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1、脓汁和粪便标本中病原菌的检测专业： 学号： 姓名：一、实验目的探究检测其病原菌的类型并通过一系列的观察与鉴定从而确定其病原菌的名称和性质。在实践中学习培养基的制备、消毒和灭菌，细菌的分离与培养，细菌群体和个体形态特征的观察，细菌生化反应鉴定等技巧。从而掌握微生物实验的各种操作方法，培养对微生物实验的兴趣。 二、实验材料器材 打火机、油性笔、酒精灯、接种环、接种针、污物盘、普通冰柜、隔水式电热恒温培养箱、奥林巴斯CX21型生物显微镜、电炉、试管（带棉塞）、称量纸、药勺、牛皮纸、硫酸纸、橡皮筋、尺子、锥形瓶、高压蒸汽灭菌器、镊子、玻片、吸水纸、拭镜纸试剂药品 普通营养琼脂培养基、蒸馏水、脓汁标本、
2、粪便标本、石蜡油、生理盐水、结晶紫、卢戈碘液、95%乙醇、稀释复红、葡萄糖微量发酵管（2支）、乳糖微量发酵管（2支）、青霉素抗菌素纸片、链霉素抗菌素纸片、庆大霉素抗菌素纸片、血浆、福氏志贺菌诊断血清三、方法与步骤培养基制备细菌的分离培养细菌纯培养细菌的形态学检查细菌的生化试验细菌的血清学试验、结果分析实验论文撰写1、培养基制备干粉培养基蒸馏水加热溶化分装集中放在试管筐里罩上硫酸纸、牛皮纸 用橡皮筋扎好 放入讲台边的灭菌桶或灭菌筐内送到高压蒸汽灭菌室（洗刷室）灭菌（1）平板培养基：倾注平板10ml琼脂完全凝固后，平板倒放4冰箱保存备用。（2）斜面培养基：培养基趁热斜放琼脂凝固以后，4冰箱保存备用
3、。贴上标签后灭菌使用。2、空气与人体体表细菌学检查空气的细菌学检查每组1个营养琼脂平板，选择采样地点（实验室、卫生间或任选地点）将平板盖打开，盖朝下放置在平板旁边平板暴露于空气中15min平板倒扣盖上作标记37温箱培养24h观察结果。人体体表的细菌学检查甲乙常规洗手，丙丁标准洗手。甲和乙、丙和丁共用1个平板按规定在普通平板上接种手指上的细菌。第1格为洗手前，第2格为洗手后，第3格为消毒后，第4格空白对照。3、细菌的分离培养接种环烧灼灭菌分别取脓汁标本与粪便标本点在普通平板和依红美蓝平板上，各做两份，烧掉接种环上多余的标本冷却后，应用分区划线分离法，将脓汁标本接种于营养琼脂平板（2份），粪便标本
4、接种于伊红美蓝平板（2份）接种环烧灼灭菌将平板倒置37培养1824h观察结果 。4、细菌的群体生长特性观察和纯化培养接种环烧灼灭菌挑选平板上典型的四种单菌落（白色、黄色、紫黑色、粉红色）进行斜面接种纯培养做好标记接种环烧灼灭菌斜面培养基置于37培养过夜保存备用5、细菌的个体形态特征的观察革兰氏染色：取洁净载玻片用灭菌操作后的接种环取生理盐水1-2环于玻片上挑取细菌培养物少许与盐水轻轻抹匀待涂片干燥后在酒精灯火焰外侧快速来回2-3回合结晶紫初染1min水洗卢戈碘液媒染1min水洗95乙醇脱色约20s水洗稀释品红复染1min水洗吸干,镜检。肉汤接种法:接种环烧灼灭菌分别在斜面培养物中挑取菌苔少许立
5、即移入肉汤培养基管中在接近液面的管壁上轻轻研磨沾取少量肉汤调和混匀试管口通过火焰2-3次灭菌塞好棉塞35培养46h6、药敏试验接种环烧灼灭菌分别取之前实验中得到的四种菌液在普通平板密集涂布接种环烧灼灭菌 标记:青、链、庆 镊子火焰消毒贴青霉素、链霉素、庆大霉素纸片 按压镊子消毒倒置37培养1824h 观察结果7、血浆凝固酶试验取干净玻片一张在左右两边分别滴加兔血浆1-2滴，生理盐水1滴接种环烧灼灭菌冷却分别用接种环取之前实验所得到的白色和黄色菌苔(23个菌落的菌量)与血浆研磨混合边混匀边观察结果接种环烧灼灭菌稍等片刻，观察结果8、糖发酵试验接种针烧灼灭菌用灭菌接种针分别刮取实验所得到的紫黑色和
6、粉红色菌苔分别接种在葡萄糖发酵微量管中和乳糖发酵微量管内接种环烧灼灭菌将微量管平放在平板内37培养过夜后观察结果。9、动力试验接种针烧灼灭菌分别用接种针在紫黑色和粉红色的斜面取菌从半固体培养基中心垂直刺入，可刺达近底管处，但不要到达管底循原来的路线退出接种针试管口迅速通过火焰2-3次灭菌塞好棉塞烧灼灭菌接种针37培养24h观察结果10、血清学实验取洁净的载玻片一张将磨面近端设为对照区滴加生理盐水15ul远端设为试验区滴加福氏志贺菌诊断血清15ul接种环烧灼灭菌用接种环分别取粉红色菌苔研磨于盐水或血清内，混合均匀接种环烧灼灭菌载玻片来回倾侧观察结果四、结果与讨论对脓汁中细菌的分析讨论1、用普通平
7、板，从脓汁标本中分离出金黄色和白色两种菌落。2、在显微镜下观察时，这两种细菌均为G+球菌，排列不规则，呈葡萄串状，是典型的葡萄球菌。3、结合菌落的颜色，可以初步断定，这是金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌。4、通过血浆凝固酶试验，观察到黄色菌落的细菌能使血浆产生颗粒性物质，说明为凝固酶阳性；白色菌落则没有凝集反应，说明其为凝固酶阴性。5、最后进行的是药敏试验，从培养基上可以观察到，不同的抗生素所形成的抑菌圈不同。其中青霉素对金黄色葡萄球菌最敏感。对粪便中细菌的分析讨论1、用伊红美蓝平板分离菌落时，可以从粪便标本中分离出紫黑色具有金属光泽的菌落和粉红色半透明菌落。2、在显微镜下观察时，这两种菌均为G-杆菌，排列不规则，从形态上不能鉴别是什么细菌。3、经糖发酵试验，可以观察到，紫黑色的细菌能使葡萄糖和乳糖的试管变色和产生气体；粉红色的细菌只能使葡萄糖的试管变色。4、经半固体动力试验，观察到紫黑色的细菌使半固体培养基成浑浊状态，粉红色的细菌只在接种针插入的方向聚集。5、综上所述，紫黑色的细菌为大肠埃希菌，粉红色的细菌为志贺菌。6、最后进行药敏试验时，发现大肠埃希菌对青霉素不敏感，对庆大霉素和链霉素都敏感。综上所述，脓汁标本中分离得黄色菌落为金黄色葡萄球菌，白色菌落为白色葡萄球菌，致病菌为金黄色葡萄球菌；粪便标本中分离得紫黑色菌落为大肠埃希菌，粉红菌落为福氏志贺菌，致病菌为福氏志贺菌。