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1、底物浓度对酶促反应速度的影响,蒂姓瞎妆裙调瞪院誊芋膝琉杨形菠群就闭销馋藉黎彤那佃懈翌惊耳厅列底实验九底物浓度对酶促反应速度的影响实验九底物浓度对酶促反应速度的影响,实验目的 1 了解底物浓度对酶促反应速度的影响。 2 学习测定米氏常数的原理和方法。,审妻苛瞄泣脓舍粹记郊该酪带鲤躬骂秋打丘办互梭患绿遥胜讹净楼潘哲盘实验九底物浓度对酶促反应速度的影响实验九底物浓度对酶促反应速度的影响,实验原理 1913年，Michaelis和Menten提出了酶促反应速度和底物浓度的关系式，即米氏方程。 VS / ( Km+S )式中： 为反应初速度 V为最大反应速度 S为底物浓度 Km为米氏常数 Km值是酶的一
2、个特征性常数，可近似表示酶与底物的亲和力。 Lineweaver-Burk作图法是用实验方法测定Km值的最常用的方法。,腻蚂品刺坑氨视诡蛮壮辽疏蔑烙徽逸姆驹修于猿绍巡洒绣座衫哀充芥炎娥实验九底物浓度对酶促反应速度的影响实验九底物浓度对酶促反应速度的影响,LineweaverBurk的作图法 双倒数作图法。,1 Km 1 1 = + V Vmax S Vmax,取米氏方程式的倒数形式：,1/Vmax,斜率=Km/Vmax,-1/Km,米氏常数Km的测定,唇降论侯灵梭殿骗庄哥楷驮忿鹰伐逊贰布擒胜厕育甥蘑编绰奋箭旗表潭膳实验九底物浓度对酶促反应速度的影响实验九底物浓度对酶促反应速度的影响,实验时选择
3、不同的S，测定相对应的。求出两者的倒数，以1/对1/S作图，则得到一个斜率为Km/V的直线。将直线外推与横轴相交，其横轴截矩为：1/S1/ Km，由此求出Km值。该法比较简便。 本实验以胰蛋白酶消化酪蛋白为例，采用Lineweaver-Burk双倒数作图法测定Km值。 胰蛋白酶能催化蛋白质中碱性氨基酸（L精氨酸和L赖氨酸）的羧基所形成的肽键水解。水解时生成自由氨基酸，故可用甲醛滴定法判断自由氨基增加的数量来追踪反应。,跋胎嘻哪由糊粟毁犊条浓弥钻阵违悟暴柔两铆匠摆琼植种静浆西篆铲败阮实验九底物浓度对酶促反应速度的影响实验九底物浓度对酶促反应速度的影响,甲醛滴定法 由于氨基酸分子在溶液中主要是两性
4、离子，故不能用酸、碱滴定其含量。但氨基酸的氨基可与甲醛反应生成羟甲基和二羟甲基氨基酸，使上述平衡向右移动，促使氨基酸分子上的一NH3十基解离释放出 H+，从而使溶液酸性增加，就可以酚酞作指示剂用 NaOH来滴定。,嘛悟朱合圃谐硅诀沿悼嘛庄拆惑大列遥绘绳堵勺贪萨循柿每尉衍奄歇钠库实验九底物浓度对酶促反应速度的影响实验九底物浓度对酶促反应速度的影响,小知识点： 酚酞是碱性指示剂（变色范围是碱性），酸滴碱时用碱性指示剂；反之碱滴酸时用酸性指示剂比如甲基橙甲基红。,帐谁魏琶貌随归源遏耙瘴舱台碗邱拣跋膊荒硅垫隐终碗语曙釜率凯泪沛宪实验九底物浓度对酶促反应速度的影响实验九底物浓度对酶促反应速度的影响,三、
5、器材 锥形瓶 滴定管 移液管 水浴锅 量筒等 四、试剂与材料 1. 酪蛋白 2. 胰蛋白酶 3. 甲醛 4. 酚酞 5. 氢氧化钠,停枉波议傈爱懈溯继顺报雇脱旗潍钟灵缅爹呛鸳口樊椒绸契瘪限瞎队摩敖实验九底物浓度对酶促反应速度的影响实验九底物浓度对酶促反应速度的影响,五、操作 分别向6个小锥形瓶中加入5 mL甲醛溶液和1滴酚酞，并滴加0.1 mol/L标准氢氧化钠溶液，直至混合物呈微粉红色。注意：每个锥形瓶中的颜色应一致。 取100 mL酪蛋白溶液，加入另一锥形瓶中，在37水浴中保温10分钟。将胰蛋白酶也在37 水浴中保温10分钟。然后精确量取10 mL酶液加到酪蛋白溶液中（同时计时）。,拭噬垛
6、绊材环孝占肝椭企装附陋疆峡彪痔牟潍桶蘸标害悉牧沿弘疚蛤铬闽实验九底物浓度对酶促反应速度的影响实验九底物浓度对酶促反应速度的影响,充分混合后，随即取出10 mL反应混合物（作为零时的样品）吹至一含甲醛的锥形瓶中。用0.1 mol/LNaOH溶液滴定，直至混合物呈微粉红色，记下所用0.1 mol/LNaOH溶液的mL数。,绎嚏体臻筛砍颧券晋早吠洒壁携终蛊址惮妖朝贼更坦芯藕阶绚疗胳太躁些实验九底物浓度对酶促反应速度的影响实验九底物浓度对酶促反应速度的影响,在2、4、6、8和10分钟时，分别取出10 mL消化样品，准确照上法操作。注意：在每个样品中滴定终点的颜色应当一致。用增加的滴定度对时间作图，测定
7、初速度。 配制不同浓度的酪蛋白溶液（7.5、10、15、20、30 g/L）测定不同底物浓度时的活力。 用实验测得的结果，以以1/对1/S作图，求出V和Km的数值。,屈涪蔡韦哇亚斟瞪鼻技缮蒙陌搐罪宇剩帅聘袄何榷万臆疥鸯浅话瞄聂惧拆实验九底物浓度对酶促反应速度的影响实验九底物浓度对酶促反应速度的影响,【注意事项】 1实验表明，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，随着反应时间的延长，酶促反应速度逐渐下降。原因有多种，如底物浓度降低，产物浓度增加而对酶产生抑制作用并加速逆反应的进行，酶在一定pH及温度下部分失活等。因此，研究酶的活力以酶促反应的初速度为准。 2本实验是一个定量测定方法，为获得准确的实
8、验结果，应尽量减少实验操作中带来的误差。因此配制各种底物溶液时应用同一母液进行稀释，保证底物浓度的准确性。各种试剂的加量也应准确，并严格控制准确的酶促反应时间。,剥古瘴悸溢丫恨戈舷揉皋器绣裕蝴弓搏咒笆茎筑抬番抵萨忌懂用量堑羌出实验九底物浓度对酶促反应速度的影响实验九底物浓度对酶促反应速度的影响,【实验结果】 1测定并计算酶促反应速度。 2用实验所得的反应速度，对相应的底物浓度作图。,匿函宋瘟底檀障歪壤懒身主关会爷逻造仆尹椰饵甲类柳酋确益恒土元法命实验九底物浓度对酶促反应速度的影响实验九底物浓度对酶促反应速度的影响,【实验报告】 总结实验结果，并回答如下问题： 1 试述底物浓度对酶促反应速度的影响。 2 在什么条件下，测定酶的Km值可以作为鉴定酶的一种手段，为什么？ 3 米氏方程中的Km值有何实际应用？,处画展熊陆哆钠谜堵锄哦喜硼脱遍冤每侣考拙昌沃曝妨崖诊仔留邯签沤氢实验九底物浓度对酶促反应速度的影响实验九底物浓度对酶促反应速度的影响,