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1、生物大分子分离纯化 原理与技术,内容提要,1、层析原理与技术 2、凝胶过滤层析 3、UNOsphere离子交换分离技术 4、CHT陶瓷羟基磷灰石分离技术 5、疏水相互作用与亲和层析,Life is based on proteins and their interactions,层析原理与操作,层析的起源和原理,起源-1906年，俄国植物学家Tsweet 原理-利用物质分配系数不同达到分离 目的,原理与操作,Chromatography,层析,色谱,什么是生物层析,根据生物分子物理化学特性的不同而达到分离 极性：polarity (solubility, volatility) HIC, RP
2、 离子特性：ionic characteristics (charge) IEX 大小与形状：size/mass (diffusion, sedimentation) GF 结构特征与活性位点：shape (ligand binding, affinity) AC 这些特性的区别使不同蛋白质分子在层析的固定相和流动相的分配不同而达到分离,原理与操作,Gel Filtration 凝胶过滤,Ion Exchange 离子交换,Hydrophobic Interaction 疏水层析 反相,Affinity 亲和层析,CHT 羟基磷灰石,原理与操作,最广泛的蛋白质分离纯化方法 条件温和 维持蛋白质
3、空间结构与活性 基于蛋白质对固定相的不同保留达到分离 蛋白质溶于流动相中，经过装填固定相的柱子分离,层析原理与操作,层析的5个操作步骤,装柱并平衡 上样 平衡 洗脱 再生,上样,装填有层析介质的层析柱,分离,分离组分流出,原理与操作,层析图,原理与操作,第一峰, 外水体积, Vo, 不与柱中填料相互作用直接从柱中流出。这是样品中的未结合物质,Vo,Ve,Vt,蛋白质含量 (A280), 由UV检测器读出，y轴,基线,洗脱峰，有些可以很好的分离，有些分得不是很好，有部分交叉,有时这里也显示梯度浓度等检测值,时间或体积，x轴,纯化平台的硬件结构 层析工作站 层析介质和层析柱,原理与操作,层析系统,
4、DuoFlow中高压层析系统,LP低压层析系统,Profinia全自动亲和层析系统,手动层析组件,DuoFlow中高压层析系统,主要特点： 3500psi高压力下梯度模式最大流速可达20ml/min 连续波长，4波长同步检测 方形X、Y轴组分收集器 软件直观容易使用,BioLogic LP 低压层析系统,LP Data View 软件,BioLogic LP 系统,BioFrac 方形组分收集器,主要特点： 流速精确，0.01ml/min 检测灵敏度更高, 0.001AU 兼容方形收集器,Profinia 蛋白质纯化系统,主要特点： 全自动亲和纯化，包括亲和标签、亲和无标签，抗体等纯化 双紫外
5、检测器设计 纯化与脱盐串联一步完成 结果直接报告目标蛋白的浓度和得率,为什么在层析技术中要使用层析仪,介质的要求 实验的精密度和重现性要求 时间的要求,纯化平台的硬件结构,层析介质与层析柱，原理与技术,层析介质,离子交换层析介质 Unosphere Q，S MacroPrep High Q,High S,DEAE,CM 亲和层析 Profinity IMAC金属螯合介质 Profinity Epoxide环氧亲和介质 Affi-Gel Protein A, Affi-Prep Protein A Affi-Gel蓝胶，DEAE蓝胶，CM蓝胶 Affi-Prep多粘菌素介质 Affi-Gel硼胶
6、 Affi-Gel配体固定化活化介质,凝胶过滤层析介质 Bio-Gel P系列 Bio-Beads S-X介质 羟基磷灰石介质（CHT） 氟代羟基磷灰石介质（CFT） 疏水层析介质 Macro-Prep Methyl HIC Macro-Prep t-Butyl HIC Bio-Beads SM-2吸附剂,层析柱,分析柱 离子交换分析柱：Uno Q, S Aminex分析柱分析单糖、寡糖、有机酸、有机碱，以及肽和核酸有机小分子 羟基磷灰石分析柱：Bio-Scale CHT-I 凝胶过滤分析柱：Bio-Sil, Bio-Silect HPLC 分析柱 反相层析分析柱：Hi-Pore RP304,
7、 Hi-Pore RP318,各种层析介质的Cartridges用于条件摸索 UNOsphere MacroPrep CHT HIC,层析介质结构原理,Unosphere MacroPrep,离子交换层析 Q，S，DEAE，CM,疏水层析 -CH3, t-Butyl,亲和层析 Protein A IDANi 多粘菌素,凝胶过滤 CHT和CFT,Unosphere Q, S MacroPrep High Q, S MacroPrep DEAE, CM,MacroPrep Methyl HIC MacroPrep t-Butyl HIC,Profinity IMAC Profinity Epoxi
8、de Affi-Gel Protein A, Affi-Prep Protein A Affi-Gel, DEAE, CM Affi-Prep Polymixin Affi-Gel硼胶 Affi-Gel配体固定化活化,层析介质及其技术,凝胶过滤层析 离子交换层析 羟基磷灰石层析 疏水层析 亲和层析,1. Spherical particles packed into a column,2. Sample applied,3.Buffer mobile phase and sample move through column, molecules diffuse in and out of ma
9、trix,4. large molecules leave the column first followed by smaller molecules in order of size, molecules larger than the matrix pores pass straight through.,凝胶过滤,凝胶过滤层析,分离纯化原理,A good gel for gel filtration contains about 95% water,凝胶结构,Steric exclusion leads to early elution,按照分子量大小洗脱 大分子首先洗脱，最小的分子在
10、最后面洗脱,100 1,000 10,000 100,000 Bio-Gel P2 Bio-Gel P4 Bio-Gel P6 Bio-Gel P10 Bio-Gel P30 Bio-Gel P60 Bio-Gel P100,1,800,800,4,000,1,000,6,000，用于脱盐,1,500,20,000,2,500,40,000,3,000,60,000,5,000,100,000,100,凝胶过滤层析,凝胶的选择,Bio-Gel P4(800-4,000) for separation digested products from IgG,凝胶过滤层析,凝胶的选择,凝胶过滤层析,
11、Bio-Gel P6(1000-6000),凝胶的选择,凝胶过滤层析,Bio-Gel P10(1500-20,000),凝胶的选择,凝胶过滤层析,Bio-Scale Mini Bio-Gel P6脱盐预装柱,操作方便，可连接在DuoFlow、LP、Profinia和Econo泵上,Bio-Beads S-X介质 多孔的聚苯乙烯二乙烯微球体,Bio-Beads S-X1,Bio-Beads S-X3,600,Bio-Beads S-X8,1,000,Bio-Beads S-X12,400,高分辨率亲脂性分子排阻色谱,2,000,14,000,中草药和天然产物活性成分分离纯化 高分辨率，快速纯化酯
12、类、芳香族，多环、杂环化合物,介质可兼容苯、甲苯、二甲苯、四氯化碳、二甲基甲酰胺、酮、二氯甲烷、二氯代苯、全氯乙烯等有机溶剂,凝胶过滤层析,1、三硬脂酸甘油酯，891 2、三肉豆蔻酸甘油酯，729 3、三月桂酸甘油酯，645 4、三辛酸甘油酯，477 5、三己酸甘油酯，393 6、十六烷，226 7、十一烷，156,Bio-Beads S-X8分离效果,高分辨率亲脂性分子排阻色谱Bio-Beads S-X介质,凝胶过滤层析,柱长的选择 分离：30120cm 脱盐：30cm以下 洗脱液 离子强度,pH中性 流速，根据层析介质的说明，一般很低 样品容量：13CV,凝胶过滤层析,操作参数选择,增加分
13、辨率的方法,检测柱效 检测分离度 减少上样体积 降低流速 使用更小的介质颗粒的介质 连接2根层析柱,1.可分离相对分子量从几百到几十万的物质 具有3000个理论塔板的凝胶过滤可将分子量相差2倍的蛋白质完全分开,6000个理论塔板的可将分子量相差1.5倍的蛋白质完全分开;建议柱高在80-120cm,直径=H/30 2.脱盐,凝胶过滤层析,凝胶过滤层析的应用,凝胶过滤层析,凝胶过滤层析的特点：,层析柱规模很大，实验室1.0-2.530-100cm，工艺1020200cm，从而设备成本很高； 上样体积少，必须少于柱床体积的3才能达到较好的分离效果，如果大体积样品必须浓缩，从而造成样品的损失和增大工艺
14、的复杂性； 工艺时间（生产周期）长，甚至24小时或以上； 分辨率低； 不需摸索纯化条件，按照分子量区带分离,因此，往往用分子筛分离时只适用于纯化的最后一步去热原，或离子 交换上样前的脱盐,离子交换层析,离子交换层析类型及其选择,-O-CH2CH2-NH+,C2H5,C2H5,-N+(CH3)3,-O-CH2-C-O-,O,-SO3-,pI,stability range,stability range,与阳离子交换介质结合,+,-,denaturation,denaturation,pH,10,2,离子交换层析,离子交换层析原理蛋白质滴定曲线,蛋白质净电荷,与阴离子交换介质结合,Product
15、s: UNOsphere Q PCHT due to aggregate removal,Three Step Platform Purification, conditions,Elute protein A with 0.1M glycine, 0.05M NaCl, pH 2.5 (no citrate or EDTA). Raise pH to 3.8 by addition of 1M Tris pH 8.5, 4.9% v:v. Hold for viral inactivation (see reference) Raise pH to 7.0 by addition of 1M
16、 Tris pH 8.5, 2.3% v:v. This will yield a conductivity of 9mS. Equilibrate UNOsphere Q column to 0.07M Tris, 0.1M glycine, pH 7.0, flow-through mode Reduce pH to 6.5 by addition of 0.5M monobasic NaPO4 (pH 4.1), 1% v:v. Equilibrate CHT with 5mM NaPO4, pH 6.5 Load, wash, 20 CV linear gradient to 1.5M
17、 NaCl* Clean with 0.5M NaPO4 *screening conditions, increase to 10mM if IgG does not elute,3-Step Platform purification, summary,UNOsphere SUPrA,CHT,UNOsphere Q,4,1,2,3,1,2,3,4,5,2,4,5,0,S,HPSEC Bio-Silect SEC 400-5 50mM HEPES 0.5M NaCl 2M urea, pH 7,3 Step-Platform Purification, summary,Aggregate r
18、emoval by CHT More than 99% reduction by HPSEC Leached protein A removal by CHT 90% removal by Cygnus ELISA reduced from 55 to 5 ng/mL DNA removal by CHT 3 logs reduction by PCR reduced to 1ng/mL by picogreen Endotoxin removal by CHT Spiked with LPS from E.coli, Salmonella, and P. aeruginosa removed
19、 7 x 104 EU by LAL final concentration, IgG pool, 1EU/mL,基于生物分子表面疏水性不同而达到分离的技术 疏水作用来自于分子的水化结构，高浓度盐溶液破坏生物分子的水化结构，使蛋白质内部的疏水基团暴露于分子外表面，从而可与疏水介质结合 不同离子的疏水性 Anions: SO42- Cl- Br- NO3- ClO4- I- SCN- Cations: Mg2+ Li+ Na+ K+ NH4+ 蛋白质以高浓度盐溶液结合与疏水层析柱上，以低浓度盐溶液洗脱,原理,疏水层析,MacroPrep Methyl HIC MacroPrep t-Butyl
20、HIC,产品,疏水层析,生物分子表面大都有或强或弱的疏水区域，在不同环境下，与各种疏水介质产生不同强弱的结合 高离子强度可加强疏水性 跟离子交换相反，高盐吸附，低盐洗脱；洗脱样品又 可直接或稍加稀释后加上其他层析柱，作为连接层析 步骤的桥梁，取代盐析沉淀技术 比反相层析的配体密度低很多，无须有机溶剂洗脱， 保存生物活性 配体种类繁多，很难预测哪一种、哪一个条件最适合 ，可用疏水层析试盒选择介质,作用原理,溶质,曝露在外的疏水基,配基,水分子,大量水分子,DG = DH - T DS,为什么使用疏水层析?,离子交换技术、羟基磷灰石、凝胶过滤技术、亲和层析技术的补充 温和，非变性条件纯化 互补的选
21、择性 高收率 浓缩技术,操作参数选择,疏水层析,疏水介质选择：甲基，丁基，苯基疏水 疏水性强的蛋白质：甲基，丁基 疏水性弱的蛋白质：丁基，苯基 盐：硫酸铵，醋酸铵等等 缓冲体系和pH 洗脱梯度,Sample: GFP sample brought up to 2 M AS, filtered Load:5 ml Buffer: A:2 M (NH4)2SO4+ 0.1 M NaP, pH 7 B: 0.1 M NaP, pH 7 Flow Rate:3 ml/min (230 cm/hr),Macro-Prep 甲基疏水,苯基疏水,20% EtOH,疏水层析,Profinity IMAC纯化H
22、is-tagged Protein Chelex 100纯化DNA，PCR样品制备 Affi-Gel Protein A纯化单克隆抗体 Dye - Affi-Gel Blue (DEAE or CM) 纯化单抗，分离HSA Affi-Gel 肝素凝胶多种蛋白，如凝结因子、蛋白酶、核酸酶、脂酶 Affi-Gel Polymixin去除内毒素（热原） Affi-Gel 硼胶分离核苷酸、核苷、儿茶酚胺、糖类等小分子,亲和层析,产品与应用,Equilibration Sample application Binding and washing Desorption and elution,Equili
23、brate the column and the sample to binding conditions.,亲和层析,亲和层析,Equilibration Sample application Binding and washing Desorption and elution,Apply sample under binding conditions.,亲和层析,Equilibration Sample application Binding and washing Desorption and elution,Change the eluent to elute the target.,
24、Profinity IMAC Resins,固定化金属螯合层析：Immobilized Metal Affinity Chromatography （IMAC）,基于纯化重组组氨酸标记蛋白设计，专门纯化His-tagged Protein 螯合带电离子，如Zn2+,Ni2+,Cu2+, 现有的产品为螯合Ni2+的介质,UNOsphere 技术 更好的流动特性，在高流速下载量，目的蛋白得率和纯度不会受到影响。,IDA,各种流速下的载量和分辨率,高流速，高载量，高分辨率，低反压,Profinity IMAC Resins,高流速、低反压,不同 IMAC 介质纯化氨基肽酶(aminopeptidas
25、e)纯度比较,Profinity IMAC, IDA ligand,Profinity IMAC Resins,使用DuoFlow系统进行Profinity IMAC循环性能研究,Strip 50mM EDTA, 50mM sodium phosphate, 300mM NaCl(pH7.5) Clean 50mM sodium acetate, 300mM NaCl(pH4.0) Charge 100mM NiSO4(pH4.0) Clean 50mM sodium acetate, 300mM NaCl(pH4.0) Equilibrate 50mM sodium phosphate, 3
26、00mM NaCl(pH8.0) Sanitize 1.0N NaOH Sample E.coli. lysate containing 3.51mg of 75kD r-His-tagged protein,1mL Profinity IMAC柱 201次循环实验,Profinity IMAC Resins,Profinity IMAC Resins 纯化 6His-tagged protein,Sample：E.coli. lysate,96% 纯度,Profinity IMAC Resins,Thank you！,联系方式： 沈志扬 Email：zhiyang_shenbio- 电话：021-64260808-51 移动电话：13918947931,