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1、基金项目 ： 国家高技术研究发展计划（863 计划）（2012AA101302） 通信作者 ： 朱鸿飞 Corresponding author ZHU HongFei ，Email ：bioclub vip sina com 倡同为第一作者 特约专稿 牛结核病对人类健康的影响及其诊断方法 贾红 倡 ， 鑫婷 倡 ， 郭晓宇 ， 袁维峰 ， 侯绍华 ， 朱鸿飞 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 ， 北京 100081 摘 要 ： 牛结核病是一种非常重要的人畜共患病 ， 其流行不但对畜牧业的发展产生直接影响 ， 而且会通过各 种途径感染人类 ， 给公共卫生带来严重威胁 。 本文主要就牛结核病的发
2、现 、 与人结核病之间的关系 、 对人类 健康的影响及其目前的诊断方法等进行介绍 。 关键词 ： 牛结核病 ； 人结核病 ； 诊断 Bovine tuberculosis and its impact on human health JIA Hong 倡 ，XIN Ting 倡 ，GUO XiaoYu ，YUAN WeiFeng ，HOU ShaoHua ，ZHU Hong Fei Institute of Animal Sciences and Veterinary Medicine ， Chinese Academy of Agricultural Sciences ， Beijing 1
3、00081 ，China Abstract ： Bovine tuberculosis is a zoonosis with significant impacts on both animal husbandry and public health The critical events ，such as the discovery of bovine tuberculosis ，the relationship between human tuberculosis and bovine tuberculosis and the diagnostic methods of bovine tu
4、berculosis ，are reviewed Key words ：Bovine tuberculosis ；Human tuberculosis ；Diagnosis 牛结核病（bovine tuberculosis）主要由结核分 枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosis complex ， MTBC） 成 员 牛 分 枝 杆 菌 （ Mycobacterium bovis ，M bovis）引起 ， 是一种非常重要的人畜共患 病 ， 其特征主要是渐进性消瘦和在患病组织和器官 形成结核结节 、干酪样病灶和钙化病变 1 。 牛分枝 杆菌最易感染牛 ， 给养牛业带来
5、巨大损失 。 这不仅 影响动物生产性能 ， 还波及食品供给 、 国际贸易 、收 入及社会稳定 24 ， 而且人吸入含菌气溶胶或食用未 经巴氏消毒的牛奶后 ， 动物结核病可传染给人 ， 从而 威胁人类健康 。 据世界卫生组织 （World Health Organization ， WHO）统计资料显示 ， 虽然目前牛结 核病在许多发展中国家得到很好控制 ， 但仍严重威 胁人类健康 。 WHO 、联合国粮农组织（Food and Agriculture Organization of the United Nations ， FAO）和世界动物卫生组织（Office International
6、des Epizooties ， OIE）将牛结核病划分为被忽视的人 畜共患病 ， 特别是在发展中国家 。 早在 WHO 专家 委员会第 7 次会议报告分析影响结核病流行状况因 素时就指出 ： “除非消灭牛结核病 ， 否则人结核病的 控制将不会成功” ， 表明牛结核病是影响人结核病流 行的重要因素 。 本文就牛结核病的发现 、 与人结核 病的关系 、 对人类健康的影响及其目前诊断方法等 进行介绍 。 1 牛结核病的发现 1882 年 ， Robert Koch 在结核病病变组织中分 离到致病菌 ， 并认为世界上只有一种“结核病病菌” ； 6 微生物与感染 Journal ofMicrobes
7、and Infections ，March 25 ，2014 ，9（1） ：613 http ：jmi fudan edu cn 但 Theobald Smith 在随后的研究工作中发现 ， 从患 结核病的牛和人中分离到的病原菌存在细微差异 ， 可能是 2 种不同的病原菌 。 最初人们认为从患结核 病的人中分离到的结核分枝杆菌对牛的致病性较 低 ， 而从患结核病的牛中分离到的牛分枝杆菌对人 的致病性也较低 。 但英国皇家结核病学会于 1911 年报道指出 ： 牛分枝杆菌不仅可从牛传染给人 ， 还能 引起有临床症状的人结核病 ； 牛奶是将结核病传染 给人的主要传染源 ， 特别容易经结核病奶牛所产
8、的 奶（结核奶）传染给儿童 ； 结核病牛的肉制品传播牛 分枝杆菌的危险比预计的小 。 根据这项研究报道 ， 包括英国在内的发达国家开始重视牛结核病 ， 并着 手制定牛结核病根除计划 5 。 2 牛分枝杆菌感染途径 2 1 牛分枝杆菌感染牛的途径及剂量 牛分枝杆菌主要影响牛的呼吸系统 ， 因此细菌 主要从患病动物的肺部以气溶胶形式排泄到体外 ， 含有牛分枝杆菌的气溶胶附着在草场 、 水槽等地方 ， 健康动物吸入即可能引起感染 。 研究显示 ， 大多数 （60 皮内变态反应阳性）的牛是吸入带菌气溶胶而 自然感染的 ， 6 10 个病菌即可引起感染 6 ， 7 。 而消 化道感染仅在偶然情况下发生
9、， 因为经消化道感染 所需的菌量远超过气溶胶感染途径 8 。 2 2 牛分枝杆菌感染人的途径及剂量 人吸入含菌气溶胶或黏膜和皮肤伤口接触患病 动物是牛分枝杆菌感染人的主要途径 ， 而人因食入 污染的牛奶 、 肉制品等而感染牛分枝杆菌的概率主 要与当地牛结核病的防控效果 、食品卫生措施及人 群所处环境有关 9 。 在发达国家 ， 如英国 、爱尔兰 等 ， 巴氏灭菌法广泛应用于牛奶的消毒 ， 尽管部分牛 场的结核病阳性率仍较高 ， 但牛结核病已不再成为 威胁城市人健康的主要凶手 5 。 然而 ， 发达国家的 家畜养殖业工作人员和农村居民由于经常食用生牛 奶或其奶制品 ， 经常接触感染牛 ， 仍受牛
10、结核病的威 胁 。 无论哪种感染途径 ， 牛分枝杆菌感染人的感染 剂量还不十分清楚 ， 研究人员估计数十至数百个病 原菌即可经呼吸道感染人 ， 而经消化道感染则需上 百万个病原菌 10 。 分枝杆菌耐热 ， 但巴氏消毒法能彻底灭活牛分 枝杆菌 11 。 因此 ， 食用未经巴氏消毒的牛奶有被感 染的风险 12 。 尽管牛分枝杆菌在牛奶中不会增殖 或增殖缓慢 ， 但一头患结核性乳腺炎的奶牛产奶时 会释放大量牛分枝杆菌 ， 足以污染 100 头健康奶牛 的总产奶量 13 ， 14 。 如今 ， 典型的结核结节在乳腺或 淋巴结中并不常见 。 在英国屠宰的全部结核菌素皮 内变态反应阳性牛中 ， 仅 0
11、5 1 0 的牛中可见 到典型的结核结节 15 。 亚临床感染的结核病牛所 产的奶液中每毫升含菌量最高可达 10 3 CFU 。 另 外 ， 挤奶器中的外源性牛分枝杆菌也可污染牛奶 。 牛分枝杆菌可在由未经巴氏消毒牛奶制成的酸奶和 奶油中生存 14 d ， 在黄油中生存 100 d ， 也能长期存 在于多种由未经巴氏消毒牛奶制成的奶酪中 16 ， 因 此用生奶生产奶油和其他奶制品不安全 5 ， 16 。 牛分 枝杆菌对化学消毒剂有较强的抵抗力 ， 耐酸 、 耐碱 ， 奶酪中pH 的变化并不会影响其生存 。 理论上 ， 食用来自结核病动物的未熟透的肉或 生肉及其肉制品也是人感染牛分枝杆菌的途径之
12、 一 5 。 早期的动物结核病研究者提倡进行肉品检 验 、 牛的屠宰检验 ， 以淘汰结核病阳性动物的肉产 品 。 如 1893 年有研究发现 ， 人结核病与食用结核病 阳性牛的牛肉有关 5 。 然而 ， 食用结核病动物的肉 而使人感染牛分枝杆菌的证据并不充分 ， 绝大多数 研究都没能从感染动物的肌肉组织分离 、 培养到牛 分枝杆菌 ， 将感染动物的肌肉处理后注射给实验动 物也未能引起实验动物发生结核病 5 。 牛分枝杆菌 生长非常缓慢 ， 且不能在动物体外增殖（在选择培养 基 37 长时间培养方可增殖） ， 而生肉制品的保存 期短 ， 且在低温下存放 ， 因此牛分枝杆菌几乎不可能 在生肉中增殖
13、 ； 另外 ， 长时间蒸煮也足以杀灭生肉中 的牛分枝杆菌 ， 且消化道不是结核病传播的主要途 径 ， 需呼吸道感染的千倍剂量方可感染人 。 这种感 染剂量在牛奶中可能存在 ， 但在无结核结节的肌肉 中非常少见 10 。 人经皮肤和黏膜感染牛分枝杆菌非常罕见 ， 主 要是挤奶工人 、 兽医和屠宰场工人在接触结核病阳 性牛或其病料过程中 ， 经皮肤 、 淋巴结或结膜感染牛 分枝杆菌 17 ， 18 。 3 牛分枝杆菌对人类健康的威胁 与结核分枝杆菌相比 ， 牛分枝杆菌有更广泛的 宿主 ， 可在自然情况下感染家畜和野生动物 ， 并在相 同或不同物种之间传染 ， 但感染人的概率要小一些 ， 也可在人与
14、动物 、 人与人之间传播 1922 。 近年来的 研究成果显示 ， 相对于结核分枝杆菌而言 ， 人类免疫 缺陷病毒（human immunodeficiency virus ，HIV） 感染患者更易共感染牛分枝杆菌 ， 且发展为活动性 结核病 ， 从而将牛分枝杆菌传染给与其密切接触 7 贾红 ， 等 ： 牛结核病对人类健康的影响及其诊断方法 者 2 ， 18 ， 23 。 另外 ， 发展中国家的绝大部分 HIV 感染 患者更易接触到牛分枝杆菌感染牛 ， 在这些国家和 地区 ，结核病已成为 HIV 感染患者最重要的 杀手 2 ， 10 ， 24 ， 25 。 在采用巴氏灭菌法消毒牛奶前 ， 美国
15、 10 30 的人结核病病例是由牛分枝杆菌感染所致 。 1934 年英国奶牛结核状况评估结果表明 ， 40 以上 奶牛感染牛分枝杆菌 ， 其中0 5 为结核性乳腺炎 ， 且每年有2 500人死于牛结核病 ， 占结核病死亡人数 的 6 。 我国 1979 、 1985 、 1990 年 3 次全国结核病流行 病学调查显示 ， 由牛分枝杆菌引起的结核病占结核 病发病总数的 3 8 、4 2 和 6 4 。 国际上一般 认为 ， 约 10 的人结核病由牛分枝杆菌引起 ， 而从 儿童患者中分离出的牛分枝杆菌占 33 。 我国华 中农业大学和哈尔滨兽医研究所都从牛体内分离到 人型结核分枝杆菌 。 199
16、6 年 ， 张高迪等发现牛结核 病中有 7 为结核分枝杆菌感染 ， 而人结核病中 10 6 为牛分枝杆菌感染 。 全世界人结核病中有 15 因饮用结核病牛的奶而导致 。 4 牛结核病的防控 4 1 发达国家牛结核病的防控经验 1925 年 ， 英国政府决定淘汰长期咳嗽 、消瘦等 有结核病临床症状的牛 ， 并对养殖户进行政府补贴 。 在这项措施下 ， 英国于该年淘汰（宰杀）15 000头牛 ， 其中2 500头产结核奶 5 。 1934 年英国官方报道 ， 超过 40 的牛感染牛分枝杆菌 ， 0 5 的牛有结核 性乳腺炎 ， 排结核奶 ， 且估计 15 20 牛结核病 流行地区每年有 2 500
17、 人死于结核病 。 这表示在 20 世纪 30 年代 ， 英国 6 的死亡人口是由结核病引起 的 ， 因此牛病研究会提出彻底扑杀牛分枝杆菌感染 牛是清除牛结核病的唯一正确途径 5 ， 26 。 1935 年 ， 英国建议牛场自愿参与牛结核病检测 和根除计划 。 1950 开始 ， 在牛结核病高阳性率的牛 场强制执行控制和根除计划 ， 通过每年进行结核菌 素皮内变态反应检测 、 及时淘汰检测阳性牛 、 政府补 贴等手段控制牛结核病 。 从 1960 年 10 月起 ， 在英 国全国范围内推行 。 结核菌素皮内变态反应阳性牛 年淘汰数从 1961 年的16 984头（3 5 ）降低至 1979 年
18、的 633 头（0 49 ） 5 。 牛分枝杆菌的感染宿主范围广 ， 1970 年发现带 菌的獾会将结核病传染给牛 。 尽管英国政府也采取 检测并淘汰结核病阳性獾 ， 但奶牛的结核病新发病 率从 1986 年开始稳步上升 1922 。 2004 年 ， 英国有 20 000头牛的结核菌素皮内变态反应呈阳性 ， 占总 检测数的0 43 ， 比 2000 年增加了7 072头 5 。 虽然英国的牛结核病发病率从 20 世纪 80 年代 中期开始升高 ， 但人年均感染率持续下降 ， 这主要得 益于英国从 19 世纪 30 年代开始在全国范围内推行 牛奶的巴氏灭菌和牛场牛结核病常规检测政策 。 193
19、8 年 ， 英国伦敦 98 的牛奶经巴氏灭菌法消毒 ， 5 岁以下儿童因牛分枝杆菌感染的病死率明显 降低 5 。 英国等发达国家通过动物结核病控制和根除计 划成功降低了牛结核病的发病率 ， 但根除计划也带 来了沉重的经济负担 ， 越来越多的养殖户和纳税人 开始质疑根除计划 ， 而且野生动物感染也使彻底根 除该病显得尤为困难 。 4 2 我国牛结核病的防控现状 20 世纪 40 年代 ， 大量患有结核病的奶牛从国 外输入我国 ， 我国牛结核病迅速流行 。 20 世纪 50 年代 ， 我国曾出现过牛结核病大暴发 ， 1955 年牛结 核病阳性率达36 4 。 20 世纪 50 70 年代 ， 牛结
20、 核病发病率一直呈缓慢上升的趋势 。 但随着奶牛业 不断发展 、 养殖规模不断扩大 ， 牛结核病的流行在 70 年代达到了历史最高峰 ， 个别地区阳性检出率高 达67 4 。 我国将牛结核病列为法定检疫对象 ， 并 且执行牛结核病的控制和根除计划 。 但由于检测技 术耗时费力 、 财政补偿标准太低 、 地方与个人承担比 例过高 、 检测人员配置及补贴太低等原因 ， 各地不检 或盲报现象比较严重 ， 使得不同机构进行的牛结核 病流行病学调查数据有差异 ， 且基本上不公开调查 结果 ， 以致我国缺少牛结核病流行现状的准确数据 。 可以肯定的是 ， 近年来我国牛结核病尤其是奶牛结 核病呈上升与蔓延趋
21、势 。 5 牛结核病的诊断方法 准确检测牛结核病是根除牛结核病的前提 ， 目 前主要依靠以下方法进行诊断 ： 一是基于细菌学的 检测方法 ， 如细菌染色涂片镜检 、 细菌培养和细菌接 种易感动物实验等 ； 二是基于免疫学的检测方法 ， 如 结核菌素皮内变态反应试验 、 干扰素（interferon ， IFN）释放试验和胶体金检测等 。 这两类诊断 方法各有利弊 ， 需综合应用 。 5 1 细菌学检测方法 细菌学检测方法主要检测病料中的致病性分枝 杆菌 ， 采集结核病阳性牛的肺 、 肺门淋巴结 、 肝 、 脾等 8 微生物与感染 Journal ofMicrobes and Infection
22、s ，March 25 ，2014 ，9（1） ：613 组织 ， 重点采集有典型结核结节的病变区域及病变 与健康组织交界区域 。 将病料涂片后进行齐尼抗 酸染色 ， 光学显微镜检查组织中是否有抗酸杆菌 ， 如 果组织内可见抗酸杆菌 ， 并具有典型的结核结节 ， 即 可作出初步判断 。 无菌采集结核病阳性牛的肺 、肺门淋巴结 、肝 、 脾等组织 ， 重点采集有典型结核结节的病变区域及 病变与健康组织交界区域 ； 如果没有病变 ， 则重点采 集肺门淋巴结 、 纵隔淋巴结 ， 酸或碱处理并中和后离 心 ， 取沉淀物接种于固体选择培养基和液体培养基 （改良罗氏培养基或罗氏培养基） ， 37 连续培养
23、 5 7 周 ， 见黄色 、 菜花样的牛分枝杆菌疑似菌落生长 时 ， 进行抗酸染色 、 镜检 。 牛分枝杆菌分离和培养是牛结核病诊断的金标 准 ， 特异性非常好 ， 但缺乏敏感性 ， 特别是从结核菌 素皮内变态反应呈阳性但解剖检查无典型结核结节 的个体采集的病料中难以成功分离和培养出牛分枝 杆菌 。 对于有典型结核结节的感染个体 ， 牛分枝杆 菌的分离率非常高 ， 可达 90 ； 但对于无结核结节 的个体 ， 分离率仅为 5 12 27 。 因此 ， 无结节 、 牛分枝杆菌分离和培养结果为阴性时并不能说明结 核菌素皮内变态反应阳性（或 IFN 释放试验阳 性）的个体未感染牛分枝杆菌 。 在大多
24、数发展中国 家及发达国家 ， 细菌培养只在特殊条件下开展 ， 如菌 株分型 、 耐药菌株的流行病学调查等 。 聚合酶链反应 （polymerase chain reaction ， PCR）主要用于对病料中分离 、培养的致病性分枝 杆菌进行分型等研究 。 1998 年 ， Ritacco 等针对分 枝杆菌基因组插入序列 IS1311 和 IS1245 中的高度 保守区域设计引物 ， 对其限制性片段长度多态性 （ restrictionfragmentlengthpolymorphism ， RFLP）进行 PCR 分析 ， 以鉴别分枝杆菌种属 2833 。 2011 年 ， Kaur 等针对
25、IS900 和 IS1311 基因序列设 计引物 ， 对禽分枝杆菌群进行分型鉴定 34 。 2000 年 Niemann 等针对 gyrB 设计引物 ， 对结核分枝杆 菌复合群的菌株进行分型鉴定 3538 。 针对耐药基 因和菌株特异性基因设计引物建立多重 PCR 方法 ， 可用于耐药菌株的快速诊断和纯培养菌株的分型 。 针对结核分枝杆菌 mpb70 特异性基因片段设计的 套式 PCR 能有效检测牛鼻拭子中的牛分枝杆菌 ， 检 测率达 60 以上 ， 被 OIE 推荐 39 。 但 PCR 检测方 法技术要求很高 ， 对检测环境要求也较高 ， 且在从病 料或痰液中提取基因组过程中可能会造成因
26、PCR 扩增效率低和人为污染等分别导致的假阴性和假 阳性 。 5 2 免疫学诊断方法 5 2 1 结核菌素皮内变态反应检测 结核菌素皮 内变态反应是最早用于诊断牛结核病的方法 ， 是目 前 OIE 推荐 、 世界上应用最广泛的牛结核病检测的 标准方法 ， 也是国际贸易的指定方法 。 该方法操作 简单 ， 易在田间操作 。 主要操作步骤 ： 在牛颈部上 13 处剃毛 ， 皮内注射纯化牛分枝杆菌结核菌素 （purified protein derivative from Mycobacterium bovis ， PPDB） ， 通常为 2 000 IU头 ， 由同一工作人 员分别在注射前及注射后
27、 72 h 测量注射部位皮厚 ， 计算皮厚差 。 皮厚差 4 mm ， 判定为结核病阳性 ； 皮厚差 2 mm ， 判定为阴性 ； 皮厚为 2 4 mm ， 需 在间隔 45 60 d 后进行第 2 次皮内变态反应检测 ， 如果第 2 次检测皮厚差 2 mm ， 则判定为结核病阳 性 。 但 PPDB 与环境分枝杆菌 、 禽分枝杆菌有交叉 抗原 ， 当牛感染环境分枝杆菌时 ， 皮内注射 PPDB 也易出现迟发型变态反应 ， 发生误判 。 为减少环境 分枝杆菌对检测的干扰 ， 欧洲联盟国家采用比较皮 内变态反应检测方法 ， 即在牛颈部 2 个点分别注射 PPDB 和 纯 化 禽 分 枝 杆 菌
28、结 核 菌 素 （purified protein derivative from Mycobacterium avium ， PPDA）。 PPDB 引起的皮厚差比 PPDA 引起的 皮厚差 2 mm ， 判定为牛结核病阳性 。 英国就是依 靠比较皮内变态反应检测方法从而控制了牛结核病 的蔓延 5 。 虽然结核菌素皮内变态反应检测方法的技术要 求不高 ， 可检测出大部分感染病畜 ， 美国 、 英国采用 扑杀结核菌素试验阳性牛的方法控制了牛结核病 ， 但该方法仍存在以下不足之处 ： 皮肤试验阳性只 能表明在过去某一时间曾经发生过致病性分枝杆菌 感染（主要是牛分枝杆菌） ， 无法检测是活动性结核
29、 还是潜伏期感染 。 该方法只能进行活体试验 ， 工 作量大 ， 不利于开展大规模的流行病学调查 。 该 方法重复性不佳 ， 检测结果受主观因素影响较多 。 检测人员必须与牛群密切接触 ， 增加了人感染牛 分枝杆菌的风险 。 检测敏感度不够高 ， 免疫力低 下的病牛易出现假阴性 。 PPDB 来源于牛分枝 杆菌强毒株的培养物 ， 是多种蛋白 、 脂类 、 糖的混合 物 ， 与环境分枝杆菌存在共同抗原 ， 会在环境分枝杆 菌感染个体中引起迟发型变态反应 ， 易引起误判 ， 特 别是在副结核病流行的牛场难以准确诊断牛结核 病 ；PPDB 的生产过程中需培养毒力牛分枝杆菌 ， 存在散毒的风险 ； P
30、PDB 是多种蛋白的混合物 ， 难 9 贾红 ， 等 ： 牛结核病对人类健康的影响及其诊断方法 以保持成分均一 、稳定 ， 只能通过豚鼠实验检测 、标 定其活性单位来进行质量控制 ， 不同批次的 PPD 可 能在抗原含量 、 种类上存在差异 ， 难以保持不同批次 产品质量的稳定性 40 ， 41 。 为克服结核菌素皮内变态反应检测方法的缺 点 、 提高检测的特异性 ， 科研工作者尝试筛选具有良 好 T 细胞刺激活性的牛分枝杆菌特异性抗原 ， 如培 养滤过蛋白10（culture filtrate protein 10 ， CFP10） 和 6 kDa 早期分泌抗原靶分子 （early secr
31、eted antigenic target of 6 kDa ， ESAT6）等 ， 并用其替代 PPDB 进行皮内变态反应试验 。 FloresVillalva 等 发现 ， 用 CFP10 和 ESAT6 的多肽混合物作为皮 内变态反应刺激原检测牛结核病时 ， 特异度可达 97 ， 但敏感度仅为 76 42 。 随后研究发现 ， 当用 Rv3615c 、Rv2346c 或 Rv3020c 作 为 CFP10 和 ESAT6 补充抗原进行皮内变态反应试验时 ， 检测 敏感度可提高至 87 ， 且可区分牛分枝杆菌感染牛 与卡介苗 （bacillus CalmetteGurin ，BCG）免疫
32、牛 4345 。 由于国际上报道的 、 基于重组蛋白的皮内 变态反应检测方法仅处于实验室研究阶段 ， 实验动 物基数偏小 ， 为进一步评价该方法在临床上的检测 效果 ， 本课题组建立了基于重组蛋白混合物 CFP 10ESAT6TB10 4 和 CFP10ESAT6Rv3872 MPT63 的皮内变态检测方法 ， 检测了1 097头牛 。 结果表明 ， 基于重组蛋白的皮内变态检测方法可有 效区分副结核病牛与牛分枝杆菌感染牛 ， 且具有良 好的敏感度（92 ）和特异度（97 ） ， 有临床应用的 潜力 46 。 5 2 2 IFN 释放试验 1990 年 ， Wood 等发现牛 分枝杆菌致敏的外周
33、血 T 细胞在体外培养条件下 再次被牛分枝杆菌抗原刺激时会释放大量的 IFN ， 从而创建了牛 IFN 释放试验的检测方法 47 ， 48 。 1989 1990 年 ， 研究工作者在新西兰 、澳大利亚和 西班牙等国家通过大规模临床试验证实 ， IFN 释 放试验可作为 PPD 皮肤试验的补充 ， 1991 年这些 国家批准了 IFN 释放试验用于牛结核病检测 49 。 该方法的主要操作步骤 ： 采集牛的肝素锂抗凝 血 ， 分装至 24 孔细胞培养板 ， 分别加入 PPDB 、 PPDA 和磷酸缓冲液（phosphate buffered saline ， PBS） ， 孵育 24 h 后收集
34、血浆 ， 用 IFN 定量试剂盒 检测血浆样品中 IFN 含量 。 如果 PPDB 与 PPD A 刺激孔的光密度 （optical density ，OD）差值 0 1 ， 同时 PPDB 与 PBS 刺激孔的 OD 差值也 0 1 ， 表明该动物结核病检测为阳性 。 该方法与结核菌素皮肤试验都以 PPDB 为刺 激原 ， 并不能区分牛分枝杆菌感染牛与 BCG 免疫 牛 。 虽然 PPDA 作为检测对照的刺激原 ， 可排除部 分禽分枝杆菌感染牛 ， 但在牛分枝杆菌和禽分枝杆 菌共感染的流行地区 ， PPDB 与 PPDA 刺激后的 血浆样品中 IFN 含量均很高 ，其差值很可能 0 1 ，
35、从而导致漏检与误判 ， 不能有效诊断牛结核 病 。 另外 ， 目前商品化试剂盒检测阈值（cutoff）的 设定主要是根据西班牙 、 澳大利亚和新西兰大规模 临床试验的检测数据 ， 这些地区的牛结核病控制较 好 ， 发病率较低 ， 与高发病率地区的阈值可能不同 。 因此 ， 在应用该试剂盒进行牛结核病诊断时 ， 应在检 测地范围内进行大规模的临床试验 ， 以获得适宜检 测地的阈值 。 为提高检测的特异性 ， 科研工作者利用 RD1 区 的 CFP10ESAT6 蛋白或多肽作为刺激原 50 ， 检 测特异度可达 100 ， 但有 15 30IFN 释放 试验检测为阳性的个体呈阴性反应 ， 因此需进
36、一步 筛选重组蛋白刺激原以提高检测的敏感度 。 总之 ， IFN 释放试验的数据客观 、特异性好 、对牛刺激 小 ， 是很有应用前景的牛结核病诊断方法 。 但基于 结核菌素或重组蛋白的 IFN 释放试验在发展中 国家难以大规模应用 ， 因为该方法需在专业的实验 室环境中操作 ， 血样必须在 16 h 内送至实验室进行 检测 ， 进口检测试剂盒价格昂贵 ， 包括中国在内的很 多发展中国家的中小型养殖企业 、 养殖户难以承担 ， 目前仅局限于实验室检测使用 。 我国也有很多单位 在研制具有自主知识产权的牛 IFN 检测试剂盒 ， 但目前尚无产品上市 。 5 2 3 抗体检测方法 尽管许多疾病可依靠
37、检测 血液中的抗原或抗体得到有效诊断 ， 但结核病的血 清学诊断仍是难点 。 最常用的血清学检测方法是建 立在侧向迁移或穿透迁移的快速免疫层析法 （immunochromatographic assay ， ICA）或酶联免疫 吸附试验 （enzymelinked immunosorbent assay ， ELISA）。 1946 年 ， Raffel 等陆续报道了体液免疫在结核 病进程中的作用及其在诊断中的意义 51 。 近年来 ， 应用 ELISA 检测抗体也比较广泛 ， 尤其是在具有结 核病病史的牛场 ， 对感染中 、后期的牛具有检测意 义 。 目前 ， 世界上用于结核病血清学检测的抗
38、原主 要有 PPD 、MPB64 、Ag85 复合物 、MPB70 、38 kDa 蛋白 、蛋白多肽等 5257 。 Redchuk 等用 MPB63 和 MPB83 建立的间接 ELISA 检测方法可鉴别诊断牛 01 微生物与感染 Journal ofMicrobes and Infections ，March 25 ，2014 ，9（1） ：613 分枝杆菌感染与环境分枝杆菌感染 ， 与皮内变态反 应试验和 IFN 释放试验相比 ， ELISA 成本更低 、 检测速度更快 、 操作更方便 ， 适用于大规模检测 。 我 国也有类似的抗体检测试剂盒和胶体金检测试纸条 上市 。 血清学诊断方法的
39、优点是方便 、 简单 、 高阴性预 测值及经济适用 。 然而 ， 由于机体会产生针对环境 分枝杆菌的抗体 ， 抗体检测易出现假阳性 ， 且难以区 分结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌感染 。 由于以上 原因 ， 尽管血清学检测方法非常方便 ， 但尚未被国际 结核病研究组织推荐使用 ， 且目前已建立的血清学 检测方法不能提供足够的敏感度和特异度数据 ， 不 建议作为一线检测手段 5861 。 比较感染实验（包括 禽分枝杆菌 、 牛分枝杆菌 、 副结核分枝杆菌和假结核 棒状杆菌的感染动物）证实 ， MPB70 ELISA 的特异 度为96 1 ， 而以 MPB70 进行的 IFN 释放试验 的特异度和敏
40、感度分别达99 1 和81 8 62 ， 显示 了 ELISA 检测的高敏感度和高特异度特点 。 6 结语 牛结核病是一种非常重要的人畜共患传染病 ， 严重威胁人类健康 ， 特别是对发展中国家产生重大 危害 。 消灭人结核病首先要控制牛结核病 。 世界各 国牛结核病防控的基本策略都是“检测扑杀” ， 大多 数国家仍沿用结核菌素皮内变态反应进行检测 。 目 前世界各国都在致力于研究和开发灵敏度高 、 特异 度好的检测新技术和新方法 ， 有的已在生产实践中 试用和推广应用 ， 但仍缺少敏感 、 快速 、 特异 、 简便和 适合大规模使用的方法 ， 特别是缺少能区分结核病 不同感染时期的检测方法 。
41、 因此 ， 应加大对牛结核 病防控的研究 ， 不但对推动养牛业的健康发展具有 重大作用 ， 而且对保障全人类的健康也具有重大 意义 。 参考文献 1 Smith NH ， Kremer K ， Inwald J ， Dale J ， Driscoll JR ， Gordon SV ，van Soolingen D ， Hewinson RG ，Smith JM Ecotypes of the Mycobacterium tuberculosis complex J J Theor Biol ，2006 ，239（2） ：220225 2 Cosivi O ，Grange JM ，Daborn
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