组培论文 菘蓝叶片离体培养及植株再生.doc

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1、 织物组织培养实验报告织物组织培养实验报告 菘蓝叶片离体培养及植株再生菘蓝叶片离体培养及植株再生 姓姓 名：名： 杨定乾杨定乾 学学 号：号： 20100242 学学 院：院： 农学院农学院 专专 业：业： 生物技术生物技术 10 级级 2 班班 指导老师：指导老师： 刘帆刘帆 菘蓝叶片离体培养及植株再生菘蓝叶片离体培养及植株再生 农学院 生物技术 杨定乾 20100242 指导老师：刘帆 摘要摘要：本实验以菘蓝叶片为材料，用组织培养的方法，采用六种营养液配比， 对板蓝根叶片进行快繁，研究不同的激素浓度对菘蓝的诱导及不同激素组合对 出生芽，存活率的影响。同时，不同程度的营养液配比实现了菘蓝的繁

2、殖由种 子到组织的可行性论证。结果表明，在 1 组 6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L 4 组 2，4-D1.0mg/L，KT0.5mg/L，的激素配长出的芽点最多，随着 6-BA/NAA 比值较 低，丛生芽数减少，但诱导率将增加。而随着 2，4-D/KT 比值较大，没有丛生 芽，诱导率降低。所以，生长素和分裂素的比值低时，促进丛生芽数的分化。 关键词关键词：菘蓝叶片；离体培养；植株再生 前言前言：菘蓝，又名靛青根，蓝靛根，大青根等，是一种二年生植物1，中药材。 拉丁名 Isatisindigatica Fort，在全国各地都有种植生产。分为北板蓝根和南板蓝 根，北板蓝根起源于十字花

3、科植物菘蓝和草大青的根;南板蓝根为爵床科植物马 蓝的根茎。具有清热解毒，凉血消肿，利咽之功效; 用于温病发热，发斑，风 热感冒，咽喉肿痛。丹毒，流行性乙型脑炎、肝炎和腮腺炎等症。板蓝根适应 性很强，对土壤和其他自然条件要求不严，耐寒喜温暖，宜种植在沙质土壤， 忌低洼地。目前板蓝根的研究重点放在了药理开发和合理种植上，对利用组培 技术快繁幼苗的研究进行的不多。所以本实验的研究实现了实验室的板蓝根叶 片组织快繁的技术论证2-5，对于板蓝根规模化批量生产具有巨大的市场价值。 目前，菘蓝在国内外的研究较为深入。在化学成分、药理作用、质量控制 方法、提取工艺方法等方面，均有很好的研究进展。 本实验研究菘

4、蓝叶片的离体培养及植株再生，就是为选出其中最佳的培养 条件，为菘蓝的快速繁殖、实现其经济价值、造福社会做出贡献。 1.1.材料与方法材料与方法 ： 1.1 材料来源材料来源：菘蓝叶片。来源四川农业大学植物生理系提供 1.2 试验方法：试验方法： 1.2.1 培养基设计培养基设计 表 1 培养基配方(g) 序 号 MS 大 量 MS 微 量 I MS 微 量 II 铁 盐 有 机 物 甘 氨 酸 6- BA NA A 2， 4-D KT肌 醇 蔗 糖 琼 脂 15050.550.512.00.1-0.1305 25050.550.512.00.5-0.1305 35050.550.512.01.

5、0-0.1305 4 5 6 50 50 50 5 5 5 0.5 0.5 0.5 5 5 5 0.5 0.5 0.5 1 1 1 - - - - - - 1.0 2.0 4.0 0.5 0.5 0.5 0.1 0.1 0.1 30 30 30 5 5 5 1.2.2 培养基的制备培养基的制备(配制 500mL 溶液) （1）.量取液体 称取 MS 大量元素 50g，MS 微量元素 I 5g，MS 微量元素 II 0.5g，铁盐 5g， 有机物 0.5g，甘氨酸 1g。 （2）.称量蔗糖，肌醇和琼脂 在电子天平上，各称取 1 份蔗糖，肌醇和琼脂，质量分别是 15g，50mg 和 2.5g。 （

6、3）.溶液的熬制 将配好的溶液和称取完的蔗糖，肌醇和琼脂等物质混合在杯子里，在电炉上 加热至沸腾;铁盐要用杯子单独熬制溶解。之后将铁盐和琼脂加入含 1 和 2 物质 的铁杯子里，并不断用玻棒搅拌混溶，防止产生沉淀，至溶液澄清透明为准。 （4）.定容 将熬制好的溶液在杯子中用蒸馏水补齐至 500ml，并不断搅拌，充分混匀。 （5）.调节 PH 用玻棒蘸取溶液，点在 PH 试纸上，若偏酸性，用胶头滴管滴入 NaOH 溶液; 偏碱，用胶头滴管滴入 HCl 溶液。使最终的 PH 达到 5.8 为适宜。 （6）.溶液分装 每组溶液分装在 42 只试管中，并做好标记，每管大约 10-12mL。 1.2.3

7、.高压锅灭菌高压锅灭菌 1.2.3.1.无菌皿制作 将剪好的圆形滤纸放在培养皿中，盖好盖子，并用干净的报纸包好，待灭菌。 1.2.3.2.无菌水的制作 用无菌水洗刷瓶子多次后，倒入瓶内 2/3 无菌水，拧好盖子。待用。 1.2.3.3.高压锅灭菌 将制作的培养基，无菌皿，无菌水和其他接种需要的器材(镊子，手术刀，瓶 子等)，一起放入高压灭菌锅内，在 121 摄氏度下灭菌 20 分钟，冷却后取出放 在无菌柜里待用。 1.2.4.材料处理材料处理 1.2.4.1.板蓝根叶片的消毒 将新鲜的板蓝根叶片放在流动的自来水下冲洗 30 分钟，再用 75%乙醇溶液 浸泡叶片 10 分钟左右，冲洗 3-4 无

8、菌水后，再在升汞中浸泡 8 分钟左右，用无 菌水冲洗 4-5 次之后，放在消毒的无菌皿上待用。 1.2.4.2.实验人员的消毒 操作之前，用 75%乙醇对手和胳膊进行多次擦拭消毒。 1.2.5.接种接种 把消毒的叶片用刀片切成 1cm2大小的小块。迅速将培养瓶的封口在酒精灯前 取下，放入切好的叶片，迅速封口。接种完成的培养瓶放在适宜的培养室里培 养。 1.2.6.培养条件培养条件 培养室温度为 21-25 摄氏度;光照:培养前 8 天黑暗处理，在第 2 周的培养中光 照 1500-2000Lx，12h/d，3-6 周长成小芽，相应的光照可提高一些，时间延长一 些。 2.结果与分析结果与分析 2

9、.1.实验结果实验结果 下表是接种第 3-4 周，打开培养瓶检测，不同浓度激素对板蓝根诱导培养的影 响 表 2 组序接种个数 污染数 存活数存活率(%)形态变化 134 0341005 叶膨大，长芽 235 23397.16 叶膨大，有卷曲 342 43890.54 叶膨大，长芽 4 5 6 32 0 40 5 49 0 32 35 49 100 87.5 100 膨大，卷曲，有芽 点 叶少量卷曲，膨大 边缘黄色，叶片上 卷，有少量芽点 2.2 比较分析比较分析 2.2.1.由表 2 比较 1，2，3 组，在其他各物质都一样的情况下，可以得出在 6- BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L

10、的激素配长出的芽点最多。 2.2.2.由表 2 比较 4，5，6 组，在其他各物质都一样的情况下，4 组 2， 4-D1.0mg/L，KT0.5mg/L，长出的芽点多;6 组 2，4-D4.0mg/L，KT0.5mg/L，没 有出芽。 2.2.3.由 1,2,3 组对比可得不同浓度的 NAA 对菘蓝的存活情况，第 1 组存活率 最高，2,3 组依次下降，其中第 1 组污染率也最低 2.2.4.比较 4,5,6 组可得不同浓度的 2,4-D 对板蓝根的存活情况也存在差异，第 4 组存活率最高，25,6 组依次下降，其中第 4 组污染率也最低。 3 结论与讨论结论与讨论 3.1 结论：结论： 从实

11、验结果可以看出，随着 6-BA/NAA 比值较低，丛生芽数减少，但诱导率 将增加。而随着 2，4-D/KT 比值较大，没有丛生芽，诱导率降低。所以，生长 素和分裂素的比值低时，促进丛生芽数的分化。 3.2 讨论：讨论： 植株再生技术是植物组织培养的重要方面，是植物生物工程技术研究的基 础，而植株再生是一个复杂的技术体系，与植株本身的激素水平和培养基中的 生长调节剂浓度密切相关。在组织培养中，人们常用生长素和细胞分裂素诱导 已分化细胞脱分化。2，4一D一般有利于愈伤组织的形成，但对芽的分化有强烈 的抑制作用，本试验材料也不例外。 NAA和2，4一D都是生长素类物质，但是对 菘蓝叶片的诱导分化方向

12、不同，单纯的NAA或与6一BA组合，都可以诱导不定芽 的分化。一般认为，随着培养基中6一BA与NAA相对例的升高，不定芽的分化率 会增高。在本试验中，当NAA0.1mgL，6一BA2mgL时出芽率最高，NAA为1.0 mgL和0.5mgL时的诱导率均低于NAA为01 mgL时分化率。试验结果表明， 菘蓝叶片不易通过愈伤组织发生不定芽，可以不经过愈伤组织阶段直接诱导发 生不定芽，在诱导不定芽时，不但要考虑诱导分化率的问题，同时也应该考虑 诱导分化出的不定芽的健壮程度。在以菘蓝幼嫩叶片为外植体诱导不定芽时， 以添加NAA0.1mgL+6一BA2.0mgL的MS基本培养基为佳，也可以用只添加 2，4

13、-D1.0mgL+KT0.5 mgL的MS本培养基，后者在存活率和污染率上效果好， 生长健壮。因此是一个很好的试管无性体系，是进一步利用离子束生物技术进 行菘蓝遗传改良的首选组织培养体系。 参考文献参考文献 1 余绍华. 菘蓝的组织培养J 四川师范学院学报1991;12(4):358361 2陈秋芳，黄群策，秦广雍。菘蓝叶片离体培养与试管无性系的建立J。河南 农业科学，2007(7):98-100。 3张丽琼，周琼，柳林，等。不同培养基对菘蓝叶片组织培养的效应J。广西 热带农业，2007(6):30-31。 4彭丽萍，张远兵，汪露润。菘蓝离体叶片高频再生系的建立J。安徽科技学 院学报，2007

14、21(4):14-17。 5苗永美，简兴，石静。菘蓝两种外植体愈伤组织诱导研究J。生物技术通报， 2008(1):147-150。 6李春喜，王志和，王文林。生物统计学M。北京:科学出版社，2000:149- 156。 7LIANG Q，DONG L，NING Z Y， et al。Fstablishment of sometic cell clones in Thesium chinenes tirrcs and its in vitro rooting techniqueJ。Agricultural Science &Technology。2008，9(5):47-49。62。 致致 谢谢 经过忙碌的实验，本实验终于顺利完成。在这里首先要感谢刘帆老师和倪 苏老师，感谢他们在课堂上和在实验室里对我们耐心的讲解和辛勤的指导。 然后还要感谢和我一起做实验的我们组的同学，他们在本次实验中非常勤 奋，并为此次实验做出了很大的贡献，如果没有他的努力、勤奋和智慧，此次 实验的完成将变得非常困难。还要感谢实验室的师兄对我的实验的帮助。 最后，衷心感谢在百忙之中抽出时间审阅本论文的老师！谢谢你们！