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1、组员：张 健 汤敏龙 陈玉玲 汇报人：陈小坚 嫩 跑 扣 烩 蜂 苗 唯 肚 彬 烃 础 慎 行 唐 觉 牟 炊 叙 橡 癸 蕉 芬 划 掺 拆 事 描 障 棕 序 贼 郊 猪 血 清 I g G 的 分 离 纯 化 及 鉴 定 猪 血 清 I g G 的 分 离 纯 化 及 鉴 定 Contents 材料与方法 结果与讨论 总结与感想 薪 狡 剿 怔 韵 孪 峻 汛 翔 聋 归 岸 昂 款 足 玄 奴 要 傈 伴 茵 夸 此 甲 仓 锗 济 筏 华 睛 搏 织 猪 血 清 I g G 的 分 离 纯 化 及 鉴 定 猪 血 清 I g G 的 分 离 纯 化 及 鉴 定 2 一、材料与方法
2、（一）试验材料 1、供试材料 采用猪血为实验材料，采自宁波方兴食品有限公司 屠宰场。收集健康肉猪颈动脉血液，室温下放置1-2h， 析出血清，于4、8000r/min离心10min，除去血球和 纤维蛋白原后，取上层血清，-20冰箱内保存备用。 帜 漠 禾 掺 壳 冗 甫 债 娥 届 姨 拷 有 渔 瞳 辆 瞻 蓑 盒 萄 偷 愈 蔗 戒 驯 鼎 登 韵 壮 鸿 强 倒 猪 血 清 I g G 的 分 离 纯 化 及 鉴 定 猪 血 清 I g G 的 分 离 纯 化 及 鉴 定 3 2、主要试剂 试剂试剂 名称规规格出产产厂家 三氯氯醋酸 正辛酸 氯氯化钠钠 氢氢氧化钠钠 盐盐酸 Tris 无水
3、乙醇 醋酸 分析纯纯 分析纯纯 分析纯纯 分析纯纯 分析纯纯 分析纯纯 分析纯纯 分析纯纯 上海光铧铧科技有限公司 衢州巨化试剂试剂 有限公司 天津市永大化学试剂试剂 开发发中 心 上海三鹰鹰化学试剂试剂 有限公司 浙江中星化工试剂试剂 有限公司 浙江中星化工试剂试剂 有限公司 杭州瓶窑和顺顺化工试剂试剂 厂 浙江中星化工试剂试剂 有限公司 附 捎 痪 炔 润 婶 蝎 揉 马 叫 巩 寺 唤 询 蹦 蕴 吁 肌 难 如 柑 挖 触 唆 碍 廓 蓬 波 群 过 绿 陡 猪 血 清 I g G 的 分 离 纯 化 及 鉴 定 猪 血 清 I g G 的 分 离 纯 化 及 鉴 定 4 试剂试剂 名
4、称规规格出产产厂家 考马马斯亮蓝蓝 甘油 巯巯基乙醇 SDS 甘氨酸 溴酚蓝蓝 DEAE52 过过硫酸铵铵 乙酸钡 分析纯纯 分析纯纯 分析纯纯 分析纯纯 分析纯纯 分析纯纯 分析纯纯 分析纯纯 分析纯纯 浙江中星化工试剂试剂 有限公司 无锡锡市龙龙吉化工试剂试剂 有限公 司 浙江中星化工试剂试剂 有限公司 上海源聚生物科技有限公司 天津市永大化学试剂试剂 开发发中 心 浙江中星化工试剂试剂 有限公司 安徽三星树树脂科技有限公司 上海三鹰鹰化学试剂试剂 有限公司 浙江中星化工试剂试剂 有限公司 植 昨 雄 儿 肛 魂 括 垢 塞 吊 猪 鸳 叶 糠 慧 昏 嘉 束 查 撑 滞 愈 藕 恃 褒
5、拘 脊 划 壶 仓 各 守 猪 血 清 I g G 的 分 离 纯 化 及 鉴 定 猪 血 清 I g G 的 分 离 纯 化 及 鉴 定 5 3、仪器设备 仪仪器名称型号生产产厂家 紫外可见见分光光度计计S52恒达仪仪器厂 电电泳仪仪CS101上海精密科学仪仪器有限公司 低速大容量离心机TDL-5上海安亭科学仪仪器厂 高速万能粉碎机FW100天津市泰斯特仪仪器有限公司 数显显恒温水浴锅锅HH-2常州国华电华电 器有限公司 真空干燥箱DZF-6050上海一恒科技有限公司 电电子精密天平AB-L梅特勒托利多仪仪器有限公司 全温振荡荡（空气）培养箱QYC-211上海福玛实验设备玛实验设备 有限公司
6、 自动动液相色谱谱分离层层析仪仪MC99-3上海沪西分析仪仪器厂 电热电热 恒温鼓风风干燥箱OHG-907385-上海新苗医疗疗器械制造有限公司 酸度计计DELTA-320梅特勒托利多仪仪器(上海)有限公司 层层析拄1.030上海沪西分析仪仪器厂 恒温磁力搅搅拌器90-2上海亚亚荣生化仪仪器厂 赞 汽 落 后 携 和 卖 尔 壕 赋 叫 把 计 配 茂 莆 蹭 库 铁 喘 箱 歉 豁 炊 诧 泽 鹊 哑 嗓 丧 吩 苦 猪 血 清 I g G 的 分 离 纯 化 及 鉴 定 猪 血 清 I g G 的 分 离 纯 化 及 鉴 定 6 AA 猪血清IgG的提取 BB 猪血清IgG的纯化 C C
7、提取液蛋白含量测定 （二）试验方法 DD 猪血清IgG分子量测定 颂 崭 靛 响 瓦 磁 拷 粗 猪 吻 挟 瞬 疹 锌 躯 替 曳 鞭 魔 亮 檄 哲 闺 庶 阻 锤 局 接 舞 伎 酝 搁 猪 血 清 I g G 的 分 离 纯 化 及 鉴 定 猪 血 清 I g G 的 分 离 纯 化 及 鉴 定 7 1、猪血清IgG的提取正辛酸法 l准确量取猪血清40mL于500mL烧杯中，加入60mmol/L pH4.0醋酸缓冲液160mL，用氢氧化钠溶液调pH4.5。 l以每毫升稀释液加入25L正辛酸的比例，在磁力搅拌 条件下缓慢加入正辛酸，室温搅拌30min，4，5000 r/min离心30mi
8、n，弃去沉淀。 l上清液4预冷，以1mL上清液加0.227g硫酸铵的比例 ，缓慢加入硫酸铵粉末，边加边搅拌，室温下继续搅 拌30min，5000r/min离心15min。 l将沉淀溶于20mL生理盐水中，透析过夜，离心去沉淀 ，上清液即为粗提IgG。 纸 亭 晶 疫 殿 草 巧 敬 栋 灾 峙 费 共 姚 郭 郧 驰 宗 占 借 嘉 越 交 哉 靴 侨 乐 蛔 炊 铣 讽 莱 猪 血 清 I g G 的 分 离 纯 化 及 鉴 定 猪 血 清 I g G 的 分 离 纯 化 及 鉴 定 8 2、猪血清IgG的纯化 将上述IgG粗品溶于少量生 理盐水后装入透析袋，悬于装有 0.01mol/L，p
9、H7.4的PBS的大烧 杯中，于磁力搅拌器上4透析 24h，每6h换一次液。 （1）透析脱盐 家 瞒 量 葛 予 瘴 喳 抛 企 讣 洪 力 沸 尸 萄 顶 屑 散 戌 斥 涎 烧 届 附 牢 袄 棠 接 城 跳 狮 得 猪 血 清 I g G 的 分 离 纯 化 及 鉴 定 猪 血 清 I g G 的 分 离 纯 化 及 鉴 定 9 l取2g预处理的DEAE-52纤维素、装成1.530cm，柱床高 25cm层析柱。 l缓冲液A(25mmol/L Tris-HCl，pH8.8，35mmol/L NaCl)平 衡。 l取2mL上述透析去盐母液进层析柱，上样后先用缓冲液A平 衡，至流出液在280n
10、m波长洗脱曲线变得平直止。 l以等量缓冲液A和缓冲液C(25mmol/L Tris-HCl，pH8.8， 500mmol/L NaCl)连续梯度洗脱；控制流速1mL/min。 l上样15min后分步收集并记录波峰，2mL/管，合并同一波 峰收集管。再用PBS溶液透析，并进行分析鉴定。 （2）DEAE-52纤维素离子交换层析纯化IgG 顷 黎 猛 箍 辅 儡 澡 感 唤 蔬 贯 玉 隐 册 鸡 辗 谨 恃 懒 妥 琴 艘 械 皿 协 熙 鱼 瘤 栽 酉 勒 隘 猪 血 清 I g G 的 分 离 纯 化 及 鉴 定 猪 血 清 I g G 的 分 离 纯 化 及 鉴 定 10 3、提取液蛋白含量
11、测定Folin-酚法 配制标准牛血清白蛋白进行Folin-酚法实验，用分 光光度计测定梯度浓度标准蛋白的OD280。 以蛋白质的浓度为横坐标，OD280值为纵坐标，绘 制标准曲线。 各粗IgG样品液定容至100mL，按Folin-酚法操作， 通过标准曲线计算样品的蛋白质浓度。 求 售 佳 雾 弦 逆 刁 推 宦 谭 妙 绞 知 涨 隘 便 亢 炙 蒂 尊 坛 疟 邑 来 丝 式 爵 议 哦 蚀 敲 陷 猪 血 清 I g G 的 分 离 纯 化 及 鉴 定 猪 血 清 I g G 的 分 离 纯 化 及 鉴 定 11 4、猪血清IgG分子量测定SDS-PAGE l配制SDS-PAGE凝胶。 l
12、将透析过的IgG样品液和标准蛋白液与上样缓冲液混 合后在沸水浴中加热5min，各取20L加入凝胶板的 样品槽中，进行电泳。 l取出凝胶平板，将凝胶浸泡在染色液中，20min后用 脱色液脱色。 l脱色后的凝胶在凝胶成像仪上拍照，分析，根据标 样做出标准曲线计算样品IgG分子量。 渺 掘 院 亨 撅 沤 槐 颇 啼 外 缅 鞠 莱 贼 臻 剂 栗 帅 褂 黄 颤 昭 菊 妹 驶 尿 瑟 佃 榴 落 灸 拓 猪 血 清 I g G 的 分 离 纯 化 及 鉴 定 猪 血 清 I g G 的 分 离 纯 化 及 鉴 定 12 电泳设备电泳设备 犀 嗣 玖 瓮 辊 撞 凳 勤 诬 贱 倘 甲 峻 捕 鳖
13、 爬 圭 妓 惕 糖 瞳 沙 圣 轧 棚 焚 谐 事 歇 琢 灰 燎 猪 血 清 I g G 的 分 离 纯 化 及 鉴 定 猪 血 清 I g G 的 分 离 纯 化 及 鉴 定 13 二、结果与讨论 （一）正辛酸提取猪血清IgG试验结果 血清提取出的球蛋白粗品为浅黄色胶状物质。 （二）猪血清IgG纯化结果 透析后的蛋白质颜色明显变浅，呈透明状。 1、IgG的透析结果 豫 蔽 制 听 黎 滴 桃 综 学 镜 滚 芥 驶 谢 扒 绊 饥 迂 稳 谦 泞 养 堂 拷 署 模 液 尝 探 嗅 侨 帧 猪 血 清 I g G 的 分 离 纯 化 及 鉴 定 猪 血 清 I g G 的 分 离 纯 化
14、 及 鉴 定 14 保留时间0-1.6h为缓冲液A 洗脱第一峰； 1.6h开启缓冲液A-C线性梯 度洗脱，获得第二峰； 图示两色谱峰分离效果较好 ，分辨率高，无重叠。 2、DEAE-52纤维素层析纯化IgG结果 用DEAE纤维素离子交换柱进行纯化，以OD280nm 为纵坐标，洗脱时间为横坐标，绘制洗脱色谱图： 挪 优 孟 蛋 揽 裳 酗 叼 陶 罐 荷 探 硒 扰 沧 编 估 妆 湿 野 盗 戮 萝 舟 疼 阻 胆 姜 仑 烧 隅 达 猪 血 清 I g G 的 分 离 纯 化 及 鉴 定 猪 血 清 I g G 的 分 离 纯 化 及 鉴 定 15 图 福林酚试剂法测蛋白质浓度标准曲线 （三
15、）提取液蛋白含量测定结果 1、标准曲线 当 积 淬 躇 屁 曹 奥 陛 帽 冶 护 杰 苗 闰 路 叮 且 枯 昭 潍 表 巾 身 栽 姆 锥 损 要 艳 拿 扯 每 猪 血 清 I g G 的 分 离 纯 化 及 鉴 定 猪 血 清 I g G 的 分 离 纯 化 及 鉴 定 16 分别将低盐峰和高盐峰样品吸光度代入 蛋白质标准曲线，计算求得低盐峰样品蛋白 质含量1.45mg/mL，高盐峰样品蛋白质含量 为.74mg/mL。 2、样品IgG含量测定 畸 惶 漾 汾 帅 镊 啄 熏 帧 适 欠 暖 棒 抬 戮 慌 冠 毕 鞠 祥 聊 川 破 川 窝 球 侈 氦 连 龙 公 的 猪 血 清 I
16、g G 的 分 离 纯 化 及 鉴 定 猪 血 清 I g G 的 分 离 纯 化 及 鉴 定 17 （四）SDS-PAGE测IgG分子量结果 猪血清、纯化的IgG样品经SDS-PAGE电泳结果如下： 1标准蛋白 2 猪血清 3 纯化的IgG样品途 垛 善 尤 梅 硕 财 敖 有 砂 育 咋 阵 犹 若 墨 憋 非 糕 矢 知 跑 邱 站 谎 楔 响 磋 惊 伍 湃 汹 猪 血 清 I g G 的 分 离 纯 化 及 鉴 定 猪 血 清 I g G 的 分 离 纯 化 及 鉴 定 18 lIgG样品经预处理过程中巯基乙醇的作用而打 开二硫键，还原成两条单链，再进一步与SDS结合 成带大量负电荷
17、的SDS-蛋白复合物，SDS-PAGE电 泳呈现两条较浓的条带。 l 猪血清球蛋白经正辛酸法提取，DEAE纯化后 ，所得IgG较纯净，基本无其它杂蛋白，表明该提 取纯化工艺能得到较纯净的免疫球蛋白。 锡 哉 基 拐 讣 核 管 堡 亏 璃 缠 克 履 爷 灌 俞 摘 怠 耽 练 落 仔 挚 感 痈 胸 斜 酿 翘 傣 敞 加 猪 血 清 I g G 的 分 离 纯 化 及 鉴 定 猪 血 清 I g G 的 分 离 纯 化 及 鉴 定 19 1、标准曲线制作 以标准蛋白质相对分子质量的对数（lgMw） 为纵坐标，蛋白质迁移距离为横坐标，得到以下 标准曲线。 糠 戴 村 瓶 窘 稚 恢 睦 怕
18、娄 仍 粤 旷 企 蜀 临 墙 眷 瞻 赫 泼 复 蓖 请 陵 鼓 耕 骑 奸 诺 夺 市 猪 血 清 I g G 的 分 离 纯 化 及 鉴 定 猪 血 清 I g G 的 分 离 纯 化 及 鉴 定 20 2、IgG样品分子量测定结果 根据样品IgG的迁移距离从标准曲线上查 出其相对分子质量如下：重链约55000，轻链 约24000。即猪血清IgG球蛋分子量为16万左右 ，与文献蛋白质技术手册报道结果一致。 蛇 囊 劳 赖 孟 侍 隔 逝 逮 赂 查 颊 累 玩 芳 瓷 净 硒 嘘 砂 慧 面 宝 衬 画 酥 蘑 泽 均 搓 瓦 北 猪 血 清 I g G 的 分 离 纯 化 及 鉴 定
19、猪 血 清 I g G 的 分 离 纯 化 及 鉴 定 21 四、总结与感想 总的来说，本次试验还是成功的，虽然说 试验方法在细节上还有很多需要改进的地方， 但实验目的已经达到。 本次实验课是一次不同于以往的自主性实 验课程，需要我们自己查找资料、设计实验方 案，更需要我们独立思考、通过团队合作完成 实验。 套 贩 岗 巢 涯 鸽 戮 篓 罩 珐 呈 几 倘 豹 蒸 驮 圾 浴 抒 赤 磊 谷 强 讥 舍 邀 逛 呕 壶 碾 讫 胡 猪 血 清 I g G 的 分 离 纯 化 及 鉴 定 猪 血 清 I g G 的 分 离 纯 化 及 鉴 定 22 这种以学生为主，老师为辅的实验课程让我 们想
20、得更多，学得更多，得到的也更多。在我们 开展讨论的过程中，同学们互相学习，对实验的 设计流程有了深刻的认识。实验其间，对于细节 上的问题我们更加耐心，为将来毕业论文的开展 提供了有力的基础。 具 帜 淡 印 怎 纲 汐 站 厂 舜 慎 扭 锄 邵 瘟 档 硕 玄 骋 移 詹 缩 抓 沏 夺 淮 讯 问 跌 徊 暮 棺 猪 血 清 I g G 的 分 离 纯 化 及 鉴 定 猪 血 清 I g G 的 分 离 纯 化 及 鉴 定 23 用 妖 搞 磕 初 酶 姐 荐 奸 馏 圈 扣 鸵 貌 趣 矿 蹄 洁 融 清 框 痪 驴 泌 萝 耘 龟 宇 值 横 复 违 猪 血 清 I g G 的 分 离 纯 化 及 鉴 定 猪 血 清 I g G 的 分 离 纯 化 及 鉴 定 24