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1、HPLCHPLC及及及及HPLC/MSHPLC/MS分析方法的开发分析方法的开发分析方法的开发 分析方法的开发 及其在药物分析中的应用及其在药物分析中的应用及其在药物分析中的应用及其在药物分析中的应用 李晓东 中国食品药品检定研究院 北京 李晓东 中国食品药品检定研究院 北京 100050 E-mail: 2 基于分离分析科学技术 小颗粒填料的色谱柱 以光谱、质谱技术作为检测手段 专属性、分离效率及灵敏度 适用于广泛的色谱应用 适用于开发新方法 适用于现有方法的改进 HPLCHPLC及及及及HPLC/MSHPLC/MS法法法法 3 质量源于设计（Quality by Design，QbD）准则
2、 实验设计方法学 （Design of Experiment，DoE） 方法验证（Method Validation）：确保方法在样品 分析的一定范围内中准确、重现、可靠、耐用性。 分析方法学的开发及验证分析方法学的开发及验证分析方法学的开发及验证分析方法学的开发及验证 4 方法开发 实验室获得方法及运用过程 方法验证 方法确认 方法转移 准确度，精密度，专属性，检测限， 定量限，线性，范围，耐用性 分析条件的筛选（色谱柱,流动相,pH等） 及优化（梯度、柱温、流速等） 法定检验方法在使用环境中适用性评 估（人员、仪器、样品、试剂） 非法定检验方法在实验室之间传递的 文件化过程 准确度，精密度
3、，专属性，检测限， 定量限，线性，范围，耐用性 分析条件的筛选（色谱柱,流动相,pH等） 及优化（梯度、柱温、流速等） 法定检验方法在使用环境中适用性评 估（人员、仪器、样品、试剂） 非法定检验方法在实验室之间传递的 文件化过程 5 实验室获得方法及运用过程 方法验证 方法确认 - 用一个性质明确的物质来挑战建立的分析方法用一个性质明确的物质来挑战建立的分析方法 - 用一个确定方法来挑战现实的分析环境用一个确定方法来挑战现实的分析环境 - 专属性，准确度，精密度，专属性，准确度，精密度，LOD，LOQ - 一般不需要进行线性，范围，耐用性实验一般不需要进行线性，范围，耐用性实验 6 ICH、U
4、SP、ChP II Appendix XIX A 方法验证的内容 准确度（Accuracy） 精密度（Precision）- 准确度（Accuracy） 精密度（Precision）-重复性，重现性，中检精密度重复性，重现性，中检精密度 专属性（Specificity） 检测限（LOD） 定量限（LOQ） 线性（Linearity） 范围（Range） 耐用性（Robustness） 专属性（Specificity） 检测限（LOD） 定量限（LOQ） 线性（Linearity） 范围（Range） 耐用性（Robustness） 7 方法验证-系统适用性 系统适用性试验的内容 在分析未知样品
5、之前或期间，检查系统以保证系 统之性能达到规定的要求 塔板数，拖尾因子，分离度 确定重现性（%RSD） 系统适用性“样品” 主组份与预期副产物之混合物 系统适用性试验是色谱方法的一部分 8 方法验证-系统适用性 容量因子 k 2 精密度/进样重复性 RSD 1%, n 5 分离度 Rs 2 (主峰与最近洗脱 的色谱峰之间) 拖尾因子 T 2 理论塔板数 通常 N 2000 9 方法验证- USP 类型1 主组份或活性成份定量分析方法 类型2 杂质或降解化合物测定方法 类型3 性能特点之确定分析方法 如溶出度实验 类型4 鉴别试验 10 方法验证- USP 验证的内容 类型 验证的内容 类型1
6、定量 限度试验 定量 限度试验 类型类型3 类型类型4 鉴别试验鉴别试验 准确度+*- 精密度+-+- 专属性+*+ 检测限-+*- 定量限-+-*- 线性+-*- 范围+*- 类型类型2 * 可能需要，具体与特定试验的性质有关。 11 如何进行方法验证 分析实验阶段 按照规定的实验计划或步骤 通常需要3 到 5天 在不同操作条件下，进不同浓度的试样 原料及制剂皆需分析 数据分析阶段 对分析结果进行统计学计算 色谱结果是相对的 用统计学分析的方法，可以客观地评估最终结果的真 实变化 12 方法验证步骤 线性线性 Day 1-3 定量限定量限检测限检测限 实验参数实验参数 2 Min 2). 与
7、残余硅醇基间的离子交换作用与残余硅醇基间的离子交换作用 O-Si O-Si O- O-Si O-Si O- O-Si O- O-Si O-Si O-Si O- O-Si O-Si O-Si O-Si OH O-Si O-Si OH O-Si OH O-Si O-Si O-Si OH O-Si O-Si (CH3)2HN + (CH3) 2 HN + 当流动相pH值小 于3时, 硅醇基趋 于中性(未解离) Base Base 对碱性化合 物的保留及 严重拖尾 对碱性化合 物的保留及 严重拖尾 两实验使用相同的传统两实验使用相同的传统C8硅胶柱硅胶柱 离子交换作用离子交换作用 当流动相为 pH6-
8、 8时, 硅醇基带负 电性(大部解离) 碱性分析物在硅胶柱上的拖尾机理碱性分析物在硅胶柱上的拖尾机理 26 固定相 低pH可能导致分离度降低或根本不能分离！ AU 0.00 0.02 0.04 Minutes 0.002.004.006.008.0010.00 AU 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 Minutes 0.001.002.003.004.005.006.007.008.00 pH 7.0 pH 2.0 阿密曲替林 去甲阿米替林 27 固定相 未浸润的孔浸润的孔 注意：保留时间与填料表面积与配体有关。然而，如果硅胶表面未湿 润，那么有效的色谱表面积会减少95%，因此
9、，降低被分析物的 保留时间即等于“丧失浸润”，记住：几乎所有的表面积都在孔 内！ 几乎所有的表面积都在孔 内！ 低有机溶剂或纯 水溶液流动相 C18 硅胶硅胶 28 固定相 Minutes 0246810 流动相：流动相：0.1% 醋酸水溶液醋酸水溶液 阿莫西林阿莫西林 Vo：被分析物没有保留：被分析物没有保留 起始：填料完全浸润 起始：填料完全浸润 “Wetted” 停止流速后： 填料完全脱离浸润状态 停止流速后： 填料完全脱离浸润状态 “De-Wetted” 丧失浸润现象： 丧失浸润现象： 100%水溶液中保留完全丧失水溶液中保留完全丧失 29 流动相 甲醇 质子化溶剂 氢键供给者 洗脱能
10、力较乙腈弱 粘度较乙腈高 低紫外波长下有吸收 乙腈 非质子化溶剂 氢键接受者 洗脱能力较甲醇强 粘度较甲醇低 低紫外波长下透光性好 30 流动相 Jenkins, Diehl RP18 Low pH (pH 3) 100% MeOH 100% ACN 1:1 ACN:MeOH 1 2 4 3 5 6 2 8 7 9 6 10 12 11 8 9 10 11 10,11 12 12 8,9 1 6 7 2 3 4 43 1 5,7 5 1. Gentisic acid (A) 2. Caffeine (WB) 3. Ritodrine (B) 4. Hydroguinidine (B) 5. 1
11、-Pyrenesulfonic acid (A) 6. Imipramine (B) 7. Amitriptyline (B) 8. Flavone (N) 9. 4-Dimethylamino-benzophenone (WB) 10. Diclofenac (WA) 11. Dioseb (A) 12. Octanophenone (N) 31 流动相pH值 影响带有可离子化官能团的分析物 胺 羧基 酚 有些化合物含有一个以上的可离子化官能团 改变流动相pH将使选择性发生极大改变 32 流动相pH值 酸性和碱性化合物在其未电离状态下时反相保留最大 中性化合物的保留不受 酸性和碱性化合物在其
12、未电离状态下时反相保留最大 中性化合物的保留不受pH影响影响 Silica pH Range Hybrid Particle pH Range Neue et. al. American Laboratory 1999 (22) 36-39. pH 0 5 10 15 20 25 30 35 40 024681012 Retention Factor (k) 酸性 碱性 中性化合物 碱性保留增强碱性保留增强 B 酸性保留增强酸性保留增强 HA 33 固定相、溶剂和流动相pH的影响因素 I A P Fl Fe D O Fluoro-Phenyl pH 3, MeOH P C18 pH 3, AC
13、N I A P Fl Fe D O I A Fl Fe D O C18 pH 10, ACN Phenyl-Hexyl pH 10, MeOH I A P Fl Fe D O Test Probes: I: Imipramine B A: Amitriptyline B Fl: Flavone N O: Octanophenone N 碱性及中性化合物碱性及中性化合物 34 固定相、溶剂和流动相pH的影响因素 I A P Fl Fe D O Fluoro-Phenyl pH 3, MeOH P C18 pH 3, ACN I A P Fl Fe D O I A Fl Fe D O C18 pH
14、 10, ACN Phenyl-Hexyl pH 10, MeOH I A P Fl Fe D O Test Probes: P: 1-pyrenesulfonic acid A Fe: fenoprofen A D: diclofenac A 酸性化合物酸性化合物 35 固定相、溶剂和流动相pH的影响因素 分析物在其未电离中性状态时保留较强 甲醇的洗脱能力较乙腈弱，因此所有化合物的保留都会得到 增强，同时也具有不同于乙腈的选择性 当流动相pH值能改变分析物的带电状态时，能得到选择性的 极大改变 在任一条件下，使用不同固定相时，能获得大的选择性改变 最显著的选择性差异在于将固定相、溶剂和流动相
15、pH因素综 合时 36 梯度洗脱 优点 单位时间的分离能力增加较大的峰容量 检测灵敏度提高 缺点 仪器设备要求高 不适合某些检测方式 色谱柱需再生 定量分析的重复性较低 37 梯度洗脱 高压梯度及低压梯度 溶剂 A 溶剂 B 泵 A 泵 B 混合器 A 高压梯度 溶剂 A 泵 溶剂 B 比例阀（溶剂混合点） 混合器 B 低压梯度 （溶剂混合点） 38 梯度洗脱滞后体积 死体积/谱带展宽体积 (无色谱柱时) 滞后(系统)体积 滞后(系统)体积 溶剂输送 系统(泵) 检测器进样器 色谱柱色谱柱 梯度混合器 溶剂输送 系统(泵) 高压梯度 注意滞后体积包括进样器、阻尼 器、混合器及其管路！ 注意滞后
16、体积包括进样器、阻尼 器、混合器及其管路！ 比例阀 检测器进样器 A B C D 色谱柱色谱柱 溶剂输送 系统(泵) 低压梯度 阻尼器 混合器 39 滞后体积太大会引起梯度变化的延迟 例如：滞后体积为 2.0ml，流速1.0ml/min时梯度晚2分 钟 如流速为0.1ml/min，实际梯度晚20分钟 滞后体积的不同会使方法转换麻烦 滞后体积比文献值大或小都使方法不能重现 普通HPLC的滞后体积为24ml 对分析型HPLC没有影响 对作微柱实验用梯度时影响较大 梯度洗脱滞后体积 40 液相色谱的分离机理 从色谱方法上分 正相 / 反相 离子交换 分子体积排除 亲合 疏水回受 从柱子类型上分 分配 / 吸附 离子交换 凝胶 亲合