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1、荧光原位杂交技术(FISH)在临床病理中的应用与质控,荧光原位杂交技术(FISH): 用带有荧光素标记的核酸探针与组织细胞中待测的核酸(DNA、RNA)按碱基配对的原则进行特异性结合，在荧光显微镜下显示细胞基因状态的方法。 FISH在临床病理中的应用 辅助病理诊断、判断预后、指导临床治疗,一、常用荧光素及滤光片类型,二、常用探针种类,单色探针(single color probe, SC) 双色探针(dual color probe, DC) 三色探针(triple color probe, TC) 双色分离探针(dual color, break apart probe. DC,BCR) 双
2、色单融合探针(dual color, single fusion. DC, SF Trans) 额外信号探针(extra signal. ES) 双色双融合探针 (dual color,dual fusion probe. DC,DF Trans),单色探针(SC),正常,异常,CEP8,双色探针(DC),正常,异常,HER2,CEP17,三色探针(TC),正常,异常,X,Y,CEP18,双色分离探针(DC,BCR),正常,异常,MYC,MYC,14,18,14,18,双色单融合探针(DC, SF Trans),正常,异常,ABL,ABL,9,22,9,22,BCR,BCR,额外信号探针(ES
3、),正常,异常,ABL,ABL,9,22,9,22,BCR,BCR,双色双融合探针( DC,DF Trans),正常,异常,IGH,IGH,14,18,14,18,BCL2,BCL2,三、FISH检测在常见肿瘤中的应用与意义,乳腺癌,探针: HER2/CSP17（双色探针） HER2基因检测意义： HER2基目扩增的患者预后差:无病生存和总生存期缩短，淋巴结转移几率高，复发凤险高。 指导内分泌冶疗：HER2基因扩增患者对内分泌治疗产生耐药。 指导合理选择辅助化疗方案：HER2基因扩增患者宜采用紫杉醇化疗和高强度的蒽环类药物方案。 筛选分子靶向药物的适用者：HER2基因扩增患者适合使用曲妥珠单抗
4、药物。,探针：TOP2A/CSP17（双色探针） TOP2A基因两种异常：扩增和缺失。 TOP2A基因检测的意义： 存在TOP2A基因异常的患者预后差，尤其是基因缺失的患者预后更差。 TOP2A基因异常患者对于含蒽环类药物的治疗方案更敏感。,非小细胞肺癌,探针：EGFR/CSP7（双色探针） EGFR基因异常：扩增和拷贝数增加。 EGFR基因检测的意义： 30%40%非小细胞肺癌存在EGFR基因异常. 筛选酪氨酸激酶抑制剂适用者：EGFR基因增多的患者，应用Iressa/Tarceva治疗的有效率为35%，疾病控制率高达70%。,EGFR (-) 2G + 2R Ratio: 2.0, EGF
5、R FISH (-),EGFR (+) Ratio: 2.0, EGFR FISH (+),滤泡性淋巴瘤,探针: BCL2/IGH （双色双融合探针） BCL2基因位于18q21， IGH基因位于14q32. BCL2/IGH融合基因导致BCL2蛋白的过度表达，从而抑制B细胞凋亡，使B细胞持续增殖引发肿瘤。 BCL2/IGH融合基因检测意义: 辅助诊断FL ：BCL2/IGH重排发生在约80%-85%的FL患者中。 BCL2/IGH持续阴性的FL患者3年生存率为100%，而阳性者3年生存率只有54%；阴性者3年疾病无进展的患者87.5%，而阳性者只有13%。,BCL2/IGH 正常,BCL2/
6、IGH断裂、平衡易位,弥漫性大B细胞淋巴瘤,探针：BCL6（双色分离探针） BCL6基因位于3q27，主要有t(3;14)，t(3;22)和t(2;3)3种易位，分别是BCL6与免疫球蛋白Ig的重链(IGH)、轻链(IGL)、轻链(IGK)区域易位。 BCL6 基因断裂检测意义 目前研究确定至少40%的DLBCL涉及3q27染色体易位或者BCL6基因重排。 BCL6阳性患者诊断治疗36个月后，疾病停止发展的比率为82%，携带有BCL6重排的病例预后较好。,BCL6断裂,BCL6正常,套细胞淋巴瘤,探针：CCND1/IGH（双色双分离探针） CCND1基因位于11q13，IGH基因位于14q32
7、。CCND1/IGH融合基因导致CCND1蛋白过度表达，可促进细胞增生。 CCND1/IGH融合基因检测意义 CCND1基因重排和(或)高表达是MCL的特征，FISH探针检测CCND1/IGH的阳性率可以达到96%。,CCND1/IGH正常,CCND1/IGH断裂易位,伯基特淋巴瘤,探针:C-MYC（双色分离探针） 8号染色体上C-MYC基因最常见的是t(8；14)，导致8号染色体上C-MYC基因和l4号染色体上IGH增强子元件并列,也可发生t(2；8)(p12；q24)，或t(8；22)(q24；ql1) C-MYC基因断裂检测意义 约80%的伯基特淋巴瘤病例发生t(8；14)（q24;q3
8、2）； 约15%的伯基特淋巴瘤病例发生t(2；8)(p11;q24)； 约5%发生t(8；22)（q24;q11）。 C-MYC基因断裂重组可能是伯基特淋巴瘤的一个标志，可以应用于临床上伯基特淋巴瘤的辅助诊断。,C-MYC正常,C-MYC断裂,MALT淋巴瘤,探针： MALT1（双色分离探针） API2/MALT1（双色双融合探针） API2（11q21）MALTI（18q21）易位形成API2/MALTI融合基因，产生API2/MALTI融合蛋白，导致细胞增殖，引起肿瘤。 MALT1及API2/MALTI融合基因检测意义 10%-20%的粘膜性淋巴组织淋巴瘤中会存在MALT1 基因的断裂重组
9、，辅助诊断MALT淋巴瘤。 指导针对胃API1/MALT1淋巴瘤患者的抗幽门螺旋菌治疗： 存在MALT1 基因的断裂重组的患者不适合用抗生素治疗。 预后判断：存在MALT1 基因的断裂重组的节外胃淋巴瘤患者更容易出现局部进展期病变。,MALT正常,MALT断裂,API2/MALT正常,API2/MALT断裂易位,滑膜肉瘤,探针：SYT SYT基因位于18q112,又称SSl8或SSXT基因 。 SYT基因检测意义 辅助诊断滑膜肉瘤。 文献报道，90以上的滑膜肉瘤中存在染色体易位t(X；18)(p112；q112)，导致位于18q112的SYT基因和位于Xp112的SSX基因融合。,脂肪肉瘤,探
10、针：MDM2/CEN12 MDM2基因检测意义： 辅助诊断高分化脂肪肉瘤。 文献报导：90%高分化脂肪肉瘤中MDM2基因存在扩增。,胃肠道间质瘤,探针：CCND1/CEN11 MDM2/CEN12 检测意义： CCND1基因为重要预后因子，与多种肿瘸的转移、复发等相关。在高凤险们GIST中扩增，在低风险和中等风险GIST中无扩增，其表达与GIST有预后相关性。 MDM2基因扩增宣GIST患者有预后相关性。,前列腺癌,探针：PTEN/CEN10 FGFR1/CEN8 ERG 检测意义： PTEN基因缺失，前列腺癌患者预后差。 FGFR1基因扩增是前列腺癌患者传递激素抵抗的重要过程。 没有ERG基
11、因改变的前列腺癌患者8年生存期达90%。,神经母细胞瘤、神经胶质瘤,探针：1p36/1q25 19q13/19p13 NMYC/2q11 检测意义： 在神经母细胞瘤患者中，1p丢失是强烈的预后差因子，提示临床应采取积极主动的治疗策略； 结合1p，19q基因状态可辅助治疗和预测退行性少突神经胶质瘤的预后效果。 NMYC基因扩增为预后差因子，指导个性化治疗。,黑色素瘤,探针：PTEN/CEN10 检测意义： PTEN基因缺失导致PI3K/AKT（磷酸肌醇3激酶 /丝氨酸苏氨酸蛋白激酶 ）途经激活，指导抗PI3K/AKT通路药物。 PTEN基因缺失的患者预后差。,宫颈CIN、宫颈癌,探针：TERC/
12、CSP3 检测意义： 对于CIN1/CIN2的患者，TERC基因扩增的患者发生进展/恶变的可能性超过50%，需要及时治疗。 辅助明确宫颈CIN分级，选择合理的治疗方案。,膀胱癌,探针：CSP3/CSP7 P16/CSP17 检测意义： 膀胱癌9号染色体部分(P16位点)缺失或全部丢失是最常见的遗传学异常之一，这一异常与膀胱癌的旱期发望密切相关。 膀胱癌的发展与染色体不稳定性(如3号、7号、17号染色体的非整倍性)紧密相连。 早期无创性诊断泌尿系统移行上皮癌。 泌尿系统移行上皮癌术后复发监测。,四、FISH操作流程,石蜡切片58-60过夜 二甲苯脱蜡，酒精脱二甲苯，水化组织 高压处理组织切片 胃
13、蛋白酶处理组织 干燥组织切片后滴加探针，加盖玻片与封固剂 高温（7395）变性 杂交16小时（过夜） 揭去橡胶水泥和盖玻片,进入杂交后洗涤 酒精脱水、晾干。 滴加DAPI荧光封片剂 荧光显微镜下观察,五、FISH判读标准,乳腺癌HER2基因检测: 20个肿瘤细胞HER2基因（红信号）点数总和与CEN-17（绿信号）点数总和的比值。 HER2/CEN-172.2 HER2基因有扩增 HER2/CEN-171.8 HER2基因无扩增 HER2/CEN-17 1.82.2 定为不确定结果。 需重新再进行另外20个的细胞计数或重复FISH检测，如仍不确定，则建议临床结合IHC检测HER2蛋白表达情况决
14、定是否使用靶向治疗。,CEN-17多体性：计算以上计数的20个细胞的绿信号点数均值。 CEN-17均值 1.75 亚二体性 CEN-17均值 1.762.25 二体性 CEN-17均值 2.263.75 低多体性 CEN-17均值 3.76 高多体性,非小细胞肺癌EGFR基因检测: 50个肿瘤细胞EGFR基因（红信号）点数总和与CEN-7（绿信号）点数总和的比值。 EGFR基因扩增阳性： EGFR基因簇状扩增 EGFR/CEN-72.0 40% 肿瘤细胞红色信号4个,六、FISH检测规范与质控,影响FISH制片质量的因素 组织处理的规范化: 及时固定:冷缺血时间1h 4%中性缓冲甲醛6-48h
15、 不推荐微波固定 乙醇脱水 浸蜡温度68 不使用快速石蜡组织做FISH检测,脱蜡、脱二甲苯 组织消化 变性、杂交的温度 杂交后洗涤液PH值 6周的组织切片不应再用于FISH检测,影响FISH判读的因素 采用正确的滤光片观察 Orange/red 正确判定肿瘤细胞(HEIHCFISH) 肿瘤异质性表达 导管内癌/浸润性癌 浸润性癌不同部位 至少两位阅片者,导管内癌,浸润性导管癌,免疫组化技术、蛋白组学技术的发展 21世纪初蛋白质指纹图谱技术建立 新蛋白质种类的发现 免疫组化抗体种类 对临床病理的影响,！,10年时间,DNA测序技术的进步 人类基因组计划初步完成 于2000年完成测定人体23对染色体全部DNA序列，完成人类基因组“工作框架图” 。2001年公布了人类基因组图谱及初步分析结果。 人类基因组研究进入规模化 荧光原位杂交技术的发展 FISH探针的种类 对临床病理的影响,？,谢谢！,