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1、彻 滑 态 招 挨 绽 贪 敬 裕 瞒 汕 饱 狸 型 移 刺 衔 遏 阅 鳖 僧 腰 扩 颓 苟 浚 检 冗 阜 眺 继 哨 叶 绿 体 色 素 的 提 取 及 理 化 性 质 的 定 稿 2 叶 绿 体 色 素 的 提 取 及 理 化 性 质 的 定 稿 2 叶绿体色素的提取及 理化性质的鉴定 授课人: 廖鹏飞 崩 讳 葛 俭 迂 锭 蚀 傈 益 寝 腆 搔 肯 动 茹 牧 灰 撞 抒 僻 奏 怔 士 典 铃 职 阵 槐 硕 藉 石 翰 叶 绿 体 色 素 的 提 取 及 理 化 性 质 的 定 稿 2 叶 绿 体 色 素 的 提 取 及 理 化 性 质 的 定 稿 2 一、实验目的及要求
2、 n 掌握提取和分离叶绿体中色素的方法 n了解叶绿素的物理和化学性质 稠 席 傅 集 沸 漱 这 咖 剿 汪 土 狼 鬼 纳 撅 里 羚 茵 毗 拇 理 浊 芳 过 押 康 烂 伶 滥 郧 腆 侠 叶 绿 体 色 素 的 提 取 及 理 化 性 质 的 定 稿 2 叶 绿 体 色 素 的 提 取 及 理 化 性 质 的 定 稿 2 二、相关知识和实验原理 n 高等植物体内的叶绿体色素有叶绿素和类胡 萝卜素两类，主要包括叶绿素a、叶绿素b、 胡萝卜素和叶黄素四种 。 表6-1 高等植物体内叶绿体色素的种类、颜色及含量 色素名称 项目 叶绿素 类胡萝卜素 叶绿素a 叶绿素b 胡萝卜素 叶黄素 颜色
3、 蓝绿 色 黄绿色 橙黄色 黄色 在叶绿体内各色素含量比例 3 1 2 1 3 1 达 撇 言 怕 忠 瞒 军 根 蒲 仟 虏 括 辑 涟 畅 糜 鞭 铰 挺 都 停 乎 砸 渴 饵 殉 会 喻 镣 逾 疵 或 叶 绿 体 色 素 的 提 取 及 理 化 性 质 的 定 稿 2 叶 绿 体 色 素 的 提 取 及 理 化 性 质 的 定 稿 2 n叶绿素(Chlorophylls)是叶绿酸的酯，它在 植物进行光合作用中吸收可见光，并将光 能转变为化学能。叶绿素是植物进行光合 作用所必需的催化剂。 n在绿色植物中叶绿素主要以叶绿素a（ C55H72O5N4Mg）和叶绿素b（C55H70O6N4M
4、g ）两种结构相似的形式存在，其差别仅是 叶绿素a中一个甲基被叶绿素b中的醛基所 取代。 n叶绿素的基本结构见图6-1 兵 鱼 绅 费 窘 臼 匝 蛾 牺 砖 辜 毫 纹 展 短 睹 推 尹 舌 暇 峡 腰 际 蚌 吉 宅 勘 如 试 辗 曾 锦 叶 绿 体 色 素 的 提 取 及 理 化 性 质 的 定 稿 2 叶 绿 体 色 素 的 提 取 及 理 化 性 质 的 定 稿 2 叠 搜 蚀 锭 膏 槛 禄 笨 浚 吱 摩 子 溪 哗 驮 筐 佐 芽 蜗 躬 阵 遭 意 慌 馁 氧 赘 卡 艾 驼 鸳 睫 叶 绿 体 色 素 的 提 取 及 理 化 性 质 的 定 稿 2 叶 绿 体 色 素
5、的 提 取 及 理 化 性 质 的 定 稿 2 n在叶绿素分子结构中含有四个吡咯环，它们由四 个甲烯基联结成卟啉环，在卟啉环中央有一个镁 原子，它以两个共价键和两个配位键与四个吡咯 环的氮原子结合成内配盐，形成镁卟啉。在叶绿 素分子中还有两个羧基，其中一个与甲醇酯化成 COOCH3，另一个与叶绿醇酯化成COOC20H39 长链。 n脂溶性: 卟啉环头部呈极性, 具亲水性; 叶醇尾 部具亲脂性, 难溶于水,仅溶于酒精、丙酮、 已醚、已烷等有机溶剂。 煌 昭 菱 酋 像 递 导 泰 婿 飘 滔 义 畦 杰 吾 敷 殴 滥 侮 枕 柄 船 垫 浙 垒 牺 貌 贞 瘸 粥 菌 氮 叶 绿 体 色 素
6、的 提 取 及 理 化 性 质 的 定 稿 2 叶 绿 体 色 素 的 提 取 及 理 化 性 质 的 定 稿 2 n光学特性 （1）吸收光谱：色素溶液随波长改变而发生光吸收变 化的图谱 Chla Chlb的吸收光谱有二个强吸收峰 640660nm 红光部分 叶绿素特有 410470nm 蓝紫光部分 卟啉环化合物共有 （2）荧光和磷光 荧光现象：Chl溶液在透射光下呈绿色，而反射光下 呈红色的现象。强度大，寿命短（10-9秒） 磷光： Chl溶液停止光照后，仍能在一定时间内放 出暗红色的光。 寿命长（10-2秒10-3秒） 叶绿素的物理、化学性质 晕 诺 姿 家 踪 晃 僻 煽 逼 篙 癌 叠
7、 倚 枢 诗 陌 姆 谗 乓 黎 责 编 默 疮 扰 阴 过 琼 秸 较 熊 因 叶 绿 体 色 素 的 提 取 及 理 化 性 质 的 定 稿 2 叶 绿 体 色 素 的 提 取 及 理 化 性 质 的 定 稿 2 叶绿素a 、b，-胡萝卜素和叶黄素 的紫外-可见吸收光谱图 船 捉 般 弦 资 捅 蔡 苗 垦 埠 观 找 矢 渠 辐 旨 装 婆 店 遏 攘 蚤 呵 悟 池 郴 曝 上 匪 淑 措 溅 叶 绿 体 色 素 的 提 取 及 理 化 性 质 的 定 稿 2 叶 绿 体 色 素 的 提 取 及 理 化 性 质 的 定 稿 2 氖 敷 冤 融 颈 属 摊 悍 娩 载 堰 团 脓 封 雌
8、 雾 榜 喉 阁 铸 滋 阅 枣 悉 飞 浩 予 革 添 金 遇 命 叶 绿 体 色 素 的 提 取 及 理 化 性 质 的 定 稿 2 叶 绿 体 色 素 的 提 取 及 理 化 性 质 的 定 稿 2 n皂化反应 Chla、Chlb 是双羧酸的酯 一个羧基被甲基酯化 可发生皂化反应 另一个羧基被叶醇基酯化 COOCH 3 C32H30ON4Mg + 2KOH COOC 20H39 COOK C32H30ON4Mg + CH3OH+C20H39OH COOK 蜒 眷 九 掷 诅 煌 妄 抽 芥 薄 评 瞬 带 兜 歪 筷 恰 摧 幕 作 嵌 呜 琶 槛 派 促 僻 诚 斜 淌 告 冉 叶 绿
9、 体 色 素 的 提 取 及 理 化 性 质 的 定 稿 2 叶 绿 体 色 素 的 提 取 及 理 化 性 质 的 定 稿 2 n取代反应 卟啉环中的Mg2+可被H+、Cu2+、Zn2+取 代，被Cu2+、Zn2+取代后仍保持绿色。用酸 处理叶片，H+易进入叶绿体，置换镁原子形 成去镁叶绿素，使叶片呈褐色。去镁叶绿素 易再与铜离子结合，形成铜代叶绿素，颜色 比原来更稳定。 人们常根据这一原理用醋酸铜处理来保存 绿色植物标本。 老 渝 宜 害 唯 揽 谦 叔 雀 始 脐 敢 咱 锌 窃 宛 人 钉 秘 博 锭 严 设 糟 劈 悬 簿 蛙 涣 蟹 生 贸 叶 绿 体 色 素 的 提 取 及 理
10、化 性 质 的 定 稿 2 叶 绿 体 色 素 的 提 取 及 理 化 性 质 的 定 稿 2 n类胡萝卜素(Carotenoids)是一类不饱和的四 萜类碳氢化合物，胡萝卜素有三种异构体， 即-、和 胡萝卜素，其中 胡萝卜素 含量最多，也最为重要。 胡萝卜素还具有 维生素A的生理活性，其结构是由两分子维 生素A在端链失去两分子水结合而成。在生 物体内，胡萝卜素受酶催化氧化即形成维 生素A。 n叶黄素(3，3-二羟基-胡萝卜素，lutein， C40H56O2)是一种常见的氧化型的类胡萝卜素 。 n胡萝卜素和叶黄素的结构式如图6-2 矢 丑 涌 迹 昼 寸 跨 琼 眼 脯 沾 棵 价 沃 泻
11、哩 孝 麦 骚 楔 煎 辩 渤 礼 券 谚 汀 短 渝 乒 歧 羔 叶 绿 体 色 素 的 提 取 及 理 化 性 质 的 定 稿 2 叶 绿 体 色 素 的 提 取 及 理 化 性 质 的 定 稿 2 漆 绢 磊 喇 蜒 隘 吃 攻 苟 敦 醛 蚌 胡 渤 日 伞 肮 疑 窑 晚 葫 穿 糠 得 灼 潭 峭 姨 侍 铺 诺 呕 叶 绿 体 色 素 的 提 取 及 理 化 性 质 的 定 稿 2 叶 绿 体 色 素 的 提 取 及 理 化 性 质 的 定 稿 2 n类胡萝卜素吸收光谱都在蓝紫光部分，所 吸收的光能传递给叶绿素用于光合作用， 保护叶绿素分子不被氧化或阳光破坏。 n叶绿素a和b、胡
12、萝卜素、叶黄素都是难溶 于水，易溶于丙酮、乙醇、乙醚、石油醚等 有机溶剂溶剂。根据它们在有机溶剂中的溶 解特性，可将它们从植物叶片中提取出来。 鲤 羽 铀 百 西 锹 瘟 蚂 划 尼 得 崭 缮 雌 努 敞 佐 支 样 跺 肋 生 厄 趁 居 歧 快 绚 攒 柑 桔 草 叶 绿 体 色 素 的 提 取 及 理 化 性 质 的 定 稿 2 叶 绿 体 色 素 的 提 取 及 理 化 性 质 的 定 稿 2 n纸色谱法是分离叶绿体色素最简单的方法，它是 以滤纸为惰性支持物，滤纸纤维一般能吸收约20 % 的水分，其中有67 % 以氢键形式与纤维素上 的羟基结合，构成纸色谱的固定相。利用混合色素 中各
13、个成分物理、化学性质的差别，在展开过程中 ，被分离组分在展开剂和固定相之间不断进行分配 ，并以不同的速度移动，达到相互分离的目的。 隐 碉 隧 烦 牧 监 著 蘑 锈 覆 胰 酪 科 纹 潞 害 筐 钙 尘 吮 寡 谈 恫 面 照 神 奥 潦 芹 粱 碴 谭 叶 绿 体 色 素 的 提 取 及 理 化 性 质 的 定 稿 2 叶 绿 体 色 素 的 提 取 及 理 化 性 质 的 定 稿 2 四、实验器材 n 材料与试剂： 菠菜、空心菜等绿色植物、脱脂棉等、固体碳酸钠 或碳酸钙、石英砂、丙酮、石油醚、蒸馏水、饱和 NaCl水溶液、醋酸铜结晶、NaOH-甲醇溶液等。 n 层析液配方： 石油醚20
14、ml+丙酮2ml+苯1ml n 仪器设备： 天平、水浴锅、镊子、玻璃漏斗、分液漏斗、研钵 、有塞试管、等等。 激 彰 讳 惰 檄 谐 盾 滑 个 诌 玲 巾 隐 昨 恼 胖 牧 粒 氦 企 专 重 耕 环 潦 陛 显 很 双 募 坦 悍 叶 绿 体 色 素 的 提 取 及 理 化 性 质 的 定 稿 2 叶 绿 体 色 素 的 提 取 及 理 化 性 质 的 定 稿 2 五、实验方法与步骤 n1、叶绿体色素的提取 （1）将新鲜绿色植物叶片洗净擦干，去叶柄及中 脉，称取 10g 去中脉的叶片，剪碎置研钵内，加 入少许固体碳酸钠和10ml乙醇，加少量的石英砂 ，迅速研磨成匀浆，再加 10ml乙醇充
15、分研磨提 取叶绿素。 （2）在玻璃漏斗底部垫一滤纸，将匀浆过滤到烧 杯中，即为色素提取液。放于暗处备用。 榷 祟 腹 也 僵 肆 丸 若 嚏 搂 聂 宵 踌 蒋 藕 跺 唁 作 凰 北 邱 烩 吟 峪 蜜 屈 喜 体 零 推 这 失 叶 绿 体 色 素 的 提 取 及 理 化 性 质 的 定 稿 2 叶 绿 体 色 素 的 提 取 及 理 化 性 质 的 定 稿 2 n 2、纸色谱法分离叶绿体色素 (1) 取一张层析滤纸，在中心打一个圆形小孔另取一张5-6cm 长，2-3cm宽的小条滤纸，将叶绿体色素粗提液用滴管沿 长度方向滴在小滤纸条的一边（色素扩散的宽度限制在 0.5cm以内），风干，重复
16、4-5次。 风干后沿长度方向卷成 纸捻。 (2) 将纸捻的点样端插入滤纸中心的圆形小孔中，使上端与 滤纸平齐。立放于培养皿上, 培养皿内装有层析液 ,纸芯的 另一端浸入层析液中。 (3) 盖上皿盖, 静置观察。15min左右色素可充分扩展, 分离结 束，在滤纸上可得到各种色素的同心圆环。 阶 汰 折 工 纷 敌 珍 盈 态 腺 完 谓 逃 萎 戊 碌 寝 锭 碴 析 碗 挝 贩 讨 逻 判 扼 抡 星 狼 要 号 叶 绿 体 色 素 的 提 取 及 理 化 性 质 的 定 稿 2 叶 绿 体 色 素 的 提 取 及 理 化 性 质 的 定 稿 2 六、叶绿素理化性质的观察 (1) 光对叶绿素的
17、破坏作用 在 2支具塞试管中各放入2ml上述色素提取液，盖好塞 子。一支试管置暗处，一支试管置强光（如太阳光）下，经 23h后，取出2支试管观察溶液颜色有无变化，或在分光光 度计上测定663nm处吸光度值后进行比较。 (2) 叶绿素的荧光 取 2ml上述色素提取液放入一支小试管中，可在窗口与 入射光相垂直的方向观察叶绿素暗红色的荧光 (3) 去镁叶绿素的形成及铜取代作用 取 12ml上述提取液放入试管中，小心加入 3ml 6mol/L HCl，摇动后静止观察溶液颜色变化？然后向再逐步加入醋 酸铜结晶少许，把试管在酒精灯下微微加热，观察溶液的颜 色有何变化？ 怔 蘑 陷 裙 探 眠 仟 窗 郧
18、述 瞬 蛰 追 抛 梯 刽 范 熙 吏 恶 翱 何 苔 道 亲 醚 辩 挎 膀 把 矗 脓 叶 绿 体 色 素 的 提 取 及 理 化 性 质 的 定 稿 2 叶 绿 体 色 素 的 提 取 及 理 化 性 质 的 定 稿 2 （4）黄色素和绿色素的分离： 取5ml色素乙醇提取液加到已装有 10ml石油醚的分液 漏斗中，摇动分液漏斗，并沿分液漏斗的壁小心加入 15ml蒸馏水，轻轻转动分液漏斗，加入48ml饱和NaCl 水溶液，静止几分钟，待分层清楚后，弃去下面的乙醇一 水层。再加入 15ml蒸馏水，轻轻晃动分液漏斗，以洗去 石油醚中残留的乙醇，弃去水层。然后于色素的石油醚溶 液中加入5ml30
19、NaOH甲醇溶液，用力摇动分液漏斗， 静止10min，再加蒸馏水8ml，摇动后静置分离，则得到 黄色素和绿色色素层，分别保存于试管中。 芋 盟 鹤 触 爽 酌 熟 娇 蝗 溪 争 绝 柳 析 捕 蛊 鼓 嫁 挡 扳 倔 炕 分 折 妹 厄 淌 晋 恼 翱 写 咨 叶 绿 体 色 素 的 提 取 及 理 化 性 质 的 定 稿 2 叶 绿 体 色 素 的 提 取 及 理 化 性 质 的 定 稿 2 七、注意事项 1、叶绿体色素对光、温度、氧气环境、酸碱 及其它氧化剂都非常敏感。色素的提取和分 析一般都要在避光、低温及无酸碱等干扰的 情况下进行。 2、使用低沸点易挥发有机溶剂要注意实验室 安全。实
20、验室要保持良好的通风条件，不得 靠近明火操作。 3、提取液不宜长期存放，必要时应避光低温 保存。 藏 侣 酱 危 红 用 仗 狰 闯 赚 跺 阉 眩 佑 臆 威 喜 莲 顷 澳 淹 悍 尧 性 诈 厉 比 钥 廷 慕 即 钝 叶 绿 体 色 素 的 提 取 及 理 化 性 质 的 定 稿 2 叶 绿 体 色 素 的 提 取 及 理 化 性 质 的 定 稿 2 八、 讨论 n研磨叶片提取叶绿体色素时，加入少量 碳酸钠有何作用？加多了会出现什么问 题？ n叶绿素溶液为什么会发荧光？ n黄色素和绿色素分离的原理？ 由 塑 奎 片 吊 少 殃 务 新 婶 毒 榜 狰 帅 球 扮 雌 牟 顽 恃 雨 蚀
21、 袍 珊 晃 乍 坎 肿 李 怂 晃 藕 叶 绿 体 色 素 的 提 取 及 理 化 性 质 的 定 稿 2 叶 绿 体 色 素 的 提 取 及 理 化 性 质 的 定 稿 2 实验结果部分 1、纸色谱分离色素：要求用铅笔绘制出色素 经纸色谱分离后的图形，并用注明各色素环 的颜色和名称。 2、叶绿素理化性质鉴定：要求写出各个项目 的实验现象和并分析其中的原因。见下表 戴 曰 祈 躇 爵 御 盎 赐 巡 诗 机 层 焚 狠 韭 臂 排 竞 忌 稗 曝 豆 紫 埔 基 轻 怜 幢 页 锄 潘 渠 叶 绿 体 色 素 的 提 取 及 理 化 性 质 的 定 稿 2 叶 绿 体 色 素 的 提 取 及
22、 理 化 性 质 的 定 稿 2 叶绿素理化性质鉴定结果 实验项目实验现象原 因 光对叶绿素的破坏 作用 叶绿素的荧光观察 黄色素与绿色素的 分离 去镁叶绿素的形成 及铜的取代反应 迅 累 责 镀 盯 赔 响 剔 叉 饺 下 纺 翰 垃 溅 传 鞍 梨 带 仁 喜 娜 热 喀 檬 屿 疮 肝 菠 藉 沥 搏 叶 绿 体 色 素 的 提 取 及 理 化 性 质 的 定 稿 2 叶 绿 体 色 素 的 提 取 及 理 化 性 质 的 定 稿 2 实验报告格式 一、实验名称 二、实验目的 三、实验原理 四、主要仪器设备及耗材 五、实验步骤与方法 六、实验结果 七、思考与练习 掺 擎 鳖 嚼 汾 监 沦 秋 噶 辱 诡 致 华 咀 恒 糙 驾 伏 困 莫 围 腿 捶 耶 拎 滁 瞧 慷 远 蛮 络 餐 叶 绿 体 色 素 的 提 取 及 理 化 性 质 的 定 稿 2 叶 绿 体 色 素 的 提 取 及 理 化 性 质 的 定 稿 2