非结合探针和蛋白DNA复合物的电泳分离。双链的合成的寡核苷酸和限制性酶切片段可在凝胶迁移实验中用作
18、探针。如目的蛋白已被鉴定，则应用短的寡核苷酸片段（约为25bp），这样结合位点可和其他因子的结合位点区别开。长的限制性酶切片段可用于对推定的启动子/增强子区域内的蛋白结合位点定位。随后可用DNaseI 印迹对蛋白结合的特异区域在DNA序列水平上作出分析。6. 用以下一些转录调节因子和HeLa细胞核抽提物可形成哪些复合物：AP1, AP2, CREB, NFkB, Oct1, Sp1, TFIID, TFIIB。当用HeLa细胞核抽提物作为结合蛋白的来源时，每1个转录调节因子和它相关的DNA同源序列结合形成特征型的结合形态。以下的文字描述了每一个单独的转录调节因子，包括识别的同源序列，因子的大小
19、，特定的结合条件，以及和HeLa细胞核抽提物可形成的复合物的数目。1细胞核蛋白提取：取约8.8106个HSC-T6细胞，5ml PBS/Phosphatase Inhobitors冲洗，收集细胞。加入0.25 ml 1Hypotonic buffer重悬，冰浴15min；加入25l NP-40，震荡10s；14000g离心，30s，4；收集上清即胞浆蛋白，于70保存。将沉淀重悬于50l Lysis buffer（含DTT和Protease Inhibitor Cocktail）中，震荡10s；置于摇床中冰浴30min，150次/min；再次震荡30s，14000g离心，10min，4；取上清即
20、为核蛋白，于70保存，测定蛋白质浓度。2寡核苷酸探针的标记和纯化:rat ：NF-B：5AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC 3取寡核苷酸探针双链各5l，稀释为100l （终浓度10PM）；97加热15min，室温冷却，37孵育45min。配制如下反应体系：10buffer 2l2.5 mM dNTP(无d ATP) 3l寡核苷酸DNA 1l-32PdATP 4lddH2O 8.5lKlenow Fragment 1.5l (6U)37孵育60min。将标记的探针加入用STE预湿润的Sephodex-25 DNA纯化柱，加入TE 70l，加压收集液体于EP管中。取1l测放射性比活度。3
21、聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影：（1）配制8聚丙烯酰胺凝胶10TBE 5ml30 % 丙烯酰胺 10 ml10 % 过硫酸胺 0.6 mlTEMED 0lddH2O 35 ml电泳液为1TBE（2） 配制反应混合液：0.2 M Tris?Cl 1l1M NaCl 1l10 mM EDTA 1l10 mM DTT 1l20 mM MgCl2 1l2 ng/l Poly dIdC 1l25 % 甘油 3l-32PdATP 1l (不低于5万Ci)取5g核蛋白，加入反应混合液，ddH2O补足20l总体积。冷探针：加入1l 20 PM未标记探针。Supershift：加入NF-B p65 抗体1g，室温下孵育45min。8聚丙烯酰胺凝胶预先电泳30min后上样，100V电泳约3h。小心取下胶，吸附在滤纸上，表面用保鲜膜覆盖。干胶仪干胶40min，暗盒中压3-4张胶片，70冰箱中放射自显影2-3天，冲洗胶片。