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1、生物制品生产中内毒素的控制及去除 姚伟任雅平李玉 中国生物技术集团公司兰州生物制品研究所，兰州，7 3 0 0 4 6 【摘要】细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖和微量蛋白的复合物，是革兰氏阴性杆菌 生长时释放或死亡时由细胞壁裂解产生的一类脂多糖类物质。人体对细菌内毒素极为敏感，极微量内毒素就 能引起体温上升。热原通常是指细菌内毒素的脂多糖。不存在细菌内毒素意味着不存在热原。内毒素对热 的耐受性非常强。常用的湿热灭菌法( 1 2 1 1 h ) 不能破坏内毒素。破坏内毒素生物活性的最有效方法是干 热灭菌法。一般1 8 0 。C4 h 或2 5 0 2 h 干烤，或用强碱强酸才能彻底破
2、坏它。生物制品生产中的每一个环节 都有可能污染内毒素使制品不合格，不仅给生产企业造成很大的经济损失，也会直接影响该企业的信誉和形 象。随着国家药监部门对生物制品质量的要求不断提高，对内毒素的要求也越来越高。因而，从事生物制品 生产的人员必须了解幽家对各项生物制品的内毒素控制要求，采取有效措施，控制制品内毒素含量，保证接种 者安全。生物制品中内毒素的来源主要有：菌毒种、生产环境、不规范操作、设备及器械、原辅材料等。 对于生物制品生产中内毒素污染的控制最主要的措施是生产过程控制，即严格按G M P 要求进行生产，严 格无菌操作，防止内毒素产生。生产车间必须是符合G M P 要求的洁净厂房，严格按规
3、定进行清洁消毒，并定 期对洁净问进行沉降菌、擦拭菌和尘埃粒数检测，合格后方可使用。细菌内毒素很容易吸附在容器上，生产中 任何直接接触制品的设备、容器、生产用具、管路、包括检测取样吸管、试管等必须保证无热原。耐热器具如玻 璃、不锈钢等应进行干热灭菌，1 8 0 。C4 h 或2 5 0 2 h 干烤除去热原。不耐高温用具，如胶塞、胶管等，可采用 0 2 M 氢氧化钠或盐酸浸泡4 h 以上，然后用新鲜注射用水冲洗至中性，再高压灭菌。保证注射用水新鲜无热 原。化学原材料应尽量选购无热原的，常用的化剂可干热灭菌。操作者必须严格按S O P 更衣、洗手、消毒。 对于任何非封闭系统的操作，均应采取无菌操作
4、方式。 细菌内毒素的去除可采用疏水层析、离子交换层析、亲合层析、凝胶层析、超滤、活性炭等方法。 内毒素对生物制品的危害虽然很严重，但只要我们了解了内毒素的特性就可以采取适合自己的有效方 法加以控制和去除。 一、内毒素特性及其对生物制品的危害 细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂 多糖和微量蛋白的复合物，是革兰氏阴性杆菌生长 时释放或死亡时由细胞壁裂解产生的一类脂多糖类 物质。人体对细菌内毒素极为敏感。极微量( 1 5 纳克公斤体重) 内毒素就能引起体温上升，发热反 应持续约4 小时后逐渐消退。内毒素引起发热反应 的原因是内毒素作用于体内的巨噬细胞等，使之产 生细胞因子，作用于宿主下丘脑的体
5、温调节中枢，促 使体温升高发热。严重者可发生内毒素血症和内毒 素休克。热原通常是指细菌内毒素的脂多糖。严格 地讲，不是每一种热原都具有脂多糖的结构，但所有 已知的细菌内毒素脂多糖都有热原活性。不存在细 菌内毒素意味着不存在热原。内毒素对热的耐受性 非常强。常用的湿热灭菌法( 1 2 1 l h ) 不能破坏内 毒素。破坏内毒素生物活性的最有效方法是干热灭 菌法。一般1 8 0 4 h 或2 5 0 2 h 干烤，或用强碱强 酸才能彻底破坏它。内毒素带有负电荷，常以聚合 物的状态存在而难溶于水，分子量几十万至上百万 3 0 道尔顿。C a 2 + 、M 簖+ 可以增强内毒素的稳定性。 生物制品生
6、产中的每一个环节都有可能污染内 毒素使制品不合格，不仅给生产企业造成很大的经 济损失，也会直接影响该企业的信誉和形象。因而 可以说，能否将生物制品的内毒素控制在国家标准 要求的范围之内，反映了一个企业的技术实力和对 社会负责的态度。 二、国家对生物制品中内毒素的控制要求 中国药典( 2 0 0 5 年版) 三部中收录的大部分病 毒类疫苗，如乙脑灭活疫苗、狂犬病疫苗、出血热疫 苗等内毒素控制标准是不高于1 0 0 E U 剂量，而重组 类制品如酵母乙肝疫苗、C H O 乙肝疫苗、干扰素 a 2 a 、a 2 b 等内毒素要求是低于1 0 E U 剂量。随着国 家药监部门对生物制品质量的要求不断提
7、高，对内 毒素的要求也越来越高。如对流感疫苗的内毒素控 制标准从1 0 0 E U 剂量提高到5 0 E U 剂量。另外，对 一些活疫苗，如乙脑减毒活疫苗、麻疹减毒活疫苗等 也提出了内毒素的控制要求。因而，从事生物制品 生产的人员必须了解国家对各项生物制品的内毒素 控制要求，采取有效措施，控制制品内毒素含量，保 证接种者安全。 三、生物制品中内毒素的来源 1 菌毒种：细菌类制品或以某些细菌如大肠杆 菌作为表达系统的重组制品，因其大多为胞内表达， 在破碎菌体时其细胞内的脂多糖被释放出来。但 C H O 细胞在建立种子细胞库时已进行了内毒素检 测，证明无内毒素污染。 2 生产环境：G M P 要求
8、生物制品生产须在符合 其要求的洁净厂房内生产，如细胞培养和半成品配 制及分装应在1 0 0 级洁净区进行，纯化应在十万级 洁净区进行。如达不到以上洁净度要求，则容易污 染内毒素。 3 不规范操作：操作人员更衣、洗手、消毒及无 菌操作不规范都可能造成内毒素污染。 4 设备及器械：生产使用的所有接触制品的设 备、容器、管道、滤膜、介质等未按正确的方法除热 原。 5 原辅材料：生产中直接与制品接触的注射用 水、各种化剂、添加剂、保护剂等其本身含有内毒素， 这是生物制品内毒素污染的最主要原因。 四、细菌内毒素的检测 细菌内毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化 由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中
9、 细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。细菌 内毒素检查法包括两种方法，即凝胶法和光度测定 法，后者包括浊度法和显色基质法，并可精确定量。 检测时可用其中任一种方法，当测定结果有争议时， 除另有规定外，以凝胶法结果为准。细菌内毒素的 量用内毒素单位( E U ) 表示【1 。鲎试剂法具有简便、 迅速、定量准确、灵敏度高等优点，现已广泛应用于 药品、生物制品的热原检定。内毒素检测时应特别 注意，实验器材如吸管、加样头、试管等是否处理彻 底对结果影响很大。如果处理不彻底，顽固的内毒 素可能还会残留在实验器材上，结果会出现假阳性 或测定值不准，或实验重复性不好等。试管等不能 刷洗，最好用三效热原灭
10、活剂配制的溶液放在超声 波洗涤机里对玻璃用具进行开机清洗l O 分钟，然后 先用清水清洗数遍，再用大量流动无热原注射用手 冲洗数遍，最后放入烤箱，在2 5 0 。C 的烘烤2 小时以 上。 五、生产过程中内毒素污染的控制 对于生物制品生产中内毒素污染的控制最主要 的措施是生产过程控制，即严格按G M P 要求进行生 产，严格无菌操作，防止内毒素产生。 1 生产车间：必须是符合G M P 要求的洁净厂 房，严格按规定进行清洁消毒，洁净区每天进行小清 消，百级和万级至少每周进行一次大清消( 包括顶棚 和墙面的彻底清消) ，十万级至少每月进行一次大清 消。并定期对洁净间进行沉降菌、擦拭菌和尘埃粒 数
11、检测，合格后方可使用。各种不同的操作在不同 的洁净区内进行，例如发酵和粗纯应在十万级区进 行，精纯在万级区域内进行，细胞培养、除菌、分装等 须在百级区进行。 2 设备用具：细菌内毒素很容易吸附在容器上， 生产中任何直接接触制品的设备、容器、生产用具、 管路、包括检测取样吸管、试管等必须保证无热原。 耐热器具如玻璃、不锈钢等应进行干热灭菌，1 8 0 4 h 或2 5 0 。C2 h 于烤除去热原。不耐高温用具，如胶 塞、胶管等，可采用0 2 M 氢氧化钠或盐酸浸泡4 h 以 上，急用时可在酸或碱中煮沸3 0 m i n ，然后用新鲜注 射用水冲洗至中性，再高压灭菌。对培养罐、泵、管 道、阀门、
12、滤器、层析柱等应进行原位清消，即用酸或 碱浸泡后再用新鲜注射用水冲洗至中性。 3 原辅材料：保证注射用水新鲜无热原。化学 原材料应尽量选购无热原的，如不能保证无热原，应 将试剂按配制量称量后放在容器内进行干热灭菌后 加入无热原注射用水配制液体，再进行蒸汽灭菌后 使用。生物制品常用的化剂如N a C l 、K B r 、( N r t , ) ：S 0 4 等均可干热灭菌。 4 无菌操作：无菌操作的关键是操作者必须严 格按S O P 更衣、洗手、消毒。对于任何非封闭系统的 操作，均应采取无菌操作方式。如离心、层析进出样 及超滤操作时应注意对容器口的保护，不可裸手接 触管道，操作时最好戴无菌手套并
13、随时消毒双手和 工作区域。每步纯化收集的样品应立即冷藏，不可 在室温放置过久。 六、细菌内毒素的去除 在生物制品生产中纯化采用的层析技术本身就 具有去除内毒素的作用。即使在生产中采取了有效 的工艺和严格的预防措施，但原液的内毒素仍有可 能超标。由于原液中通常已加入保护剂，重新纯化 非常困难。可考虑采用以下方法去除。 1 疏水层析：内毒素的脂肪A 部份有很强的疏 水性，在高盐下会凝集，无法吸附在疏水介质上，而 目标蛋白可吸附在疏水介质上，因而可利用疏水层 3 l 析去除内毒素。 2 离子交换层析：离子交换法层析通过带电的 溶质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换而 达到分离纯化的方法。由于内毒
14、素带负电荷，可与 阴离子交换介质QS e p h a r o s e F a s t F l o w 或D E A ES e p h a 1 0 s eF a s tF l o w 结合。我们采用以上两种介质进行去 除H B s A g 中内毒素试验，将被内毒素污染的H B s A g 上柱，H B s A g 和大部分内毒素结合于介质上，先用缓 冲液洗掉不结合的内毒素，然后用低盐溶液洗脱 H B s A g ，最后用高盐溶液将内毒素清洗掉，也可直接 用氢氧化钠洗脱内毒素，同时起到再生介质作用。 我们的试验结果表明QS e p h a r o s e F a s t F l o w 的效果优
15、于D E A ES e p h a r o s e F a s t F l o w ，前者可使样品中内毒素 降到1 E U m l 以下。 3 亲合层析：亲和层析技术特别是免疫吸附剂 在生产中的运用使得生物大分子的纯化变得简单。 免疫吸附的原理基于抗原、抗体的特异性作用，以目 标蛋白作为抗原，将通过杂交瘤技术生产的单克隆 抗体偶联于介质上，以此介质来吸附目标蛋白。由 于相互作用的高度特异性，理论上仅有目标蛋白吸 附于介质上，内毒素全部穿透，洗脱后将得到纯度很 高的无热原产品。但实际上，由于介质本身存在非 特异性吸附，仍有少量的杂蛋白和内毒素同时被吸 附。 4 凝胶层析：凝胶层析又称分子筛层析，
16、其原理 是根据待分离样品分子大小进行分离的一种方法。 3 2 内毒素分子量较大为几十万至上百万道尔顿，且常 为多聚体并易与蛋白样品结合为一体，因此可利用 分子筛层析去除内毒素。但其处理量小，处理时间 较长。 5 超滤：如果原液及保护剂的分子量与内毒素 分子量差别较大，可通过超滤来去除内毒素。但我 们发现内毒素一般易与蛋白结合或其本身容易聚合 形成大分子，其分子量与目标蛋白差别不大，超滤去 除效果不好。 6 活性炭：活性炭具有很大的比表面积，因而具 有很强的吸附能力，其主要通过疏水作用吸附内毒 素 2 J ，但活性碳对物质的吸附是非特异性的，在吸附 内毒素的同时也吸附了目标蛋白，蛋白损失在1 0 2 0 。一般不推荐，如确需使用，应选用药用级大 孔隙的木质活性炭，它们用于吸附较大的分子，清洗 干净后干烤备用。活性炭加量不超过1 0 ，放4 摇动作用不超过1 2 小时。 内毒素对生物制品的危害虽然很严重，但只要 我们了解了内毒素的特性就可以采取适合自己的有 效方法加以控制和去除。 参考文献 1 国家药典委员会编中华人民共和国药典( 三部) 北京：化学 工业出版社，2 0 0 5 ：附录X I I E ，附录7 8 8 1 2 秦峰，刘学良，魏桂林，等生物医药制剂中内毒素去除研究进 展药物生物技术，2 0 0 3 ，1 0 ( 1 ) ：5 3 5 6