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1、概述 细胞周期调控 细胞周期相关的癌基因和抑癌基因 细胞增殖异常与疾病 细胞增殖活性的检测方法,细胞增殖异常与疾病,概述： 细胞是机体内最基本的结构和功能单位 细胞的生长和增殖形成了生物体的生长繁衍 细胞的异常增殖可能导致机体的疾病,【 细胞增殖】 细胞分裂和生长的过程 细胞通过分裂进行增殖，把遗传信息传给子代，保持物种的延续和数量增多 细胞增殖、分化不良 组织器官发育不全 细胞增殖、分化不全(低分化、去分化或逆分化) 肿瘤发生,【细胞增殖过程】,【 细胞周期】（ Cell cycle） Cell cycle is defined as a period from the end of one
2、 division to the beginning of next division of a proliferative cell. 细胞周期分期 G1SG2M G1期：DNA合成前期（RNA和蛋白质合成) Interphase S期：DNA合成期(DNA复制、组蛋白和非组蛋白合成） G2期：分裂前期（微丝、微管蛋白，成熟因子等合成） M phase M期：分裂期,三类细胞： 持续分裂细胞(continuously dividing cell)： 肿瘤细胞，表皮，呼吸、消化、生殖道粘膜上皮，淋巴造血细胞、间皮细胞 不分裂细胞 ( nondividing cell)： 神经元、骨骼肌、心肌细
3、胞 静止细胞 (quiescent cell) （ G0期） 腺体或腺样器官的实质细胞、间叶细胞：肝细胞等,细胞周期的调控 （Regulation of the cell cycle）,Regulation of the cell cycle,Regulation of the cell cycle by intracellular signals,Regulation of the cell cycle by extracellular signals,细胞周期素（Cyclin） 细胞周期素依赖性激酶（Cyclin-dependent kinase, CDK) 细胞周期调控机制的核心 细胞周
4、期素依赖性激酶抑制剂（CDK inhibitor, CKI),1 、细胞周期自身调控机制,Key spot：Cyclin、 CDKs、 CKI、Checkpoint of cell cycle,Cyclin周期变化图,Cyclin Cyclin A 、Cyclin B、Cyclin C、Cyclin E、 Cyclin D1, D2, D3、 Cyclin H,Cyclins主要通过泛素化降解 泛素由76个氨基酸组成，广泛存在于真核细胞。共价结合泛素的蛋白质被蛋白酶体识别和降解。,Cyclins的作用： 激活CDK, 决定 CDK何时将何种底物磷酸化而推动细胞周期进行,CDK: 一组丝氨酸 /
5、苏氨酸蛋白激酶 CDK1、CDK2、CDK3、CDK4、CDK5、CDK6、CDK7 CDK与Cyclin结合形成复合物，磷酸化而激活 控制G1期：CDK4、CDK6、CDK2 控制S和G2期： CDK2 控制M期： CDK1,Cdk1,【CDK活化与调控细胞周期】 CDK2与cyclin E结合， CDK4、CDK6与cyclin D1、D2、D3结合 Rb磷酸化 游离E2F释放 启动G1期,CDK2与cyclin E和A结合后 识别染色体ARS 促进S期 CDK1与cyclin A结合 启动G2期 CDK1与cyclin B1结合+ MPF（Mitosis promoting factor
6、) 启动M期,(PRb),细胞在生长因子的刺激下，G1期cyclin D表达，并与CDK4、CDK6结合，使下游的蛋白质如Rb磷酸化，磷酸化的Rb释放出转录因子E2F，促进许多基因的转录，如编码cyclinE、A和CDK2的基因。,【CDKs活化部位与抑制部位】,活化部位(CDK1Thr161)磷酸化： CAK对CDK1活化部位磷酸化 抑制部位（CDK1Thr14、Tyr15）去磷酸化： 依赖于P80cdc25酶作用,CKI 可特异性抑制CDK的活性 Ink4（inhibitor of cdk4)： P16INK4a、P15INK4b、P18INK4c和P19INK4d 特异性抑制 CDK4-
7、CyclinD1、CDK6-CyclinD1复合物 Cip/Kip： (cyclin inhibition protein/kinase inhibition protein) p21Cipl、P27Kip1和P57Kip1 抑制 多数CDK活性,【抑制途径】 CKIs通过直接结合CDK-cyclin复 合物的磷酸化活化部位，抑制CDK 的激酶活性。 P16INK4a通过结合CDK4单体， 阻断它与cyclins的结合。,细胞周期校验点（Checkpoint ） 细胞内存在监控机制校验点 G1/S 校验点 DNA 损伤？外环境适宜？体积足够？ Checkpoint S期校验点 DNA复制完成？
8、 G2/M校验点 DNA 损伤？体积足够？ 纺锤体组装校验点 着丝点正确连接纺锤体？,-校验点系统通过促进抑制通路或抑制激活通路使细胞周 期停止 -校验点丢失可导致基因组的不稳定 正常细胞转化为 肿瘤细胞,【Check mechanism】 G1/S期：P53 DNA损伤P53水平上调，磷酸化P53上调 p21Cipl基因转录，P21Cipl能与多种 CDK-cyclin复合物结合，抑制CDKs的激活，阻滞G1/S的过渡，为DNA修复提供足够时间,G2期：Cdc25(P80),一个蛋白激酶结合在损伤的DNA上，激活Chk1（checkpoint kinase）, Chk1使Cdc25失活，使其
9、不能活化cdc2，导致细胞周期中断。,MPF：mitosis promoting factor,CDC25为一种磷酸酶 Cdc2基因的产物为CDK1 ，Cdc2为启动有丝分裂所必须,2 影响细胞周期的细胞外因素 G1期存在一个“限定点”（restriction point），决定细 胞是否进入周期。这“限定点”主要受细胞外信号的调控。 刺激信号（生长因子 ） EGF、IGF、IL,生长因子通过ras途径，激活MAPK，MAPK进入细胞核内，促进细胞增殖相关基因的表达。如通过一种未知的途径激活c-myc，myc作为转录因子促进cyclin D、E2F等G1-S有关的许多基因表达，细胞进入G1期,
10、 TGF- 可刺激纤维母细胞增殖 可下调cyclinD1和CDK4的表达和促进P21wafl、P27kipl和P15ink4b等产生，使其他类型细胞阻滞在G1期。, 细胞生长条件不具备 P16INK4a和P15INK4b增加，并抑制Cyclin D -CDK4/6复合物的功能，细胞阻滞G1期。,3 细胞周期相关的癌基因和抑癌基因 癌基因 sis癌基因 编码PDGF，可刺激具有该受体的肿瘤细胞增殖 fms癌基因 编码CSF-1受体中一条肽链 CSF-1刺激骨髓细胞增殖,ras癌基因 编码细胞膜上单链鸟苷酸结合蛋白-小G蛋白 当信号从细胞膜传到ras蛋白 raf蛋白（具有丝氨酸、苏氨酸蛋白激酶活性
11、）活化MAPK (Mitogen activated protein kinase)磷酸化，促进细胞周期 N: Ras-GTP激活下游信号分子 Ras 蛋白具GTPase活性, 能水解结合的GTP，灭活Ras蛋白活性 ras点突变，失去 GTPase活性，使Ras蛋白活性长期保持,myc癌基因 编码一种核内DNA结合蛋白（起转录因子作用），促进一些细胞分裂所需基因的转录 c-jun和c-fos癌基因 编码转录因子AP-1的亚基，AP-1能调节许多基因转录，参与细胞增殖调节 N:只在有丝分裂元刺激后短暂表达,抑癌基因 抑癌基因表达产物 CDK抑制物： P15、P16、P21、P27等 抑制细胞周
12、期的蛋白： P53、Rb 抑癌基因突变后，不表达或表达无功能的产物，失去对细胞增殖的抑制作用，使细胞出现过度增殖,细胞周期异常与疾病 细胞过度增殖或不足的本质是细胞周期调控异常。 -细胞周期的驱动失控（Cyclin、CDK和CKI表达异常） -监控（检查）机制受损（The impairment of checkpoint system）,细胞增殖异常与相关疾病 增殖异常 增殖分化异常 再生障碍性贫血 恶性肿瘤 前列腺肥大 畸胎瘤 动脉粥样硬化 先天畸形 家族性红细胞增多症 X-连锁-球蛋白缺乏症 高IgM血症,恶性肿瘤细胞增殖异常机制,肿瘤细胞最显著的特点 生长失控和幼稚化（不分化） 细胞不进
13、入G0期，持续处于细胞周期,1细胞周期驱动机制失控 Cyclins过表达（Overexpression of cyclins） 多种肿瘤cyclinD1、cyclinE过表达 基因扩增 Cyclin D1（Bcl-1）过表达的主要原因 乳腺癌、胃癌、食管癌存在Cyclin D1基因扩增过度,染色体倒位（Chromosome inversion） Cyclin D1基因倒位于甲状旁腺启动子控制下 Cyclin D1蛋白合成 甲状旁腺腺癌 染色体易位（Chromosome translocation) Bcl-1 t(11:14) (q13:q32)易位 Cyclin D1受Ig重链基因增强子影响
14、 Cyclin D1表达,基因突变 Cyclin D1 T286突变 Cyclin D1泛素化受阻 Cyclin D1,【Cyclin D过表达致肿瘤机制】 Cyclin D 过表达 + 生长因子 CDKs瀑布效应 细胞增殖过度 易发生细胞癌变, CKI表达不足和突变 肿瘤细胞中常出现CKI表达不足或突变。 p16 InK4基因失活 突变或缺失、染色体易位、p16 InK4高度甲基化。,2. 细胞周期监控机制受损 (Impairment of checkpoint system) 主要原因：G1/S、G2/M检查点异常 失察结果：探测DNA损伤功能降低,（如发现不了DNA损伤，会导致基因缺失、
15、易位、染色体重排等）,DNA病毒: SV40、HPV、腺病毒等 P53蛋白失活,检测细胞增殖活性的常用方法,核分裂计数 高倍视野法（high power fields, HPF)： 400倍放大，10视野 单位面积核分裂像更具可比性 核分裂指数(mitotic index, MI) 显微镜目镜放置网格测微尺/计算机软件辅助分析,免疫组织化学法 Ki67抗体: 所测抗原只表达于G1、G2、M和S期细胞，不表达于G0期细胞,PCNA抗体(proliferating cell neuclear antigen) 36KD高度保守分子，是DNA多聚酶的辅助因子。不表达于G0期细胞 周期素A、B、C、D
16、和E，周期素依赖性激酶CDK检测 细胞增殖的辅助标记,DNA含量测定： 胸腺嘧啶标记（thymidine labelling) 溴脱氧鸟核甙掺入(bromodeoxyuridine incorporation) 放射性核素3H或32P标记胸腺嘧啶或鸟核苷加入培养的细胞液一段时间后，检测细胞的3H或32P的含量，从而了解细胞的DNA合成情况,流式细胞术（flow cytometry) 碘化丙锭（PI）可使细胞DNA和RNA同时染色，细胞经PI染色后，FCM分析可获得DNA直方图，该直方图可显示细胞周期中各期细胞（G0/G1 、S 、G2/M期)百分比,以5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdUrd) 掺和到DNA中，FCM检测BrdUrd的DNA掺入率可获得S期细胞的百分比 Feulgen染色后的MSP分析,嗜银核仁组织区法 NORs在控制核糖体RNA的基因转录方面有调节作用。 NORs含有高亲银酸性蛋白质, 可用银染法显示。 LM: 位于细胞核内或分裂细胞的染色体上， 直径0.5-1 m的黑色小点,