单分子荧光检测技术.pdf

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1、 分 子 发 光 分 析 涂熹娟涂熹娟涂熹娟涂熹娟 B200425010 单分子荧光检测技术 涂熹娟 B200425010 【摘要】单分子检测技术有别与一般的常规检测技术，观测到的是单个分子的个体行为，而不 是大量分子的综合平均效应。近年来随着相关学科的技术进步，单分子研究已经在从分子生物学 到细胞生物学等生命科学领域有了迅速的发展和应用。本文简要介绍了单分子荧光检测技术的研 究背景、意义、原理，以及该项技术进展和应用。 【关键词】单分子 荧光寿命 荧光偏振 单分子FRET 1. 单分子检测技术的意义和发展背景 1.1 单分子检测技术的意义 在统计力学的各态遍历假设中，系综个体物理量轨迹的时间

2、平均等于该物理量在 给定时间的系综平均1。 在一个包含完全相同个体的系综， 当测量时间足够长的时候， 系综测量和单分子测量结果相同（例如对于稀溶液中小分子的核磁共振谱线的测定， 由于测量时间远大于小分子的翻滚时间，这时体系就可以看成是一个均匀的体系，并 看作静态） ；但是即使在均相体系中，分子本身并不是处于静态，而是在不断地运动， 测量的参数具有涨落现象，而测量时间可能会小于分子的涨落时间；另一种情况是在 非均相体系中，个体轨迹平均本来就不等于系综平均（实际上几乎所有生物体系都不 是均相体系） 。这以上考虑到的两点都导致系综测量结果和单分子测量结果不等。一 般系综测量结果表示的是大量由一种或多

3、种对象组成的一个整体所表现出来的平均 效应和平均值。这一平均效应掩盖了许多特殊的信息。而这些特殊的信息有时是非常 分 子 发 光 分 析 涂熹娟涂熹娟涂熹娟涂熹娟 B200425010 重要的， 尤其在研究具有非均匀特性的凝聚相物质和生物大分子结构时。 而相比之下， 单分子检测就可做到对体系中单个分子的行为进行研究，可以得到在特定时刻，特定 分子的特殊位置和行为，因为在某一时刻，集团中的任何成员只能处于一种状态。将 此再与时间相关，还可得到单个分子的行为的分布状况。这样我们就可以同时得到所 研究的对象的整体行为和个体行为了，然后将数据综合处理，得到更为全面的信息。 1.2 单分子检测技术的意义

4、和发展背景 既然单分子检测技术有这么多的好处，为什么直到近年来才逐渐发展起来呢？这 与光学系统的进展有很大的关系。其实人类很早以前就有探索微观世界奥秘的要求， 但是苦于没有理想的工具和手段。 直到世界上第一台可以被称为显微镜的仪器在 1675 年由荷兰生物学家列文虎克制作出来。在以后的几百年，人们一直用光学显微镜观察 微观和探索眼睛看不到的世界，但是光具有波动性使光学显微镜的分辨率只能达到光 波的半波长左右，人类的探索因此受到了限制。即使消除掉透镜形状的缺陷，任何光 学仪器仍然无法完美的成像。人们花了很长时间才发现，光在通过显微镜的时候要发 生衍射，即物体上的一个点在成像的时候不会是一个点，而

5、是一个衍射光斑。如果两 个衍射光斑靠得太近， 你就没法把它们分辨开来。 显微镜的放大倍数再高也无济于事。 对于使用可见光作为光源的显微镜，它的分辨率极限是 0.2 微米。任何小于 0.2 微米 的结构都没法识别出来。 提高显微镜分辨率的途径之一就是设法减小光的波长， 或者， 用电子束来代替光。根据德布罗意的物质波理论，运动的电子具有波动性，而且速度 越快，它的“波长”就越短。如果能把电子的速度加到足够高，并且汇聚它，就有可 能用来放大物体。进人 20 世纪，光电子技术得到了长足的发展，1938 年，德国工程 师 Max Knoll 和 Ernst Ruska 制造出了世界上第一台透射电子显微镜

6、（TEM） 。几十年 来，又有许多新型的显微镜问世，1952 年，英国工程师 Charles Oatley 制造出了第一 台扫描电子显微镜（SEM） 。电子显微镜是 20 世纪最重要的发明之一。由于电子的速 度可以加到很高，电子显微镜的分辨率可以达到纳米级（10 -9m） 。很多在可见光下看 分 子 发 光 分 析 涂熹娟涂熹娟涂熹娟涂熹娟 B200425010 不见的物体例如病毒在电子显微镜下现出了原形。用电子代替光，这或许已 经是一个反常规的主意，但是还有更令人吃惊的：1983 年，IBM 公司苏黎世实验室 的两位科学家 Gerd Binnig 和 Heinrich Rohrer 发明了所

7、谓的扫描隧道显微镜（STM） 。 这种显微镜比电子显微镜更激进，它完全失去了传统显微镜的概念。正是近年来这些 在光谱学和光学显微镜方面的进展，使得在表面和溶液中检测和成像单分子成为了可 能，而且可以对单分子的光谱性质进行检测并实时监控其动态过程。使得我们终于可 以看清单个分子与时间相关的行为，排除测量中的平均效应，发展单分子检测技术。 2. 单分子检测技术的原理 2.1 单个分子的荧光产生原理 Fig.1 单个分子的荧光产生原理 单分子的荧光产生原理如 Fig.1 所示2： S0， S1， S2分别为基态、 第一激发单重态、 第二激发单重态，T1为激发三重态。分子吸收一个光子 hA后，被激发到

8、较高的电 子态 S1或 S2以上的能级后又快速弛豫到 S1的最低振动能级，然后发射一个荧光光子 F，同时使分子弛豫到 S0的较高振动能级，最后快速弛豫到 S0最低振动能级。由 分 子 发 光 分 析 涂熹娟涂熹娟涂熹娟涂熹娟 B200425010 于弛豫过程造成了能量损失，因此荧光光谱发生红移。同时，分子也可能从 S1无辐射 系间窜跃到 T1，由于自旋禁阻，其速度远低于从 S1到 S0的辐射跃迁时间。然后从三 重态弛豫到基态并发射一个磷光光子P。单重态向三重态的跃迁会降低分子的荧 光量子产率和缩短分子的荧光寿命，当处于 S1态的电子弛豫到 T1态时，分子的荧光 很弱，乃至没有荧光，形成荧光暗态

9、。一旦当电子从 T1态回到 S0态时，分子处于新 的一轮激发和发射的循环过程。因而形成一个发射暗态交替的量子跳跃过程，这种 量子跳跃过程是单分子荧光的主要特征之一3。这一重要特征导致了实验中观察到的 单分子荧光光谱和荧光强度的涨落现象，并主要取决于单分子的局域环境及其淬灭途 径。因而测量单分子的荧光量子跳跃过程、荧光寿命和荧光量子产率可以提供很多关 于单个荧光分子所在的局域环境的特性和变化情况的信息. 单个荧光分子还具有唯一的固有荧光吸收跃迁偶极矩，分子只吸收那些偏振方向 与其吸收跃迁偶极矩方向一致的光子，然后发出具有一定偏振方向的荧光。荧光的偏 振特性是单分子的另一重要特征4。在单分子探测的

10、广泛应用中，人们正是利用这种 单个分子跃迁偶极矩的方向以及分子所处的环境的差异来研究和推测生物大分子的 结构和功能。 以上是单个分子的荧光产生原理。在单分子的实际荧光检测中是用激光激发荧光 分子或用染料分子标记了的其他分子，分子发出荧光。由于荧光物质通过激光束的时 间( ms 级)比荧光的激发态寿命( ns 级)大得多，因此一个荧光物质分子在通过激光束 的过程中可以被反复激发而在基态 S0和电子激发态 S1之间反复循环，发射出大量的 荧光光子，即“光子爆发” 。通过这种在短时间内发出大量光子的“光子爆发”现象5 可以把单个荧光物质分子的荧光同很强的背景杂散光区别开来，从而有效地探测单个 荧光分

11、子， 并从这样的爆发中获取研究对象的相关信息。 荧光分子在激发光的照射下， 反复经历多次激发、发射过程后，往往造成分子内部结构发生不可逆的变化，不能吸 收更多的光子而进一步发射荧光。这时就称该分子被光漂白了。我们希望一个荧光物 质分子在通过探测灵敏区时能够辐射尽可能多的荧光光子，这需要提高激光功率。而 当激光功率高时，荧光分子有可能在通过探测灵敏区的途中被漂白了，信噪比反而下 降。因此，在通过“光子爆发”提高荧光信号的同时，选择一个好的荧光分子和选取 分 子 发 光 分 析 涂熹娟涂熹娟涂熹娟涂熹娟 B200425010 合适的激光功率以避免“光漂白”6也是非常重要的。 2.2 单分子检测技术

12、的关键 将荧光基团标记在生物大分子上，可以通过其各种特性的变化来反映有关分子间 的相互作用、酶活性、反应动力学、构象动力学、分子运动自由度及在化学和静电环 境下活性改变等信息。并且标记上去的荧光团对宿主的性质影响很小。在稀溶液中， 吸光光度法检测单个分子的吸光值的准确度较低，而荧光发射检测因背景值较低，所 以较为灵敏，信噪比较高。正如 Keller 所说“单分子检测能力的高低与其说是检测灵 敏度的提高，不如说是背景噪音的降低”7 对单分子荧光的探测必须满足两个基本要求8： （1）在被照射的体积中只有一个 分子与激光发生相互作用，这一点可以很方便地通过调整研究体系的浓度（密度）来 达到； （2）

13、确保单分子的信号大于背景干扰信号。可以通过减少拉曼散射、瑞利散射 及其杂质荧光所造成的干扰来达到。杂散光背景是影响单分子荧光检测信号的重要因 素。为了有效地检测单个分子，必须大大降低杂散光的干扰。背景杂散光的主要来源 为：溶液瑞利散射光、拉曼散射光和光学器件的散射光。单分子检测在降低由瑞利散 射、拉曼散射及溶剂杂质荧光产生的背景干扰时，因为单分子信号与探测体积无关， 而背景则正比于探测体积，所以为减少单分子检测时背景杂散光的干扰，采用了降低 探测体积这一有效途径。因此，要获得理想的信噪比需要将激发体积最小化。目前文 献报道的流体聚焦法的检测体积可达到 110pL 的级别；微滴法也可达到 pL

14、级，共 聚焦显微法的探测体积则在 fL 至亚 fL 级， 因此背景可忽略不计， 具有很高的信噪比， 但这种方法由于布朗运动导致分子进入探测区域的概率较小，使得分子检测的效率较 低。如何平衡检测体积的减小与检测效率的提高亦是单分子检测技术亟待解决的问题 之一。另外，还有人使用毛细管和微通道来达到降低检测体积的目的。为了消除杂散 光，还可以采用的方法5：(a)光谱滤波：有滤光片去掉其它颜色的杂散光（如瑞利散 射光，光学器件散射光，溶液杂质的荧光） ；(b)利用荧光和杂散光在时间特性上的区 别来消除拉曼散射光。由于荧光强度是一条指数衰减曲线，荧光发射有几个 ns 的延 迟，因此采用高重复频率的激光器

15、并结合时间门符合技术可以把单个染料分子的荧光 分 子 发 光 分 析 涂熹娟涂熹娟涂熹娟涂熹娟 B200425010 信号同很强的背景杂散光区别开来。 3. 单分子检测技术 目前用于单分子研究的技术很多，包括观察其构象的变化、功能活动，以及与其 它分子相互作用的动力学过程，可揭示出过去检测多分子集体行为平均化所掩盖的 “个性”和蕴藏的丰富信息，从而深入了解生命活动的微观规律。可将其归纳成以下 两个方面：扫描探针技术和光学和光谱技术。在扫描探针技术中，主要有扫描隧道显 微技术(SEM)、原子力显微技术(AFM)和扫描离子电导显微镜技术(SICM)等相似技术 家族。而在光学和光谱技术中，则包括了扫

16、描近场光学显微技术(SNOM)、光钳技术 (OT)和荧光技术(Fluorescence)。 而且现在根据需要， 还发展出各种组合技术， 如 AFM/ 光钳、SNOM/共焦显微术、SNOM/FRET 等。 STM 利用针尖与样品在近距时的隧道电流，AFM 利用针尖与样品直接接触时的 力，SICM 利用针尖与样品间的电导达到成像的目的。由于这类技术可在常温常压下 进行，而且分辨率很高(10-910-10m 水平)，因此对于显示单个分子的形貌具有很大的 优越性。目前应用 AFM 比较普遍，它不仅可以观察处于溶液状态的单个分子，更接 近于生理状态，而且可以测量力谱，即和大分子一部分接触，并通过施力与距

17、离的关 系了解分子的力学性质，特别适合于对生物分子折叠与解折叠的研究。 各种形式的扫描探针显微技术较常规的光学显微技术有更高的空间分辨率，但在 获得高分辨的同时，这些方法却失去了光学显微技术的许多优点，如：对试样的无损 伤性，试样能置于空气中分析，仪器设备价廉、易操作、分析精度高、速度快等。尤 其是前三种优点使光学显微技术具有强大的生命力和吸引力。在单分子检测的光学和 光谱技术中，扫描近场光学显微技术能够获得超过光学衍射限的超高分辨。扫描近场 光学显微技术的近场是指光源与样品间的距离接近到纳米水平，而且光源通过针孔甚 至光纤的尖端加以限制，以致通常光学显微镜因为光的衍射现象而受光波波长的限制

18、被打破，分辨率不再决定于波长，而由光源尺寸和光源-样品的间距决定，因而可以达 到几十纳米的分辨率。 光钳技术是利用激光通过透镜后产生的力场，使样品因形成偶极子而在力场作用 分 子 发 光 分 析 涂熹娟涂熹娟涂熹娟涂熹娟 B200425010 下聚集于焦点的办法来操纵分子。光钳对微粒的操纵不是刚性的，而是像个弹簧，可 以在操作过程中实时测量微粒间的微小相互作用力。可以说即是机械手，又是力的微 探针。光钳作为“机械手”对生物微粒的生命活动的干扰极小，在整个操作体系涉及 的细胞生存环境几乎等同与“天然”环境，细胞等的生命活动的变化得以完整保留并 实时动态的展现给研究人员，是生物微粒静态和动态力学特

19、性的理想研究手段。这对 生物大分子行为的研究有很特别的意义。光钳作为力的探针，可以追踪在生物大分子 进行各种生化过程的同时，生命过程的运动（位移和速度） 、受力的大小和方向、彼 此间的结合与分离等运动学和动力学特征，并使这些生命活动成为可控的，使得对它 们的个体行为的研究真正从“观测”上升到“科学实验” ，是研究活体生物微粒在生 命活动中非常理想的一种手段。 4. 单分子检测技术在研究中的应用 荧光技术在群体测量中早已是一种很成熟的技术，但要达到测量单分子这一目的 还必须采取一些新的措施，例如尽可能减小受激发样品的体积3、利用高效率收集光 子的方法、应用高量子产率且低噪声的探测器（例如电荷偶合

20、探测器和雪崩光二极管 探测器） ，同时尽可能减小杂质和材料的本底荧光等。总的来说就是要尽可能的降低 由瑞利散射、拉曼散射及溶剂杂质荧光产生的背景干扰，加强对溶液中的单分子的识 别。 在单分子荧光检测中，通常采用激光作为激发光源，形成“光子爆发” 。依据荧 光寿命和分子在激光束中停留时间， 可以算出单个分子发射的最大光子数为105106。 目前光学检测系统收集、检测光子的效率约在 1%左右，故单个分子仍可被检测到数 千光子信号。在满足上述条件下应用集体探测中的一些原理，如能量共振转移、荧光 偏振测距离与取向等就可进行单分子检测。 4.1 利用荧光寿命进行单分子荧光检测 不同探针分子的荧光寿命也不

21、尽相同。通过测量单分子的荧光寿命可用来区分不 分 子 发 光 分 析 涂熹娟涂熹娟涂熹娟涂熹娟 B200425010 同的分子。且这种方法只需单束光源和一个检测通道，使用脉冲激光和时间相关检测 出被检光子的到达时间，然后作出到达时间的直方图即可以得出荧光寿命。并且单分 子的荧光寿命在由非辐射弛豫决定时对局域环境非常敏感，因此可以通过荧光标记生 物大分子的某一特殊位置，检测生物大分子的构象运动。Sauer等人9利用荧光寿命的 不同将水溶液中的Cy5-dCTP，MR121-dUTP和Bodipy-dUTP区分开。 4.2 利用荧光共振能量转移进行单分子荧光检测 虽然荧光能量共振转移早已作为一种有效

22、的光谱尺度用于聚集体，可测定 1 10nm 之间的距离，但它对于给体与受体分子之间相对运动的动力学事件则无能为力。 这是因为大量分子缺乏同步化所造成的。只有在实现了单分子对 FRET 测量后，才有 可能观察到毫秒时间尺度内生物大分子催化、折叠等过程中构象变化的动力学过程。 所谓单分子对荧光共振能量转移就是在一个生物大分子或两个相互作用的分子上标 记两个不同的荧光基团， 一个在能量转移过程中提供能量， 即供体； 另一个接受能量， 即受体。受体的吸收光谱与供体的发射光谱相重叠。由于偶极偶极相互作用，能量 从供体传递到受体。这样，通过检测能量传递效率，可确定两点间的距离，并且通过 监测能量转移效率随

23、时间的变化可以推测由生物大分子在生命活动中构象变化所引 起的两点间的距离的变化。最早实现这种测量的是 Ha T 等对固定与硅烷化玻璃片上 DNA 的相隔 10 到 20 个碱基对分别被 TMR(tetramethyrhodamine)荧光分子作为供体和 Texas Red 荧光分子作为受体标记后进行 FRET 测量10。 Nobuaki Soh 等11则是观察到 被两个胸腺嘧啶连接的 6FAM 和 5TAMRA 分子能够发生由 6FAM 分子向 5 TAMRA 分子的能量转移。当在 6FAM 的激发波长处激发时，得到的是 5TAMRA 的发射光谱。若溶液中有OH 自由基等存在，胸腺嘧啶之间的键

24、则会断开，能量转 移的途径被截断，这时，在 6FAM 的激发波长下，观测到的是在 6FAM 的发射波 长的荧光。 分 子 发 光 分 析 涂熹娟涂熹娟涂熹娟涂熹娟 B200425010 Fig.2 6FAM 和 5TAMRA 单分子对之间的共振能量转移 4.3 利用荧光偏振进行单分子荧光检测 单分子荧光偏振是获得分子有关取向的动力学过程的重要方法。在前面提到过， 荧光分子只吸收偏振方向与其跃迁偶极矩方向一致的光子，并发出具有一定偏振方向 的荧光。如果固定激发光的偏振方向，对于标记于生物单分子的某一特殊位置的荧光 分子，其荧光强度就会随着生物单分子在生化反应过程中构象的涨落（旋转、扩散） 的变化

25、而变化。若以线偏振光源激发，发射荧光的垂直分量和水平分量由不同的检测 器收集，通过公式便可计算出其荧光强度。Seidel 等12用此法区分了罗丹明 123 和黄 荧光蛋白。Joseph N. Forkey 等 11用此法证明了肌球蛋白 V 分子是按照“杠杆臂”假说 “行走”的。并且其轻链每摆动一次便会向前移动 36-37nm，这个数据和其结构或是所 处的生化环境无关。其步行和 ATP 的水解偶合，即每向前迈一步，便伴随着一个 ATP 分子水解和一个 ADP 分子的结合。在 ATP 循环过程的大部分时间中，肌球蛋白 V 分 子的轻链结合在肌动蛋白上。 分 子 发 光 分 析 涂熹娟涂熹娟涂熹娟涂

26、熹娟 B200425010 Fig.3 肌球蛋白 V 的单分子荧光偏振信号 5. 展望 单分子的研究近年来的迅速发展标志着生命科学研究等领域一个新的阶段的到 来。该技术目前已在从分子生物学到细胞生物学等学科的一些重要的领域有所应用， 将生物大分子的个体动力学行为真实地展现在科学工作者面前。但我相信这还只是一 个好的开头，随着相关学科的发展，以及单分子科学研究的深入，单分子检测技术必 将有更加诱人的前景。 分 子 发 光 分 析 涂熹娟涂熹娟涂熹娟涂熹娟 B200425010 参考文献 1Xie X S, Trautman J K. Annu Rev Phys Chem, 1998, 49:44

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