人外周血单核巨噬细胞诱导、培养及鉴定.pdf

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1、第2 5 卷第5 期生物学杂志 V 0 1 2 5N o 5 2 0 0 8 年1 0 月 J O U R N A l O FB I O I O G YO c t ，2 0 0 8 人外周血单核巨噬细胞诱导、培养及鉴定 杨志梅，符州，王莉佳，陈艳 ( 重庆医科大学附属儿童医院，重庆4 0 0 0 1 4 ) 摘要：在重组人粒巨噬细胞集落刺激因子( r h G M C S F ) 作用下体外诱导培养人外周血单核巨噬细胞，并进行鉴定 和功能检测。F i c o l l 密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞( P B M C ) ，舍l O 胎牛血清的R P M I l 6 4 0 培养基和 r h

2、 G M C S F 培养7 d 。光镜、扫描电镜及透射电镜观察细胞形态，鸡红细胞吞噬试验检测吞噬功能，流式细胞术检测 单核巨噬细胞表面特征性标志C D l 4 等生物学技术鉴定贴壁细胞性质。获得的贴壁细胞具备巨噬细胞的形态学特 征及免疫表型。有吞噬功能，纯度较高。A - 夕I - 周血单核细胞在r h G M C S F 诱导下向巨噬细胞分化，具有生物学活性， 纯度较高是一种简单易行的体外诱导培养巨噬细胞的方法。 关键词：巨噬细胞；r h G M C S F ；培养；鉴定 中图分类号：R 3 2 9 2 + 8文献标识码：B文章编号f 1 0 0 8 9 6 3 2 ( 2 0 0 8 )

3、0 5 - 0 0 6 6 0 3 巨噬细胞是三大专职抗原提呈细胞之一，具有广 泛的生物学效应，如抗感染、抗肿瘤、参与免疫应答和 免疫调节等，是参与非特异和特异性免疫的重要细胞。 目前已经在动物实验中建立了一些体外培养巨噬细胞 的方法，如大鼠骨髓和小鼠腹腔巨噬细胞的培养引。 在本研究中，我们通过贴壁培养人外周血单核细胞，用 集落刺激因子诱导成为巨噬细胞，并进行鉴定和功能 检测，旨在探索该法培养的巨噬细胞作为体外免疫实 验材料的可行性。 1 材料与方法 1 1 主要试剂 R P M l l 6 4 0 培养基，胎牛血清( 天津T B D 公司) ，重 组人粒一巨噬细胞集落刺激因子r h G M

4、C s F ( p e p r o t e c h 公司) 、C D l 4 F I T C 及同型对照( 晶美) 。 1 2 巨噬细胞分离和培养 取健康人静脉血3 5m L ，肝素抗凝，F i c o l l 密度 梯度离心法分离外周血单个核细胞( P B M C ) 。用含 1 0 胎牛血清的R P M l l 6 4 0 培养基调整细胞数为3 1 0 6 m L ，置六孔板中培养。3 7 、5 C O ：孵箱贴壁3 h 后，用预温的培养基洗去未黏附细胞，悬浮细胞可重 复黏附，得到更多贴壁细胞。加入含1 0 胎牛血清的 R P M l l 6 4 0 培养基2m L 及r h G M C

5、S F ( 终浓度1 0 0 0u m L ) ，设未加r h G M C S F 的空白对照。隔2 d 半量换液， 培养7 d ，得贴壁细胞。 1 3 培养细胞的形态学观察 1 3 1 倒置相差显微镜观察每天进行贴壁细胞的 收稿日期：2 0 0 8 0 1 2 3 ；修回日期：2 0 0 8 0 2 1 9 形态观察。 1 3 2 光学显微镜观察吸去培养基，P B S 洗去悬浮 细胞，晾干。直接于六孔板中进行刘氏血细胞染色，光 镜下观察。 1 3 3 电子显微镜观察培养前在培养板孔内放置 2 4 2 4 r a m 的玻片，培养7d 后将长有贴壁细胞的玻片 用2 5 戊二醛固定。l 锇酸后固

6、定，梯度乙醇脱水， 醋酸异戊酯置换，C O ：临界点干燥，离子溅射喷金，S 3 4 0 0 N 扫描电镜观察。 1 3 4 透射电镜观察培养结束后洗去悬浮细胞， 2 5 戊二醛磷酸固定。1 锇酸后固定，梯度乙醇脱 水环氧树脂包埋，超薄切片，J E M - 2 0 0 0 E X 型透射电镜 现察。 1 4 吞噬功能检测 鸡红细胞吞噬试验阳 ：培养第7d 在培养体系中 加入5 鸡红细胞悬液1 0 0 斗L I I l L ，孵育3 0r a i n 至1 h ，P B S 冲洗、晾干、刘氏染色，油镜观察。计数2 0 0 个 巨噬细胞，计算吞噬指数和吞噬百分率。 1 5 流式细胞术表型检测 用细胞

7、刮刀小心刮取细胞，离心后P B S l 0 0 t t L 重 悬成单细胞悬液，加C D l 4 一F 1 T C1 0 p L ，阴性对照加 I s G 2 - F I T C 。避光孵育1 5r a i n ，P B S 洗1 2 次，洗去多 余抗体后加入缓冲液重悬，流式细胞仪上机检测细胞 表面C D l 4 表达水平。 2 结果 2 1 培养细胞的形态学观察 细胞培养7 d ，倒置相差显微镜下观察。未加G M C S F 培养组贴壁细胞数少，悬浮细胞较多，而G M - C S F 万方数据 第2 5 卷第5 期 2 0 0 8 年1 0 月 生物学杂志 J O U R NA I 。O F

8、B I O I O G Y V o L2 5N o 5 O c t 2 0 0 8 终浓度1 0 0 0u m L 剂量组可见较多典型贴壁细胞。贴吞噬率3 3 5 ( 4 - 5 1 ) ，平均吞噬指数5 4 1 2 3 。 壁细胞伸展，牢固黏附，体积明显增大，从不规则形逐 渐变成椭圆形，呈煎蛋状，少数呈长梭形。细胞间可有 部分融合，细胞周边或两极可见板状伪足和突起，细胞 无明显增殖( 图1 ) 。 图1 巨噬细胞光镜观察x 4 0 F i g1M o n o c y t e d e r i v e dm a c r o p h a g e su n d e rI n i c l D s c

9、o p e ( 4 0 ) 刘氏染色后油镜观察：细胞体积较大，形态不规 则。胞浆丰富，淡蓝色，富含颗粒及少许空泡。胞核紫 红色，为卵圆形、肾形或不规则形，具有典型的巨噬细 胞形态学特征( 图2 ) 。 图4 巨噬细胞透射电镜 F i g4 M o n o c y t e - d e r i v e dm a c r o p h a g e su n d e rt r a n s m i s s i o n e l e c t r o nm i c r o s c o p e 图5 巨噬细胞吞噬鸡红细胞1 0 0 F i g5 M o n o c y l e d e r i v e dm a c

10、 r o p h a g e sp h a g o c y t i z e dc h i c k e n e r y t h r o c y t e s ( L i u sS t a i n 1 0 0 ) 2 3 流式细胞术鉴定 重复5 次，C D l 4 细胞阳性率8 7 5 0 ( 4 - 9 2 3 ) ( 图6 ) 。 图2巨噬细胞刘氏染色后光镜观察1 0 0 i n g 2 一。d u e r i 。v e dm a c 川m p h 。a g e ，妇哪 i | ( U u 。8S “n 1 0 0 )： 扫描电镜：细胞形态不规则，直径约2 0 t r m ，伸出许 。 多丝状伪

11、足和粗大的细胞突起，细胞表面有皱褶和微 绒毛( 图3 ) 。 R 1 4 - t 1 8 G , z - F I l C ， a I “t t3 鼻o O u 喇0 0 一 墟神髓 饷 3 ： 器 ， f ；爱 E 1 4 - F I T c a l 喇“o m ，乱0 a l d Q 自一 U L 2 12 旧n 7 1 图6 巨噬细胞表面C D l 4 表达 ” F i g6 C D l 4e x p r e s s i o no fm o n o c y t e - d r i v e dn m c r o p h a g e s 3 讨论 巨噬细胞具有活跃的生物学功能，在免疫应答和 机

12、体防御机制中起重要作用，与许多疾病如支气管哮 喘、动脉粥样硬化等发生发展密切相关，是当前研究的 图3 巨噬细胞扫描电镜 重点。巨噬细胞的培养是重要手段。 F i g3M o n o e y t e d e f t ，e d 。l l a c m p h a g e su n d 。s c a n n i n ge l e c t r o n m i 。唧 本试验选用人外周血单核细胞作为巨噬细胞的来 透射电镜：胞质内含大量溶酶体、吞饮小泡、吞噬 源，取材较斑蝥法方便，且比动物试验更接近人体机 体，线粒体丰富、胞浆颗粒明显，细胞膜内侧有许多微 能。单核细胞具有不同的分化潜能，在不同的培养条 丝和微

13、管( 图4 ) 。 件下可向巨噬细胞或树突状细胞分化。M - C S F 和G M - 2 2 吞噬功能检测 C S F 在体外均可诱导单核细胞分化为巨噬细胞，但不 吞噬鸡红细胞的巨噬细胞，胞浆内可见多个鸡红同条件培养的巨噬细胞具有不同的形态学特点及生物 细胞核和红细胞，核被挤压( 见图5 ) 。鸡红细胞平均 学功能，且细胞表面糖蛋白、免疫学表型、基因表型不 、 6 7 万方数据 第2 5 卷第5 期生物学杂志 V 0 1 2 5N o 5 2 0 0 8 年10 月 J O U R N A LO FB I O L O G Y O c t ，2 0 0 8 _ I _ _ _ l - - _

14、_ _ _ - _ l _ - _ - _ _ _ _ _ _ II I I - _ _ _ _ _ _ _ - _ - - - - - _ I _ - l _ _ _ _ _ _ _ l l - - _ _ 同，而G M - C S F 诱导的巨噬细胞与肺泡巨噬细胞有相 似的功能及表型特点H 一6 。肺泡巨噬细胞一般通过肺 泡灌洗液获得，人肺泡巨噬细胞取材困难。因此，该法 体外培养的巨噬细胞可作为人肺泡巨噬细胞的体外模 型，对呼吸系统疾病的研究具有重要价值。 巨噬细胞的鉴定指标主要包括形态学检查、生物 学功能检查和免疫学标志检查等。通过光镜和电镜观 察，证明培养的贴壁细胞具备巨噬细胞的形态特

15、点。 试验发现0 2 5 的胰酶不易消化贴壁细胞，符合巨噬 细胞具有强大贴壁能力的特点。鸡红细胞吞噬试验表 明体外培养的巨噬细胞具有生物学活性。C D l 4 是单 核巨噬细胞系统特征性的表面标记，流式细胞术检测 显示C D l 4 细胞阳性率8 7 5 0 ( 4 - 9 2 3 ) ，图中显示的 小细胞可能为刮取细胞所致的细胞碎片，未纳入数据 分析。 综上所述，从形态学观察、吞噬能力和表型检测， 证明G M C S F 作用于外周血单核细胞可使其分化为具 有强大贴壁能力的巨噬细胞。该法培养的巨噬细胞在 体外具有生物学活性，纯度较高，而且来源于人体，可 作为体外免疫试验的材料。简易而实用。

16、参考文献： 1 李静，王亚平大鼠骨髓巨噬细胞的分离、纯化，培养及鉴定 J 重庆医科大学学报2 0 0 3 ；2 8 ( 4 ) ：4 3 6 4 3 9 2 尹美珍，李世普，袁林，等小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养及 鉴定 J 武汉大学学报( 医学版) ，2 0 0 6 ；2 7 ( 2 ) ：2 0 3 - 2 0 5 3 】刘秀珍造血祖细胞培养技术实验手册 M 】北京：北京出版 社，1 9 9 3 ；1 6 0 一1 6 1 4 W e g r o w s k iY ，M i l a r dAL ，K o t l a = G ，e ta 1 C e l l 幽p m t e n g l y c

17、a n e x p r e s s i o nd u r i n gm a t u r a t i o no fh u m a nm o n o c y t e s d e r i v e dd e n d r i t i c c e i l sa n dm a e r o p h a g e s J C l nE x pI m n u n o L2 0 0 6 ；1 4 4 ( 3 ) ：4 8 5 4 9 3 5 A k a g a w aKS K o m u r oI ，K l n l a g s w aH ，e ta 1 F u n c t i o n a lh e t e r o g

18、 e n e i t y o fc o l o n y s t i m u l a t i n gf a c t o r - i n d u c e dh u m a nm o n o c y t e - d e r i v e dI n a c 睁 p h a g e s J R e s p i r o l o g y 2 0 0 6 ；l l ( 1 ) ，3 2 3 6 6 L e h t o n e nA ，A h l f o r sH ，V 鼬k m a nV G e n ee x p r e s s i o np r o f i l i n gd u r i n g d i f f

19、 e r e n t i a t i o no fh u m a nm o n o c ) r t t om a c m p h a g e s0 1 d e n d r i t i cc e l l s J JL e u k o cB i o L2 0 0 7 ；8 2 ( 3 ) ：7 1 0 2 0 I n d u c t i o n ，c u l t i v a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no fh u m a n m o n o c y t e - d e r i v e dm a c r o p h a g e Y A N GZ h

20、 i m e i 。F UZ h o u 。W A N GL i - j i a ，C H E N GY a n ( D e p a r t m e n to fr e s p i r a t o r yd i s e a s e ，C h i l d r e n H o s p i t a l ，C h o n g q i n gM e S c a lU n i v e r s i t y ，C h o n g q i n g4 0 0 0 1 4C h i n a ) A b s t r a c t ：T oi n d u c ea n dc u l t i v a t eh u m a

21、nm o n o c y t e - d e r i v e dm a c m p h a g ew i t hr h G M - C S Fi nv i t r o ，t h ec e i l sW a si d e n t i f i e da n di t sb i - o l o g i c a lf u n c t i o nW a se x a m i n e d M o n o n u c l e a rc e l l si s o l a t e df r o mh u m a np e r i p h e r a lb l o o dw e 陀i n c u b a t e

22、di nR P M I l 6 4 0m e d i u ms u p p l e - m e n t e dw i t h10 h e a t - i n a c t i v a t e df e t a lb o v i n es e l 3 1 m ( F B S ) i nt h ep r e s e n c eo fh u m a nr e c o m b i n a n tg a n d o c ”em a c r o p h a g ec o l o n y s t i m u l a t i n gf a c t o r ( r h G M C S F ) f o r7d a

23、y s T h ea d h e r e n tc e l l sw e 陀e s t i m a t e dt ob em a e r o p h a g ea c c o r d i n gt om o r p h o l o g y ，p h a g o c y t o s i so f c h i c k e ne r y t h r o c y t e sa n dt h ee x p r e s s i o no fc e l ls u r f a c ea n t i g e n T h ea d h e r e n tc e l l sd i s p l a yt h em o

24、 r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i ca n di m m u n o - p h e n o t y p eo fm a c r o p h a g ea n dw i t hb i o l o g i c a lf u n c t i o n T h i si sas i m p l ea n de a s ym e t h o df o ri n d u c t i o n ，c u l t i v a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no f h u m a nm o n o c l

25、 e - d e r i v e dm a c m p h a g e K e y w o r d s ：m a c r o p h a g e ；r h G M C S F ；c u l t i v a t i o n ；i d e n t i f i c a t i o n ( 上接3 3 页) E f f e c t so fc a d m i u mo nt h eg r o w t h ，p h y s i o l o g i c a la n d e c o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so fp e a n u ts e e

26、d l i n g W UG a n 1 i n ( D e p a r t m e n to fL i f eS c i e n c e ，A n q i n gN o r m a lC o l l e g e ，A n q i n g2 4 6 0 11 ) A b s t r a c t ：H y d r o p o n i c se x p e r i m e n t sW a Sc o n d u c t e dt os t u d yt h ee f f e c to fC d 2 + t r e a t m e n t ( 0 ，0 0 1 ，0 1 0 ，0 5 0 ，1 0

27、0m m o L L r e - s p e c t i v e l y ) o np l a n tg r o w t ha n d , s o m ep h y s i o l o g i c a la n de c o l o g i c a li d e n t i t i e so fp e a n u t ( A r a c h i sh y p o g e aL ) s e e d l i n g s T h er e s u l t s s h o w e dt h a tC d 2 + c o u l da f f e c tg e r m i n a t i o no fs

28、 e e d sa n dg r o w t ho fp e a n u ts e e d l i n g P e a n u ts e e dg e r m i n a t i o nr a t ew a gi n h i b i t e da tC A 2 + c o n c e n t r a t i o no v e r0 5m m o V LP e a n u ts e e d l i n gh e i g h t ，r o o tl e n g t ha n dl a t e r a lr o o tn u m b e rw e r ed e c r e a s e dw i t

29、ht h ei n c r e a s i n go fC d “ c o n c e n t r a t i o n T h ec o n t e n to fc h l o r o p h y l lo fp e a n u ts e e d l i n g sw a sd e c r e a s e d ，w h i l ea c t i v i t yo fP O Da n dM D Ai n c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s i n go fC d “c o n c e n t r a t i o n H o w e v e r ，t h

30、ea c t i v i t i e so fP O Da n dr o o tg r o w t hd e c r e a s e dw h e nC d2 + c o n c e n t r a t i o nW a so v e r0 5m m o l L ， b e l o ww h i c hb o t ho fP O Da n dM D Ai n c r e a s e dw i t ht l l ei n c r e a s i n go fC d 2 + c o n c e n t r a t i o n K e y w o r d s ：p e a u n t ( A r a c h i sh y p o g a e a 厶) ；s e e d l i n gg r o w t h ；r o o ta c t i v i t y ；p r o t e c t i v ee n z y m ea c t i v i t y 6 8 万方数据