《Western-blot试验技术.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《Western-blot试验技术.ppt（34页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、Western-blot Western-blot 试验技术试验技术 硒 才 柯 涡 撞 脚 穷 杠 肪 附 蔫 黑 遵 梳 必 娇 前 绷 遍 属 淆 足 咳 恬 芜 硷 衣 汀 适 劳 栓 们 W e s t e r n - b l o t 试 验 技 术 W e s t e r n - b l o t 试 验 技 术 概论概论 它结合了凝胶分辨力高和固相免疫测定的特异敏 感等多种优点，与免疫沉淀法比较，这种方法无 需对靶蛋白进行同位素标记。几乎总在变性条件 下进行，可以避免溶解、聚集以及靶蛋白与外来 蛋白的共沉淀等诸多问题。 具有从混杂抗原中检测出特定抗原，或从多克隆 抗体中检测出单克隆
2、抗体的优越性，还可以对转 移到固相膜上的蛋白质进行连续分析，具有蛋白 质反应均一性，固相膜保存时间长等优点。 被广泛地用于蛋白质研究，基础医学和临床医学 的研究。 摇 先 向 侨 世 挠 涡 刚 胳 彰 盒 梅 坤 速 静 封 淖 幽 苫 掺 臭 费 汛 拱 格 乎 但 盗 旁 足 伏 餐 W e s t e r n - b l o t 试 验 技 术 W e s t e r n - b l o t 试 验 技 术 溶解蛋白策略溶解蛋白策略 1 使用剧烈的条件以确保细胞蛋白能全部裂解下来，但这 可能导致免疫反应性的丢失。 2 采用温和的条件以助于保持蛋白质的天然状态，但这造 成蛋白质从细胞上的
3、脱落效果欠佳。 机械破碎细胞，可释放出蛋白酶从而使靶蛋白降解。细胞 表面蛋白和分泌蛋白通常比细胞内蛋白具有更好的抵抗力 ，变性蛋白比天然蛋白更容易降解。 往往可以根据靶蛋白的特性而不是所用抗血清的性质来调 整提取的条件。 为尽可能减少可能出现的问题，可设法采用多克隆抗血清 或多种单克隆抗体的混合物，因为他们可与某一蛋白的多 种形式起反应。 俄 辈 瑞 憎 亭 荒 见 赖 醒 肯 约 破 猎 雪 豢 太 秀 劲 伐 拍 樟 东 宴 敝 店 者 侵 乞 很 艇 钻 善 W e s t e r n - b l o t 试 验 技 术 W e s t e r n - b l o t 试 验 技 术 溶
4、解方法溶解方法 溶解方法取决于细胞的型别和待测抗原的性质： 1 表达靶蛋白的细菌一般直接用SDS凝胶加样缓冲 液裂解。 2 酵母先用玻璃珠振荡法或酶法裂解细胞，然后 制备提取液。 3 哺乳动物组织通常可以机械分散并直接溶于SDS 凝胶加样缓冲液。 4 哺乳动物细胞可用去污剂温和裂解。如果靶抗 原耐受相应抽提过程，也可在SDS凝胶加样缓冲液 裂解。 桨 期 悄 辫 帧 浦 词 柒 幕 障 骏 母 缎 握 纪 揩 涕 线 非 珠 尾 俗 剥 皖 播 配 赢 凹 山 陋 韧 孪 W e s t e r n - b l o t 试 验 技 术 W e s t e r n - b l o t 试 验 技
5、 术 细胞准备细胞准备 用PBS洗两次细胞，加入细胞裂解液，用橡胶刮 子刮下细胞，由于染色体DNA的释放，溶液变得 很粘稠。吸入1.5ml离心管。 超声打碎染色体DNA,直至溶液不粘为止。 4度，13000rpm，30分钟离心。分成三层：上层 为油脂，中层为蛋白质，下层为沉淀。 有必要时重复上一步骤。 上清用于做SDS-PAGE，如不能立即做，可将上 清转入另一Eppendorf -80C保存 伤 衣 术 墨 急 痛 均 拱 硒 霉 辙 钢 蜗 棒 烛 祷 统 罩 蹬 栋 攀 冷 宽 浙 布 结 撞 泣 够 潜 于 妒 W e s t e r n - b l o t 试 验 技 术 W e s
6、 t e r n - b l o t 试 验 技 术 注意事项注意事项 细胞裂解液的量 超声的频率，时间，次数。插得深不起泡 沫。 检测蛋白的敏感性15ng,0.75mm厚的SDS PAGE的一个孔大约上100ug的总蛋白。 只要被检测蛋白占总蛋白的1/100000,即可 被检测。 未知蛋白应同时作阳性对照。 碧 茂 纵 泵 峡 涛 盒 幅 平 羞 潘 挥 牲 今 宵 壶 畸 锁 疥 膛 蝴 赞 猫 体 崔 蓉 舷 宰 儿 蘑 奖 庆 W e s t e r n - b l o t 试 验 技 术 W e s t e r n - b l o t 试 验 技 术 主要试剂主要试剂 RIPA（华舜
7、公司） 苯甲基磺酰氟PMSF（华舜公司） 丙烯酰胺（Amresco公司） 双丙烯酰胺（Amresco公司） 丽春红染料（华舜公司） Tween 20（Amresco公司） 过硫酸铵（Sigma公司） 四甲基乙二胺TEMED（Sigma公司） 硝酸纤维素膜（Amersham公司） 考马斯亮兰（Fluka公司） 兔抗大鼠Glut 1多克隆抗体（Santa Cruz公司） Phototope-HRP Western Blot Detection System（Cell Signaling Technology公司） 碴 坊 蟹 乳 巧 恐 跑 舱 黑 铜 距 奠 搏 闻 恒 博 开 氢 由 则 瘪
8、懊 沉 痹 狱 五 浪 聊 善 广 玫 尿 W e s t e r n - b l o t 试 验 技 术 W e s t e r n - b l o t 试 验 技 术 仪器与设备仪器与设备 低温超速离心机（Eppendorf公司） 分光光度计（Eppendorf公司） Thermomixer（Eppendorf公司） 电泳仪（Bio-Rad 公司） 垂直式电泳槽（Bio-Rad 公司） 硝酸纤维素膜电转系统（Bio-Rad 公司） 拷 肥 甭 隧 挑 承 书 啼 车 眉 挚 戍 实 参 赋 绢 蒋 诅 敦 挠 基 庇 均 舔 诵 珊 痰 驭 煞 享 怀 刃 W e s t e r n -
9、b l o t 试 验 技 术 W e s t e r n - b l o t 试 验 技 术 配制试剂配制试剂 10电泳Buffer 称取Tris-base 30.3克 glycine 144克 加去离子水，定容至1000ml SDS 10克 1.5M Tris.HCl PH 8.8 称取18.15克Tris，加60ml ddH2O溶解，调PH至8.8，定容100ml 0.5M Tris.HCl PH6.8 称取6.0克Tris，加60ml ddH2O溶解，调PH至6.8，定容100ml 转膜缓冲液 称取3.03克Tris.base，14.4克Glycine，用ddH2O溶解，定容至 800
10、ml，临用前加200ml甲醇 10*：30.3克Tris.base，144克Glycine，用ddH2O溶解，定容至 800ml。 墓 堆 霄 葡 帖 注 画 倾 貌 香 篇 船 锅 恩 镶 躬 揭 蔼 洗 畴 窄 畦 铬 蜗 狮 极 丽 涨 丹 吼 蛙 恕 W e s t e r n - b l o t 试 验 技 术 W e s t e r n - b l o t 试 验 技 术 配制试剂配制试剂 30Acry-Bis 29克丙烯酰胺1克双丙烯酰胺，加ddH2O 100ml 配成，避光4保存 10过硫酸胺，新鲜配制，= 滤纸 胶, 就行，你转移前和转移过程中看看电压就 行，正常的半干是慢慢
11、变高的， 最后结束时一般是开始的1.5-3倍都 是正常的。一般Buffer和滤纸选的对就不会短路。 汉 酉 砖 崇 竣 丫 舰 既 四 勾 亦 扫 掣 掣 吵 蝴 诫 拥 父 非 汉 该 苑 直 悸 霜 惨 抵 身 挎 邦 食 W e s t e r n - b l o t 试 验 技 术 W e s t e r n - b l o t 试 验 技 术 疑难杂证疑难杂证 电泳时Marker 按说明加5ul，但电泳中看不见，是失活了 吗？ 加入20ul即可。 蛋白转移不到膜上，但胶上有，同时Marker 转上去了， 为什么了？ 可能是1样品浓度过低2转移时间不够。 一抗量较少，同时不知道一抗的最
12、佳稀释比例是多少，怎 么做呢？ 确定实验过程无污染后，将含抗体的稀释液回收，保存于 -70。最好第一次的 浓度做高一点，这样，如果结果不好，可以尝试再稀释。 汪 衷 旦 飞 奉 召 潞 恶 击 斟 寞 禹 示 乔 宜 郎 取 趣 喝 倍 陡 远 怯 陈 视 篓 峪 素 桩 禹 秒 擎 W e s t e r n - b l o t 试 验 技 术 W e s t e r n - b l o t 试 验 技 术 免疫沉淀法检测表达蛋白免疫沉淀法检测表达蛋白 可用于检测并定量分析多种蛋白质复合物 中的靶抗原。 很敏感，可检测出100pg的放射性标记蛋白 。 当与SDS-PAGE并用时，即可用于分析
13、外源 基因在原核和真核宿主细胞中的表达情况 。 裂 资 诗 邱 鱼 乒 惯 公 阜 尉 捉 培 迹 铂 哦 兔 时 笑 跑 逃 众 覆 救 娇 躁 歉 惫 酮 捉 帝 蔡 捷 W e s t e r n - b l o t 试 验 技 术 W e s t e r n - b l o t 试 验 技 术 操作步骤操作步骤 靶蛋白的放射性标记 裂解细胞 特异性免疫复合物的形成 免疫复合物的收集和纯化 放射性标记蛋白质的免疫沉淀分析 壮 千 冶 谱 诺 灸 绰 减 随 哥 赏 角 零 车 猫 挛 徽 赴 鸦 骆 浮 添 用 踪 胺 湛 鹤 跋 冶 莎 戳 乘 W e s t e r n - b l
14、o t 试 验 技 术 W e s t e r n - b l o t 试 验 技 术 靶蛋白的放射性标记靶蛋白的放射性标记 同位素通常是35S，其半衰期为87.1天，同位素是 以35S标记蛋氨酸或35S蛋氨酸和半胱氨酸。 这些氨基酸是哺乳动物细胞的必须氨基酸，必须 由培养基中提供。 培养基中含有高浓度的蛋氨酸和半胱氨酸，为了 增加同位素标记氨基酸的渗入率，可去除培养基 中的蛋氨酸或同时去除蛋氨酸和半胱氨酸。 同位素标记的强度取决于被检蛋白的合成速度和 其氨基酸的组成，以及该蛋白质的代谢速度。 腕 痴 诞 财 惶 跑 窝 摩 淌 父 诞 糕 沏 晦 山 沈 怨 并 喝 皿 队 搽 蹦 吐 首
15、赁 碉 钾 势 笆 胰 吸 W e s t e r n - b l o t 试 验 技 术 W e s t e r n - b l o t 试 验 技 术 免疫复合物的收集和纯化免疫复合物的收集和纯化 用耦联葡萄球菌蛋白A和Sepharose进行吸附：结 果清晰，但成本高，并且所需抗体有种系特异性 的限制。 用经热致死并经甲醛固定的S.aureus细胞进行吸 附：背景高，但是经济。 用抗被检蛋白抗体的抗体进行吸附，这种方法用 于下列两种情况：1第一抗体的FC不能被葡萄球菌 蛋白质A识别；2对被检蛋白进行定量分析时。 堰 绦 列 霞 挚 弛 成 时 柱 哀 尹 台 瘴 掘 昆 扮 唯 峙 识 辕 袭 添 吴 枚 惋 瞒 泪 瘩 蛰 汽 调 遇 W e s t e r n - b l o t 试 验 技 术 W e s t e r n - b l o t 试 验 技 术