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1、 ； 班 鬟 5 鼋 i 遭 国外 兽 医学一畜 禽 疾病 1 9 9 5年笫 1 8卷笫 4期 1 7 犬瘟热实验室诊断技术研究近况 j 综述 ( 表牧 太学军 事兽 医研究所 长春 1 3 0 0 6 2 ) A 摘 要 犬瘟 热是犬 的一 种最 古老 、 危 害 最 严 重 的传 染 病 之 一 。 本 文 根 据 现 有 文 献 资料 ， 简述 1近 年 来 该病 实验 室诊 断技 术 的研 究进展情况 。 犬瘟 热 ( C D) 是 由犬 瘟 热病 毒 ( C DV) 引起 的 犬科 、 鼬 科及 部 分 浣熊 科动物 的 一 种 急性 热性 传染病 。 本病 传染性 强 ， 死亡率
2、 高 ， 是 当前 宠 物饲 养 业和 经济 类动 物 养殖 业 的大敢 ， 危 害甚大 。 由于 CD病 型 复 杂 多样 ， 叉 常 易 与 其 它病 毒 以及 细苗等病原 发生混 合感染或 继 发感染 所以诊断非常困难 。根据 其流行特 点 ， 临 床症 状 和病理 变化仅 可做 出初步 诊 断 ， 确诊需进行实验室检查 。 传统 的实验室 检查 方法虽然很多 ， 但都有 一定局限性 。 病 毒分 离鉴定与 动物 接种试 验准 确、 可 靠 ， 是 确 定本病的重 要依据 ， 但操 作繁琐 ， 所 需时 问较 长 ； 中和 试 验特 异性 强 ， 敏 感性 高 ， 是 目前测 定动物 免
3、疫 力的 标准 方法 ， 但 太 费 君 8 7 a 8 时、 费事 、 费 人 力和 费物力 补体 结合 试 验 既可检查抗 原又可柱查抗体， 是确诊新近 感染 病 例 的 一种方 法 ， 但 由于 许多 犬 血清 中存 在 抗 补体 物 质而影 响试 验结 果 ； 包 涵 体检 查有 较 大 的特异性 ， 但对 急性 病例 检 出率 低 因此 只能作 为本病 的辅 助诊 断 ； 酶 联 免 疫 吸附 试验敏 感性 高 ， 但 由于 制 备捕 获 特异性 抗体 的抗原较 困难 ， 且 费用 昂贵 ， 实 际应用 中亦受限制 。为 建立一种 可靠 的 特 异性 诊断 方 法 ， 近 年来 国
4、内外 不 步学 者 都致 力 于 C D 诊 断技术 的 研 究 ， 并 取 得 了 引人注 目的成果 ， 本文简述如下 。 l 离子捕捉 电镜技术 取 肝 、 脾 、 粪 便等病 料 ， 用电镜 直接 观 察病 毒 粒子 是诊断 C D的 简便、 快速方 法 。 然而 ， 由于 C D 的特性 ( 生 长缓 慢 、 出 现细 胞病变所需的时问长) ， 使得细胞培养物或 临床样品中的病毒滴度甚低， 用常规电镜 方法往往得不 出理 想的结果 。离 子捕 捉 电 发 展 l W ； v d N A 5 33 5 38 2 w o l f 1 j A， 6 参考 文献 8 L Wa | t e r
5、s - LS c i e n c e 1 9 9 3 ， 7 M a l o n eR W -W i l l i a msP e t a l _Sc i e n c e ，l 9 9 0 2 4 71 4 6 5 一 l 4 6 8 3 we 1 1 s D J 8 L Go l d s p l n k，GFEBS Le t t 1 992 306t 20 3 2 O5 4 We 】 1 s ，D J FEBSLe t t 1 9 9 3 ，3 弛 1 7 9 1 8 2 5 Cu r i e 1 D TA a r wa h 1 S，W a g n , r E 8 L Co r r e n M
6、 P r o c Na t 】Ac a d S c i US A 1 9 9 1 88： 8 8 0 88 I Ma c kl e y， M G-Lo v e-D R-Da v i e s - K E-w a 1 s h。 FS M o r r i s，GE Di c k s o n GFEBS Le t t 1 9 9 2，2 9 6I 1 2 8 一 l 3 4 Du c k l e yM G ，W e 1 1 s ，D J ，W a l s h-F S Di c k s o nG H u la x M o l Ge n e t L 9 9 3 7 l 7 7 23 8 R, g o t
7、1 Vi n c e n t N Ch a e y-P e t a l N a t u r e 1 9 9 3-3 6 1：6 4 7 6 5 0 9 C u l v e r K W 一Ra a m Z -Wa l l b r i d g e ，S 一 1 h l i h ，Ol d fi e l dEh B | a e s eR M S c i e n c e，1 9 9 2 2 5 61 5 5 0一 l 5 5 2 1 0 Ka y M A ， Ro t h e n b e r g， s La n d e r C Ne t a1 Sc 化nc e，l9,q 3，26 2： 1l 7一 l
8、 lg 维普资讯 1 8 国外兽医学一曹禽疾病 1 9 9 5 年第 l 6卷第 4期 镜技术是近年 来才应用于病毒检测与鉴定 的一项新 技术 ， 具 有浓缩 与提纯 病毒 的作 用。常国权等 “ 用 此方 法检 测了临床上疑 似 为 C D 的 犬脾 脏 ， 结 果镜 下观 察到大 量 结构 清 晰 的 C DV 粒子 ， 而 直接 负染 的样 品， 虽 然有 时也 能观察 到 CD V粒 子 ， 但数 量甚 少 ， 病 毒 结 构模 糊 不清 ， 镜 下 很难 辨 认。 该法从制样 到镜 下观察 ， 整个过程 只需 2 3小时即能 测定 出结 果 ， 可 用于快速而 准确地检 测 细胞 培
9、养 、 生物 学产物 以及临 床样品 中的 C D V粒 子 。 2 血 清学诊断技术 2 1 荧光 抗体染色法 早在 1 9 5 6年 ， C o f f i n等人就 将荧光抗 体技术应用 于 CD V研 究 ， 解决 了 C D死后 快速诊断 以及病 毒在体 内分 布等问题 。近 年 ， 这 一技术又有不少改进 ， 应用范围亦逐 渐 扩大 。袁书 智等。 将该技 术应 用在 CD 生前与死后 诊断 、 CDV弱毒疫苗效价 监测 以及 抗 C DV抗 体 效 价 测 定 中， 并与 一些 公 认的方法 进行 比较 。结 果认为 ： ( 1 ) 用荧 光抗 体染 色 法 检查 外 周 血液
10、白细胞 中的 C DV 抗 原 ， 可 作 为 是 否感 染 的指 标 以 及 C D生前 临床特 异性 方法和 死后诊断方 法 之 一。( 2 ) 荧光抗体 染色法可用于 C DV疫 苗效 价 的测定 ， 其测 定抗体 效价 较微量 中 和试 验节 省 3 4天 时间 。 张汇东等 应用 荧光 抗体 染色 法对某犬群 流行 的 C D进行 了诊断 。结果 表 明， 结膜 刮片 、 脾 、 淋 巴结 、 肺 、 膀肮 颈 、 脑组 织以及外周血液涂片荧光 抗体 检查是诊断 CD的重要方法 。它 能对 隐性感染犬发病 早期和病 死犬 及时作 出确 诊 ， 这 对 CD 的防 疫 、 诊断 、 进
11、 出 口检疫 有 着极其 重要 的意 义 2 2琼脂扩散试验 琼脂扩散 试验是 免疫学 中一种常用的 诊断技术 ， 操作简便 。任文 陟等 应 用 C D 鸡胚成纤维细胞 弱毒疫苗 免疫绵羊制 备琼 脂 扩 散抗 体 ， CD病 貉肝脏 制 备琼脂 扩 散 抗原 ， 建立 了琼 指扩散试 验方法 ， 用于 CD 病 死动 物肝 、 脾 等脏器 中病 毒抗原 成 份 的 检 出 。初步 检测送检病料 1 o份 ， 井与 电镜 检查结果 比较， 阳性符合率为 8 5 7 ( 6 7 ) ， 阴性符 合率 为 7 5 ( 3 4 ) ， 总体 符合率 为 9 O ( 9 1 0 ) 。 2 3 S
12、P A协 同凝 集试验 S P A 协 同凝集试验 是一种 特异 、 快速 的血清学诊断 方法 。刘鼎新等 用此法检 测 2 8 9份 具 有 C D 症 状 可 疑犬 的新 鲜 粪 便 、 肠 内容 物或犬 高热期 的尿液 ， CD阳性 数为 1 0 9份 ( 占 3 7 7 ) 用琼脂 扩 散试验 检 测 2 9 6份 ， 阳性为 7 6份 ( 占 2 5 7 ) ； 用 二 种方 法同时检测 6 7倒 C D病 料 ， 结果符 合率为 9 5 5 2 。本试验 的二种 方法 只需 过夜 或 2 3小时便可确诊 。 利用粪 便或尿 液检验抗原 不受疫苗免疫接种的干扰， 显 示 出很大 的优
13、越性 。 2 4 免疫组织化学技术 用辣根过 氧化 物酶或碱性磷 酸酶 标记 抗体， 可用于检查病毒抗原的总体分布 P a l me r 等 “ 用此 技术 并与 包涵体 、 台胞 体 检查法 比较 ， 检测 了 3 3只非化脓性 脑炎犬 的脑组 织以诊断 c DV脑 炎 ， 其 中 7只犬 有 典 型 肉芽 肿性 脑膜脑 脊髓 炎变化 ， 但都 无 包涵体 、 合胞体和 C DV抗原。 另 2 6只犬 都 具有 典 型 C DV 脑 炎 的组 织病 理学 变化 ， 其中 2 4只检 出 包涵体 ， 4只 捡 出 台胞 体 ， 2 5只具 有 CDV 抗原 ， 只有 一 只犬 既无 包 涵体
14、、 合胞体 ， 也无 C DV抗原 。这表明 ， 检 查 合胞 体 对 CD V 脑 炎的 诊 断 价值 有 限 ， 包涵体检查是可靠依据， 而以免疫组化法 测 定 CD V 抗 原 对 确诊 C DV 感染 则更 有 价值且 操作简便 。Ga t h u mb i 用此 法检查 福尔马林固定 石蜡包埋切片的各种器官 内的抗原 分 布 ， 以便选用最 合适 的器 官用 作新 暴发 区 CD的诊 断 。证 实了 中枢神经 系统 ( C NS) 内的 小 脑 自质 、 脑 挢 、 整 个 脊 维普资讯 l 国外兽医学一畜禽疾病) 1 9 9 5年第 l 6 卷第 4期 l 9 髓 、 前额 灰 白
15、质 室 周 围、 丘 脑一 下丘 脑 医和 肺是诊断 的最 佳组织 。还证实了 免疫 组织 化学 技术 可作 为 C D致死动物 的快速 和可 靠 的诊断 方法 ， 尤 其对犬 的神 经性疾 病 包 括 狂犬 病 和 不 同类 型 的 C D， 特 别对 经 免 疫接 种过 的犬 ， 免疫 组织化 学 技术 更有 重 要价值 。 2 5 酶标 S P A染 色法 本法主要用 于检 查患 CD动 物血 清中 的 抗 体 ， 做 生 前 诊 断 用 刘 鼎 新 等 在 Vc VI g A抗体法 的启发下 ， 从 1 9 8 3年开 始 进行 酶 标 S P A 染 色 法对 C D 快 速诊 断
16、的研 究 ， 取得 如下结 果 ： ( 1 ) 本法 具有 特 异 性 强、 敏 感、 操作简 便 、 不 需要 昂 贵器 材 以 及样 品可长期保存等特 点 ， 易于现地 应用 。 ( 2 ) 本法所用 的特制细胞 抗原片有 3 O 一4 0 个 圆窝 ， 除 4 6个 圆窝 作阴 、 阳性对照 外 ， 每片可检样 8 1 8份 。 按试验需要 ， 还 可以 用以进行 C D抗体效 价滴定 。 3 分子 生物学诊断技术 3 1 核 酸杂交技术 核酸 杂交技术 用于疫病的诊断 已显示 了极大 的优越性 ， 它 不仅 能用于 特 定病 原 的鉴定 ， 而 且 还可检 测临 床或病 理 样 品中
17、的抗原 。 Mi t c h e l l 和 Ru s s e l l s 等 ( 1 9 8 7 ) 利用 D NA 探 针 和单 股 R NA 探 针检 测 了 犬 组 织器官中 C D V的基因组和信使 R NA， 获 得 了很 高 的灵敏 度 和特 异性 。Ts u k i y a ma 等。 利 用这 一 技术 进一步 搞清 了 C DV 蛋 白、 核酸 的 组成 ， 使 CD V 研 究由细胞 水平 进入 了分子水平 。 3 2 聚 合酶 链反应 用聚 合酶链 反应 检测病毒核酸 诊断病 毒感 染 以其敏感性 高 、 特 异性强 而 广 泛用 于实验室和 临床样品 中病 毒的检测
18、。李金 中等 根据 B a r r e t 报道 的 C DV 融 合蛋 白 的棱苷酸序列 ， 选择设计 了 6 个 引物 ， 引物 1 、 4 、 5为 上游 引 物 ， 引物 2 、 3 、 6为 下游 引 物 ， 拟 扩增 C DV融 合蛋 白基 因 的全 序列 。 以 从 C D 弱 毒 培 养 物 中 提 取 的 细 胞 总 RNA为转录 的模板 ， 分 别以引物 1 、 3 、 4和 Ol i g o ( d T) 为引物进行反 转录 。 将此反转 录 的产物 作 为聚合酶 链反应 的模 板 ， 分别 以 不同配对的引物进行聚合酶链反应 。 结果 ， 4种 引物 的反转录产物一次
19、聚合酶链 反应 均 扩增 出了引物 5 6之间 的序列 利用 引 物 4 6第 一次 聚合酶 链反 应阴性 的产物 作 为模 板 进行第二 次聚合酶 链 反应 ， 结 果 扩增出 了引物 1 6之间的 片段 矗 些聚 合 酶链反应产物经琼脂糖 电泳证实其大 小与 理论 值 相 符 。因 此 ， 此 方 法 可 作 为检 测 C D V 核酸 的方法， 该 片段 经标记后可 作 为 CB V 的 基因探 针用于诊 断和研 究 ， 其 表达 产物则 可作 为诊断抗原 。 综 上所 述 ， 尽 管这些 新 技术 已成功 地 应 用 于 CD的诊 断 ， 从 而 使 CD的诊 断 水 平进 入 了一个
20、新 的阶段 ， 但 实际 问题 还没 有彻底解决 。 可以预言 ， 随着 高新 技术 的不 断涌现与更 新 ， 今后将会有更多 的快 速 准 确 和简便的 C D诊断方 法问世 参考文献 1 常目权等， 内蒙古畜牧科学 ， 1 9 9 4 ， 2 ： 3 3 3 4 2裒书 智 等 ， 家 畜传 染病 防 恻 研 究 会 第 四 次 学 术研讨 会论 文摘 要集 ， 1 9 9 1 ， 3 l 9 3 2 0 3张汇 东 等 ， 中国 畜禽 传染 病 ， 1 9 9 3 ， 1 ； 1 6 4 任文 陟等， 全国第三届 小动物疾病 与第五届 养犬学学术研讨会论文集 ， 1 9 9 4 1 9
21、0 -1 9 3 5 刘鼎 新等 ， 中 国畜禽 传染 病 1 9 9 4 ， 4 t 3 8 4 0 6 Pa l me r DG e t a I R既Ve t S c i e n c e ，1 9 9 0 49： 1 77 1 87 7 Ga t hu mb i P K Ve t Re s Co mmu n，1 9 9 3 ，l 7 【 3 ) 1 9 7 2 0 1 8 刘鼎新等 家畜传染病 1 9 8 6 ， 1 ： 2 2 2 4 9 Ts u k l y a ma K e 【a 1 Vi r o l o g y，1 9 8 7，1 6 0： 4 8 54 l 0 李金中等， 科学 研究与开发 1 9 9 4 ， 4 ( 3 ) 2 9 30 维普资讯