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1、淋巴细胞分离与计数淋巴细胞分离原理：外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。 实验材料：淋巴细胞分离液肝素稀释液（生理盐水）RPMI1640粉末实验设备：1ml移液器、移液管、 5ml注射器、刻度吸管、EP管、离心机、显微镜操作流程：1. 在离心管中加入适量淋巴细胞分离液。2. 无菌采集静脉血若干毫升,注入盛有肝素的无菌小瓶中，（每1ml全血加0.1ml 125-250U/ml肝素溶液),加盖后立即轻轻摇匀,使血液抗凝3. 稀释（外周血：稀释液=1：2 取肝素抗凝血与等量生理盐水充分混 匀
2、）4. 用刻度吸管沿倾斜的管壁，把稀释血缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面 （Ficoll：稀释血=1：2）5. 放入离心机1500r/min 离心20min（注:缓慢加速1-4档个3分钟 ）6. 用吸管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一离心管中，加入5倍以上体积的稀释液（生理盐水），1500rpm10分钟离心，洗涤细胞。7. 重复洗涤一次，1500rpm10分钟离心。8. 末次离心后，弃上清，加入含有10小牛血清的RPMI1640，重悬细胞9. 计数细胞后再调整细胞置所需浓度.10. 取一滴细胞悬液与一滴0.2台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。 单个核细胞浓
3、度(细胞数1毫升细胞悬液) 4个大方格内细胞总数 102(稀释倍数) 411. 分离出的淋巴细胞置于培养瓶中二氧化碳培养箱培养。注意事项:1. 每毫升外周血液大约可获1106单个核细胞 2. Ficoll应适量，外周血应充分稀释 3. 温度直接影响到Ficoll的比重和分离效果 4. 在Ficoll上加入稀释外周血时，应缓慢加，以免冲散界面 5. 吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多的上清液或分层液而导致血小板污染淋巴细胞计数：实验流程：1. 准备计数板：2. 制备细胞悬液：收集细胞，制成单个细胞悬液3. 加样：用吸管轻轻吹打细胞悬液，取少许细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液，4. 计数：在显微镜下，用10物镜观察计数板四角大方格中的细胞数5. 计算：将结果代入下式，得出细胞密度胞数/毫升原 =（4大格细胞数之和/4）104 注意事项：1. 取样计数前，应充分混匀细胞悬液 2. 加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡3. 细胞压中线时，数上不数下，数左不数右 4. 本法要求细胞密度不低于104细胞/ml5. 镜下计数时，细胞数过少或过多，说明稀释不当，需重新制备细胞悬液、计数