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1、小4号仿宋体、居中，作者在上、指导教师在 下；作者与标题、指导教师与摘要之间空小四单倍行距。摘要内容与正文左右缩进2字符，小4号仿宋体，两端对齐方式排列，首行缩进2字符，行距20磅。不能用第一、第三人称，不得出现评价性语言。标题小2号黑体、居中。应简练，一般不超过25个汉字。木聚糖降解菌的筛选及分子鉴定“摘要”、“关键词”字体为小四黑体。作 者：指导老师：摘要：从宝天曼地区采集的腐木中富集、分离出了16株能够降解木聚糖的菌株。利用刚果红活性染色法对菌株进行染色，根据透明圈的大小筛选出6株产木聚糖酶菌株。6株菌株在摇床180 r/min、28 的条件下发酵培养48 h，利用DNS法测定各菌株木聚
2、糖酶的活力大小，结果表明菌株M3的酶活力最高，酶活力为19.098 U/mL。提取菌株M3的基因组进行26S rDNA PCR扩增并进行序列测定，经相似性分析和系统发育树分析，初步鉴定菌株M3属于Trichosporon porosum。关键词：木聚糖降解菌；筛选；分子鉴定；木聚糖酶；酶活正文与关键词之间空小4单倍行距一行。正文文字用四号宋体、22磅行距、全角标点词与词之间用分号。一般为35个，尽量不与标题重复。0 引言种名用斜体上标格式按出现的先后顺序标序；连续文献如2-6，不连续文献如1,4,7来表示。纤维素类物质是一类大量存在而又可再生的重要潜在资源，半纤维素占总纤维素的15%30%，其
3、中主要成分是木聚糖。与纤维素相比，半纤维素更易为微生物所降解和转化1。木聚糖酶是一类以内切方式降解木聚糖分子中-1,4-木糖苷键的酶类，其水解产物主要是木二糖和木寡糖，也有少量木糖和阿拉伯糖。该酶具有广泛的应用前景2，该酶在造纸业中部分替代二氧氯用于纸浆漂白，可改善纸浆性能；木聚糖酶作为饲料添加剂，可提高饲料的能量值和禽、畜对饲料的利用率；食品工业中可利用木聚糖酶降解半纤维素的主要成分木聚糖生产低聚木糖等高附加值的产品。可见木聚糖酶在工业中的用途非常广泛。因此国内外很多研究者都致力于对木聚糖酶的研究，已有不少研究者对黑曲霉、木霉(Trichoderma sp.)等真菌及短小芽孢杆菌(Bacil
4、lus pumilus)、环状芽孢杆菌(B.circulans)等细菌的木聚糖酶进行了研究。英文缩写首次出现，应标出英文全称。森林腐木中富含半纤维素，这种环境中有大量的微生物都能分解木聚糖，从中很容易筛选得到高效降解木聚糖的菌株。本研究主要从宝天曼森林腐木中富集、分离、筛选出产木聚糖酶菌株，并分析它们木聚糖酶的酶活力大小，找出酶活力较高的分离菌株。最后通过分子生物学方法测定分离菌株的26S rDNA序列并对其进行序列相似性分析和系统发育树分析，初步鉴定出分离菌株在系统发育上的分类地位。一级标题用阿拉伯数字、小3号黑体、左顶格，不加标点，段前、段后各空四号单倍行距一行。一级标题不可置于页尾。序号
5、与标题文字之间空一字之距。二级标题采用阿拉伯数字1.1、1.2等格式标引、4号黑体、左顶格、不加标点。序号与标题文字之间空一字之距。1 材料与方法1.1 样品数值与单位之间空半字之距。取自实验室保存的宝天曼地区采集的腐木。1.2 试剂2.2%溴钾酚绿、1%刚果红溶液、1 mol/L NaCl溶液、柠檬酸缓冲液、木糖溶液、DNS试剂、试剂酵母基因组提取试剂盒、PCR Magic Mix2.0、引物NL1、引物NL4、TAE缓冲液、琼脂糖凝胶、EB试剂。1.3 培养基3富集培养基：木聚糖1%、酵母氮基础培养基1%、氯霉素(80 L/100 mL)；英文、数字、符合等用Time New Rome字体
6、。分离培养基：酵母提取物0.5%、葡萄糖1%、溴钾酚绿2%、琼脂2%、氯霉素（80 L/100 mL）；鉴别培养基：木聚糖1%、酵母氮基础培养基1%、琼脂2%、氯霉素（80 L/100 mL）；三级标题采用阿拉伯数字1.2.1等格式标引，4号宋体、左顶格、不加标点，序号与标题文字之间空一字之距。斜面培养基：酵母粉0.3%、麦芽粉0.3%、蛋白胨0.5%、琼脂2%、氯霉素（80 L/100 mL）；1.4 菌株筛选4,51.4.1 富集培养取7支干净小试管，向每支试管中分装入35 mL富集培养基，于121 高压灭菌锅中灭菌20 min。用镊子夹取少许实验室保存的7种森林腐木分别放入已灭菌的富集培
7、养基中，于28 温箱中富集培养23 d。1.4.2 平板分离对培养后变混浊的富集培养液按照梯度稀释法用无菌水稀释到10-5，在超净工作台中的无菌条件下，准确吸取100 L的10-310-5不同稀释倍数的菌液涂布于已灭菌的平板培养基上，于28 温箱中倒置培养23 d。1.4.3 纯化菌种根据菌落形态特征的比对，找出不同形态的菌株。在无菌条件下，挑取不同形态的单菌落在已灭菌的纯化培养基上进行扇形划线，于28 温箱中倒置培养23 d。按照同样的方法划线23次后即可得到纯菌落。用镊子夹取已灭菌的牙签，将纯化培养基中的纯菌落点蘸到鉴别培养基上，于28 温箱中倒置培养23 d。待菌落长大后用1%刚果红进行
8、活性染色30 min，倾去染液，再用1 mol/L NaCl溶液漂洗1 h，观察菌落周围是否有透明圈出现以及透明圈的大小。出现透明圈的菌落即为所需要的木聚糖降解菌，再选出透明圈大且明显的菌株接种到斜面培养基上于4 冰箱中保存备用。表包括表序、表题、表格、表注等。表与上下文之间空小四、单倍行距，标题在表上、小四宋体，表序与标题间空一字之距；表格为“三线表”格式（自动套用格式-简明型1），首、尾线为粗线，表内文字为5号宋体。1.5 木聚糖酶活力的测定1.5.1 木糖标准曲线的制备取烘干好的木糖0.1000 g溶解于蒸馏水中后，再用100 mL容量瓶定容至100 mL，得到1 mg/mL的木糖溶液。
9、用木糖制备标准曲线的体系见表1。表1 制备木糖标准曲线的溶液体系（单位：mL）编号0123456木糖标准液蒸馏水DNS02.01.50.21.81.50.41.61.50.61.41.50.81.21.51.01.01.51.20.81.5注：表中所用试剂为纯试剂表注在表格下方，5号仿宋字，与正文左右缩进2字符。取7支带刻度的平底试管，编号为17，分别加入上述溶液。于沸水浴中煮沸5 min后，立即放入冷水中冷却，加蒸馏水定容至25 mL，用TU-1901双光束紫外可见分光光度计在540 nm波长下测OD值并制作工作曲线备用。1.5.2 摇瓶培养取一环旺盛生长于斜面培养基上的菌种接种到已灭菌的种
10、子培养基中，28 、180 r/min进行三角瓶摇床培养24 h，取2 mL菌液加入已灭菌的发酵培养基中28 ，180 r/min摇床培养48 h。1.5.3 木聚糖酶粗酶液的制备取5 mL发酵培养基菌液于已灭菌的10 mL离心管中，在4 离心机中6000 rpm离心20 min，转移上清至另一离心管，则为所需的粗酶液。取各酶液1 mL装入1.5 mL离心管中沸水浴煮沸10 min得到失活酶液作为空白对照。1.5.4 木聚糖酶酶活力的测定6取25 mL具盖带刻度的平底试管，加入1.5 mL 1%木聚糖柠檬酸缓冲液于50 水浴预热15 min，再加入0.5 mL相应酶液(对照中加入0.5 mL灭
11、活酶液)，50 水浴保温30 min(隔几分钟震荡数次)。然后加入1.5 mL的DNS试剂，沸水浴煮沸5 min，立即放入冷水中冷却，并定容至25 mL。版面尺寸：A4（210毫米297毫米）。正文位置：上、下边界25毫米、左边界30毫米、右边界20毫米、装订线位置定义为0毫米。1.6 菌株的分子鉴定1.6.1 基因组DNA的提取菌株基因组DNA的提取采用酵母菌基因组提取试剂盒法。用接种环从斜面培养基上取三环生长旺盛的酵母菌细胞，悬浮于500 L无菌水中，12000 rpm离心1 min，弃上清，沉淀即为各菌株的菌体。按照酵母菌基因组提取试剂盒中使用说明书上的流程进行各菌株基因组的提取，并将其
12、保存于TE缓冲液中，放入4 冰箱中保存备用。将各菌株基因组进行琼脂糖凝胶电泳分析，根据条带的亮度确定基因组的稀释倍数，作为PCR扩增的模板。2 结果与分析2.1 菌株筛选用木聚糖作为唯一碳源从实验室保存的腐木中分离能产木聚糖酶的菌种。2.2 基因组DNA的提取和PCR的扩增以NL1和NL4作为引物对菌株M3的26S rDNA基因组做特异性PCR反应扩增。将扩增的基因组进行琼脂糖凝胶电泳分析得到单一条带，片段大小长度约为600 bp，扩增产物无明显非特异扩增现象，结果见图1。图包括图形、图序、图题、图注。图题在图下、小4号宋字、加粗，图序与图题间空一字之距；图注在图题下方、5号仿宋字，与正文左右
13、缩进2字符；图形中应对与文中相关的信息标注。750bp500bp12图1 菌株M3 26S rDNA电泳图采用小4号宋体，用“第页（共页）”的格式，居中，距下边界15毫米的位置。注：1、DL2000marker；2、菌株M32.3 26S rDNA 序列相似性分析测定菌株M3的26S rDNA序列，长度为595 bp，将获得的26S rDNA碱基序列经DANMAN软件处理后在GenBank核酸序列数据库中通过BLAST进行同源序列搜索及相关信息检索，得到菌株M3的26S rDNA序列与其他菌种的相似性，结果见表2。检索结果表明，菌株M3与Trichosporon的26S rDNA序列有较高的相
14、似性。3 讨论木聚糖作为植物半纤维素的重要组分，是自然界继纤维素之后含量第二丰富的可更新的多糖。以往的研究中，半纤维素的再利用通常经过酸水解处理，而后再经微生物转化为生产产品。然而，尽管酸水解速度快，但伴随有毒性化合物产生，对随后的生物转化过程有影响。因自然界中许多微生物类群都能产生木聚糖酶，且微生物木聚糖酶水解法处理半纤维素更为安全和有效，因而大力开发经济、高效的微生物木聚糖酶具有重要意义。以往研究的木聚糖降解菌主要集中在霉菌、放线菌等，而霉菌、放线菌等生产木聚糖酶周期相对较长，通常为47 d。少数产木聚糖酶细菌的产酶效率相对较低。本研究以木聚糖作为唯一碳源从森林腐木中分离、筛选出6株木聚糖
15、降解菌。利用刚果红活性染色法对各菌株染色，根据透明圈的大小初步判定M3降解木聚糖的能力较强。进一步对各菌株进行酶活力测定，结果表明菌株M3在摇床180 r/min，28 ，48 h条件下利用1%木糖的酶活力最高，酶活力为19.098 U/mL。M3产酶效率高，发酵周期短，仅48 h。通过26S rDNA序列相似性分析得出，菌株M3与Trichosporon porosum亲缘关系较近，其中与Trichosporon porosum的相似性为100%，因此初步鉴定菌株M3属于Trichosporon porosum。用分子生物学的方法对酵母菌进行分子鉴定，是一种快速、简便和有效的方法。利用26S
16、 rDNA序列分析方法对酵母菌进行分离和分子鉴定，为研究酵母菌打下了基础。页码采用小4号宋体，用“第页（共页）”的格式，居中，距下边界15毫米的位置。一般位于正文结尾后下隔2行，居中，采用小3号黑体，字与字之间空半格，与参考文献目录间空小四单倍行距。如距离小，可以另起一页。参 考 文 献1 周世宁,陆勇军,杜扬.木聚糖降解菌的筛选和木聚糖酶性质的研究J.中山大学学报,1996,35(1):91-96.参考文献目录标引序号用阿拉伯数字、方括号括住，按在正文中出现的先后顺序排列，序号与内容间空半格，内容为小4号仿宋体，20磅行距，左顶格，拐行时与序号后文字齐，半角标点。作者3人以下全部写出，中间用
17、逗号隔开，3人以上用 “第一作者，等”。2 黄云红,等.木聚糖酶高产微生物的筛选和鉴定J.江西师范大学学报,2002,26(3):245-248.3 王辰,白逢彦.海南热带雨林腐木上酵母菌物种多样性研究J.菌物学报,2009,28(3):354-362.4 国春艳.酸性木聚糖酶产生菌的筛选及酶学性质分析J.中国农业科学,2010,43(7):1524-1530.5 孙丰慧,李安明.耐碱性木聚糖酶产生菌的筛选及发酵条件研究J.应用与环境生物学报,2008,14(3),436-439.文献题目后应有相应的标识。如期刊J,著作M,学位论文D,报纸N,专利P等。6 濮智颖.酸性木聚糖酶产生菌产酶条件及
18、酶学性质研究J.陕西教育学院学报,2008,24(2):101-105.7 陈红歌. 酸性木聚糖酶产生菌的筛选及产酶条件J.微生物学报,1999,39(4):350-354.8 Anthony T,Gunasekaran P,Raj K C,Rajendran A,Gunasekaran P.Inhibition of pro- teases during fermentation improves xylanase production by alkali tolerant Aser- perillus fumigatus AR1J.Journal of Bioscience and Bio
19、engineering,2003,96(4): 394-406.9 Fukusaki E ,Panbangred W.The complete nucleotide sequence of the xylanase gene of Ba-cillus pumilusJ.Febs Letters,1984,171(2):197-201.10 周德庆.微生物学实验手册M.上海:上海科学技术出版社,1986:197-231.年，卷号（期号）：起止页码等信息应齐全。没有卷号可不标。著作可只标出出版年份。作者用小四号Time New Rome体、“姓”用大写字母拼写，“名字”的第一个字母用大写，其余小写
20、，两字者加连字符。Selection and Molecular Identification of英文标题用四号Time New Rome体、加粗、行距22磅，单词首字母大写（介词和连词除外），与姓名之间空小四单倍行距。如页面距离太小，可放到下一页。Xylan-degrading YeastGUAN Wei-weiAbstract: Sixteen Xylan-degrading strains are filtered out by enriching and separating from the rot wood gathered from the Mountain BaoTianMa
21、n. Using dye Congo red staining on strains, six Xylan-degrading strains are selected by observating the transparent circles size of these strains. Six strains are cultured in the Shaker 180 r/min, 28 for 48 hours. Using DNS to determine the size of xylanase activity. The result reflects that strain
22、M3 has the highest enzyme activity and its xylanase activitys size is 19.098 U/mL. The genesome of strain M3 are extracted and its 26S rDNA are increased by the method of Polysomase Chain Reaction and its 26S rDNA sequense are mesured. Through the similary analysis of strain M3 26S rDNA sequences and evolution tree analysis, strain M3 are preliminaryly identified to belong to Trichosporon porosum.Key words: Xylan-degrading bactery; filter; molecular identification; xylanase enzyme; enzyme activity“摘要”、“关键词”两字用小四黑体、加粗，关键词间用分号。摘要内容用小四号Time New Rome体、单倍行距、左边对齐方式排列。