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1、LOGO 测序常见问题分析测序常见问题分析 主讲人主讲人主讲人主讲人: : 张隽辉张隽辉张隽辉张隽辉 1. 序列结构对测序的影响序列结构对测序的影响 图例：图例：poly结构结构 原因原因: 主要原因是在polyT结构后,测序酶容易在模板上 滑动，导致随后的峰型变乱 或者移码 解决办法解决办法: 此类样品通过对其反向互补序列进行测序，通过 拼接可以得到模板全长序列. 图例：重复结构图例：重复结构 原因原因: 重复结构会导致测序复制框的滑移，另外测序试剂采用 了I, U 代替G, T, 与模板结合能力较弱, 测序酶很难延伸, 信号会迅速衰减或峰谱很乱 解决办法：解决办法： 使用反向引物对模板进行
2、测序，测到重复序列反向互 补位置时，即可完成模板全长的拼接,一般测AC重复 序列比GT要容易一些 图例：回文结构图例：回文结构 位点位点94至至137碱基前后互补碱基前后互补, 形成回文结构，该结构导致 后面的信号衰减，出现错误的判读。 形成回文结构，该结构导致 后面的信号衰减，出现错误的判读。 图例图例: 特殊结构特殊结构 现象现象: 信号在信号在73bp（信号峰图（信号峰图2700处）突然中断， 测序 处）突然中断， 测序PCR反应终止反应终止 原因原因: 变性后的单链在该处很可能互补或在全序列中有大的 特殊结构，造成严重的二级结构，使dNTP 和 ddNTP不 能和模板结合, 测序酶无法
3、正常延伸 解决方法解决方法: 酶切,做亚克隆测序 2.测序常见图谱分析测序常见图谱分析 图例图例:双克隆双克隆1 现象现象: T载体序列峰图正常载体序列峰图正常, 连接位置处出现套峰连接位置处出现套峰 原因原因: 1.有插入片段的载体和空载体同时存在 2.PCR产物用T载体进行连接时,其片段能以正反两个方向 插入T载体 解决办法： 重新挑取单克隆 1.有插入片段的载体和空载体同时存在 2.PCR产物用T载体进行连接时,其片段能以正反两个方向 插入T载体 解决办法： 重新挑取单克隆 备注备注: 重新进行PCR反应或者酶切鉴定仅能证明该克隆含有插入片段， 并不足以证明模板的单一 图例图例:双克隆双
4、克隆2 现象现象: 载体序列及插入片段前半部分峰图单一载体序列及插入片段前半部分峰图单一,套峰出现在插入片段中间套峰出现在插入片段中间 原因原因: 1. pcr产物不纯,且产物的引物结合区以及峰图单一的序列 都一样 2. 部分模板碱基发生突变,双峰出现的位点是由碱基突变 的位置决定的,有时会一端正常一端双峰(插入片断超过一 个反应测序长度(800900bp), 或者两个反应都双峰 解决方法解决方法: 重新挑单克隆 图例图例:非特异扩增非特异扩增 现象现象: 峰图起始即双峰峰图起始即双峰 ? 原因及解决方法: ? 1. 对于质粒样品, 引物在序列上有两个结合位点(载体上 和插入片段上),换一个引
5、物测序 ? 2.对于PCR产物,有两个模板,且两个模板都能和引物结合 扩增, 换引物或克隆测序 图例图例:等位基因双模板等位基因双模板 现象现象:序列的序列的80bp到到120bp之间有两套峰存在，没有发生移码突变之间有两套峰存在，没有发生移码突变 解决方法解决方法: 采取克隆的方法将两套模板分开，分别进行测序 图例：碱基缺失图例：碱基缺失 碱基缺失常见在碱基缺失常见在PCR产物中，特别是从基因组中扩增得到的产物中，特别是从基因组中扩增得到的PCR片段， 上图的 片段， 上图的186位缺失两个连续的位缺失两个连续的T。 解决方法：解决方法： 1)使用反向引物继续测序，以矫正缺失位点并达到测通的
6、目 的。或者将该PCR产物克隆到质粒中，挑取单克隆测序。 2) 如果可以确定该PCR片段中不应该有缺失的位点，那么可 以改变PCR反应条件，重新扩增。 图例图例:PCR产物有小片段产物有小片段 在197bp前表现为明显的套峰，且在197bp位置有一个高高的A 峰，这个A峰是测序进行到片段最后一个碱基的标志, 推断出产物 中有一个大小约为220bp左右的片段。 解决方法：解决方法：对PCR产物切胶纯化，再进行测序。 图例图例: 引物不纯引物不纯 现象现象: 杂峰非常有规律杂峰非常有规律,每个主峰下的小峰都是后一个碱基的主峰每个主峰下的小峰都是后一个碱基的主峰 原因原因: 部分引物比正常的引物在5
7、端少一个碱基, 导致移码双峰 解决方法：解决方法： 重新合成引物，或者将引物进行PAGE纯化后再进行测 序。 图例：染料峰 不合格图例：染料峰 不合格 图例：染料峰 可认为合格图例：染料峰 可认为合格 图例：残留盐分过高图例：残留盐分过高 Raw data峰峰 图例：残留盐分过高图例：残留盐分过高 sequencing峰峰 现象现象:Raw date峰基线漂移峰基线漂移, sequencing峰前面干扰 严重 峰前面干扰 严重, 后面正常后面正常 ? 原因: 产物中残余的盐离子浓度过高影响毛细管电渗 ? 解决方法: 优化PCR条件,降低buffer使用浓度 图例：无反应图例：无反应sequen
8、cing峰峰 图例：无反应图例：无反应Raw data峰峰 ? 无反应可能原因: ? 1. 模板浓度过低 ? 2. 引物结合温度比测序反应的退火温度低 ? 3.没有引物结合位点 ? 4.产物中含有抑制测序酶活性的物质 3.送样注意事项送样注意事项 送样要求（测序样品及引物）送样要求（测序样品及引物） 模板参考量模板参考量 送样注意事项送样注意事项 我公司提供Amp，Kan，Cm，Tc四种抗生 素和LB、2YT两种培养基以及37培养温 度，其它抗生素类型请随同样品一起备齐， 并标明工作浓度；其它培养基请自备，特殊 培养条件请注明！ ?样品名命名规则：样品名命名规则： 由于有些符号系统不识别，会影响测序结果的发送 成，建议您用字母、数字和“-”组成，系统会自动将特 殊字符（,/,:,*,?,|）等转换成“_”，请注意！ ?E-MAIL： 为使测序结果顺利发送到您的邮箱, 建议采用容量大的 163或126信箱，邮箱地址请用大写字母填写, 同时注 意区分数字0和字母O、数字1和字母I、数字2和字母 Z、横杠和下划线等易混淆的字体，字迹清楚! 谢谢大家谢谢大家!