兴奋剂检测PPT课件.ppt

1、兴兴 奋奋 剂剂 检检 测测王怀冲王怀冲 主管药师主管药师杭州市红会医院杭州市红会医院一、兴奋剂概况一、兴奋剂概况掉进掉进“尿瓶子尿瓶子”的的“体坛精英们体坛精英们”！本本约翰逊约翰逊19881988年年汉城汉城奥运会奥运会 合成类固醇类合成类固醇类兰迪斯兰迪斯2006年年 环法自行车大赛环法自行车大赛 表睾酮和睾丸激素超标表睾酮和睾丸激素超标 马里昂马里昂琼斯琼斯20002000年年悉尼奥运会悉尼奥运会 类固醇类固醇 孙英杰孙英杰2005年年十运会十运会外源性雄酮外源性雄酮p“兴奋剂兴奋剂”一词源于英文词一词源于英文词dopedope，原义为，原义为“供赛供赛马使用的一种鸦片麻醉混合剂马使用

2、的一种鸦片麻醉混合剂”。p兴奋剂是国际上体育界对违禁药物的总称。兴奋剂是国际上体育界对违禁药物的总称。p国际体育组织对兴奋剂的含义作了下述规定：国际体育组织对兴奋剂的含义作了下述规定：“健康人以特殊的目的，把药物以任何形式摄入体健康人以特殊的目的，把药物以任何形式摄入体内，或者以不正常的方法应用非正常量的生理物内，或者以不正常的方法应用非正常量的生理物质，这些在比赛中用来提高运动成绩的做法，称质，这些在比赛中用来提高运动成绩的做法，称之为应用兴奋剂之为应用兴奋剂”。兴奋剂概念兴奋剂概念兴奋剂发展兴奋剂发展20世纪世纪60年代年代刺激剂刺激剂麻醉剂麻醉剂60年代末期年代末期合成类固醇合成类固醇促

3、红细胞生长素促红细胞生长素80年代年代近几年近几年人体生长激素人体生长激素 p出现严重的出现严重的性格变化性格变化p产生产生药物依赖性药物依赖性p导致导致细胞和器官功能异常细胞和器官功能异常p产生产生过敏反应过敏反应，损害免疫力，损害免疫力p引起引起各种感染各种感染（如肝炎和艾滋病）（如肝炎和艾滋病）兴奋剂的危害兴奋剂的危害二、兴奋剂分类和方法二、兴奋剂分类和方法 麻黄素麻黄素甲基苯丙胺甲基苯丙胺 （冰毒）（冰毒）（一）、刺激剂（一）、刺激剂p大多数刺激剂的分析测定都是将色谱分离技术与大多数刺激剂的分析测定都是将色谱分离技术与灵敏的检测手段灵敏的检测手段(如光谱法、电分析法如光谱法、电分析法)

4、结合起来结合起来而进行定量分析。而进行定量分析。常见苯丙胺类兴奋剂及其药理作用常见苯丙胺类兴奋剂及其药理作用吗啡吗啡（二）、麻醉止痛剂（二）、麻醉止痛剂杜冷丁杜冷丁p麻醉剂的检测主要有高效液相色谱与质谱麻醉剂的检测主要有高效液相色谱与质谱(HPLC-MS)(HPLC-MS)联用、质谱与质谱联用、质谱与质谱(MS-MS)(MS-MS)联用、联用、色谱与光谱联用及电分析等方法。色谱与光谱联用及电分析等方法。（三）、合成类固醇（三）、合成类固醇替勃龙替勃龙甲睾酮甲睾酮p色谱与质谱联用，集合了色谱的高效分离能色谱与质谱联用，集合了色谱的高效分离能力和质谱的结构鉴定特征。力和质谱的结构鉴定特征。（四）、

5、利尿剂（四）、利尿剂氢氯噻嗪氢氯噻嗪吲达帕胺吲达帕胺p利尿剂的检测一般要在尿样、血清等成分复利尿剂的检测一般要在尿样、血清等成分复杂的实际样品中进行，所以其检测必须先采杂的实际样品中进行，所以其检测必须先采用色谱、电泳等方法进行有效地分离。导数用色谱、电泳等方法进行有效地分离。导数分光光度法、荧光光谱。分光光度法、荧光光谱。（五）、（五）、-阻断剂阻断剂比索洛尔比索洛尔卡维地洛卡维地洛p分光光度法；用分光光度法；用HPLCHPLC分离，荧光法检测；吸分离，荧光法检测；吸附溶出方波伏安法。附溶出方波伏安法。大多以激素的形式存在于人体大多以激素的形式存在于人体1 1、人体生长激素（人体生长激素（h

6、GHhGH）2 2、胰岛素胰岛素3 3、促红细胞生成素（促红细胞生成素（EPOEPO）4 4、促性腺素促性腺素（六）、内源性肽类激素（六）、内源性肽类激素p免疫分析法。免疫分析法。p又称为血液红细胞回输技术，增强血液载氧能力。又称为血液红细胞回输技术，增强血液载氧能力。19881988年汉城奥运会正式被国际奥委会列入禁用范年汉城奥运会正式被国际奥委会列入禁用范围。围。（七）、血液兴奋剂（七）、血液兴奋剂四、兴奋剂检测过程四、兴奋剂检测过程 p1967年，用年，用气相色谱法气相色谱法（GC）、）、薄层色谱法薄层色谱法（TLC）进行分离鉴定，使用了）进行分离鉴定，使用了4种种GC填充柱系统，填充柱

7、系统，氢焰离子化检测器氢焰离子化检测器，可检出，可检出40种兴奋剂。种兴奋剂。p1972年，采用了程序升温方法，并用年，采用了程序升温方法，并用氮磷检测器氮磷检测器检测。检测。p1976年，使用年，使用气相色谱气相色谱-质谱联用质谱联用手段检测甾体。手段检测甾体。p1980年，用年，用毛细管气相色谱法毛细管气相色谱法检测，至检测，至1984年大年大体基本定型，并增加了用高效液相色谱法检查几种体基本定型，并增加了用高效液相色谱法检查几种特定药物及咖啡因定量等工作。特定药物及咖啡因定量等工作。p近年来，毛细管电泳、免疫测定、近年来，毛细管电泳、免疫测定、GC-MS-MS等技术等技术广泛应用。广泛应

8、用。检测手段进展检测手段进展检测流程图检测流程图 p尿检是兴奋剂检测的常规武器，主要针对传统兴尿检是兴奋剂检测的常规武器，主要针对传统兴奋剂和各种合成代谢类固醇。奋剂和各种合成代谢类固醇。p其优点在于：其优点在于：取样方便取样方便 对人无损害对人无损害 尿液中的药物浓度高于血液中的药物浓度尿液中的药物浓度高于血液中的药物浓度 尿液中的其他干扰少尿液中的其他干扰少尿样检测尿样检测分析过程中按药物的化学特征和分析方法将所有分析过程中按药物的化学特征和分析方法将所有药物分成四类，药物分成四类，p第一类：尿中以游离形式排泄的易挥发性含氮化第一类：尿中以游离形式排泄的易挥发性含氮化合物（主要是刺激剂）；

9、合物（主要是刺激剂）；p第二类：尿中以硫酸或葡萄糖醛酸结合的难挥发第二类：尿中以硫酸或葡萄糖醛酸结合的难挥发性含氮化合物（主要是麻醉止痛剂，性含氮化合物（主要是麻醉止痛剂，阻滞剂和阻滞剂和少数刺激剂）；少数刺激剂）；p第三类：化学结构和特性特殊的刺激剂（咖啡因，第三类：化学结构和特性特殊的刺激剂（咖啡因，匹莫林）和利尿剂；匹莫林）和利尿剂；p第四类：合成类固醇及睾酮。第四类：合成类固醇及睾酮。尿样检测尿样检测尿检不足尿检不足p常规尿检不仅对血红细胞生长素常规尿检不仅对血红细胞生长素EPOEPO和促生和促生长激素长激素HGHHGH等禁药无能为力，即使对合成代等禁药无能为力，即使对合成代谢类固醇的

10、谢类固醇的“变种变种”THGTHG等物质也毫无等物质也毫无办法。办法。尿样检测尿样检测p血样检测的目的主要是补充尿样分析方法的不足，血样检测的目的主要是补充尿样分析方法的不足，是针对是针对EPOEPO的一种检测方式。的一种检测方式。血样检测血样检测p20002000年，悉尼奥运会第一次实施年，悉尼奥运会第一次实施EPOEPO检测计划，检测计划，把血检列为兴奋剂检测项目，成为奥林匹克把血检列为兴奋剂检测项目，成为奥林匹克反兴奋剂史上的里程碑。该计划将反兴奋剂史上的里程碑。该计划将“EPO2000EPO2000”血检法和法国科学家开发出来的血检法和法国科学家开发出来的尿检尿检EPOEPO法共同实施

11、血液和尿样检测同时呈法共同实施，血液和尿样检测同时呈阳性的运动员才会被处罚，而拒绝血检的运阳性的运动员才会被处罚，而拒绝血检的运动员将被定为与服禁药同罪。动员将被定为与服禁药同罪。血样检测血样检测p“EPO2000EPO2000”研究计划是澳大利亚科学家主导的研究计划是澳大利亚科学家主导的一项国际合作研究。该项研究最终发现，人体内一项国际合作研究。该项研究最终发现，人体内有三种物质可作为服用生长激素后的标靶物。这有三种物质可作为服用生长激素后的标靶物。这三种物质的体内含量有特定变化曲线，一旦异常三种物质的体内含量有特定变化曲线，一旦异常就说明有体外摄取。按照这种检测技术，通过抽就说明有体外摄

12、取。按照这种检测技术，通过抽取大约取大约1010毫升的血样，便可发现运动员三周前是毫升的血样，便可发现运动员三周前是否注射过否注射过EPOEPO。p法国科学家开发的是一种新型尿检法。通过分析法国科学家开发的是一种新型尿检法。通过分析合成合成EPOEPO与自然与自然EPOEPO电荷上的微小差别，可检测出电荷上的微小差别，可检测出当事人在当事人在3 3天内是否接受过天内是否接受过EPOEPO兴奋剂注射。兴奋剂注射。p悉尼奥运会期间，血检可以有效地查出悉尼奥运会期间，血检可以有效地查出EPOEPO，但，但对于对于HGHHGH仍然无能为力。仍然无能为力。血样检测血样检测pHGHHGH的作用类似于一种合

13、成代谢类固醇，能够的作用类似于一种合成代谢类固醇，能够帮助肌肉生长并帮助运动员从训练疲劳中迅速帮助肌肉生长并帮助运动员从训练疲劳中迅速恢复。恢复。p由于由于HGHHGH也能自然生成，关键问题就是如何区也能自然生成，关键问题就是如何区分人体自然产生的分人体自然产生的HGHHGH和人工合成的和人工合成的HGHHGH。p虽然虽然HGHHGH早在早在2020世纪世纪8080年代就被列为违禁药物年代就被列为违禁药物并被怀疑大量使用，但现有的检测手段却根本并被怀疑大量使用，但现有的检测手段却根本无法追寻到它的踪影无法追寻到它的踪影血样检测血样检测p20032003年年1010月底，国际奥委会和世界反兴奋剂

14、机构月底，国际奥委会和世界反兴奋剂机构称，已找到检测人工合成称，已找到检测人工合成HGHHGH的方法，并在雅典的方法，并在雅典奥运会上实施。奥运会上实施。血样检测血样检测p基因兴奋剂将成为下一代兴奋剂的基因兴奋剂将成为下一代兴奋剂的“主角主角”，基因兴奋剂的检测将成为国际体育界面临，基因兴奋剂的检测将成为国际体育界面临的一个新难题，的一个新难题，与其他兴奋剂相比，基因兴与其他兴奋剂相比，基因兴奋剂更难被检测出来。因为人为植入的基因奋剂更难被检测出来。因为人为植入的基因所产生的蛋白质，与人体天然形成的蛋白质所产生的蛋白质，与人体天然形成的蛋白质看起来完全相同。看起来完全相同。基因兴奋剂基因兴奋剂

15、p对载体和导入的外源性基因的检测对载体和导入的外源性基因的检测p对基因表达后各类产物的检测对基因表达后各类产物的检测p对常规生化指标的检测对常规生化指标的检测 困难重重困难重重 p德国科隆体育学院，德国科隆体育学院，20092009年年3 3月表示其已开月表示其已开发出新的利用质谱检测基因兴奋剂的方法，发出新的利用质谱检测基因兴奋剂的方法，该方法将从该方法将从20122012年伦敦奥运会开始使用。通年伦敦奥运会开始使用。通过该方法检测出的禁药包括过该方法检测出的禁药包括GW1516GW1516。基因兴奋剂基因兴奋剂五、兴奋剂检测实例五、兴奋剂检测实例 目的：目的：建立建立RP-HPLCRP-H

16、PLC法测定安乃近中的法测定安乃近中的4-N-4-N-去甲基去甲基安乃近。安乃近。方法：方法：色谱柱为色谱柱为AgilientAgilient ODS ODS柱（柱（4.6 mm4.6 mm150 150 mmmm5m5m），以甲醇），以甲醇0.02 mol0.02 molL L-1-1：磷酸二氢：磷酸二氢钾溶液（钾溶液（38:6238:62）（含）（含1.351.35的亚硫酸钠）（用的亚硫酸钠）（用三乙胺调三乙胺调pHpH8.18.1），），245 nm245 nm为检测波长，流速为检测波长，流速1.0 mL1.0 mLminmin-1-1，溶剂为流动相。，溶剂为流动相。结果：结果：4-N-

17、4-N-去甲基安乃近的线性范围为去甲基安乃近的线性范围为0.1050.10510.50g10.50gmLmL-1-1，平均回收率为，平均回收率为99.5999.59（RSDRSD0.380.38），溶液在），溶液在6h6h内稳定。内稳定。结论：结论：本法准确、可行。本法准确、可行。（一）、（一）、RP-HPLCRP-HPLC法测定安乃近中的法测定安乃近中的4-N-4-N-去甲基安乃近去甲基安乃近RP-HPLCRP-HPLC法测定安乃近中的法测定安乃近中的4-N-4-N-去甲基安乃近去甲基安乃近1.1.亚硫酸钠亚硫酸钠（tRtR=1.4min=1.4min）2.2.4-N-4-N-去甲基安乃去甲

18、基安乃近（近（tRtR=2.3min=2.3min）3.3.安乃近安乃近（tRtR=2.6min=2.6min）4.4.4-4-氨基安替比林氨基安替比林（tRtR=5.0min=5.0min）5.5.4-4-甲氨基安替比甲氨基安替比林（林（tRtR=6.9min=6.9min）目的：目的：建立反相高效液相色谱法测定红细胞作为载体的吗建立反相高效液相色谱法测定红细胞作为载体的吗啡体内药物浓度啡体内药物浓度。方法：方法：全血样品中加人内标茶碱后用乙酸乙酯提取。色谱全血样品中加人内标茶碱后用乙酸乙酯提取。色谱柱为柱为KromasilKromasil C18 C18柱（柱（150 mm150 mm4.

19、6 mm4.6 mm5m5m）；流动）；流动相为相为0.10.1三乙胺水溶液三乙胺水溶液-甲醇（甲醇（85:1585:15），用磷酸调），用磷酸调pHpH为为6.956.95；流速：；流速：1.5 mL1.5 mLminmin-1-1，紫外，紫外215 nm215 nm检测检测。结果：结果：全血中杂质不干扰样品的测定，本方法线性范围为全血中杂质不干扰样品的测定，本方法线性范围为5 51000 ng1000 ngmLmL-1-1（r r0.99960.9996）；最低检出浓度为）；最低检出浓度为2 2 ngngmLmL-1-1；提取回收率为；提取回收率为85.3485.3491.5791.57，

20、方法回收，方法回收率为率为96.8996.89101.4101.4；日间和日内；日间和日内RSDRSD分别为分别为1.261.264.244.24和和1.191.193.643.64。结论：结论：本方法简单、灵敏、准确。本方法简单、灵敏、准确。（二）、（二）、RP-HPLCRP-HPLC法测定人全血中吗啡血法测定人全血中吗啡血药浓度药浓度RP-HPLCRP-HPLC法测定人全血中吗啡血药浓度法测定人全血中吗啡血药浓度空白全血空白全血A吗啡血样吗啡血样B(1.内标内标茶碱茶碱2.吗啡吗啡)目的：目的：应用串联质谱（应用串联质谱（ClCl离子源）法进行尿中氯胺酮及其离子源）法进行尿中氯胺酮及其代谢

21、物的快速测定。代谢物的快速测定。方法：方法：取尿液取尿液2 23 3 mLmL，加入固体碳酸钠少量和丙酸酐，加入固体碳酸钠少量和丙酸酐80 80 LL，超声，超声5 min5 min，加入醋酸甲酯，加入醋酸甲酯2 2 mLmL，超声萃取，超声萃取l0 minl0 min后离心（后离心（4000 r4000 rminmin-1-1）3 min3 min，取上层有机相转入事，取上层有机相转入事先加入无水硫酸钠的样品瓶（先加入无水硫酸钠的样品瓶（4 4 mLmL容量）中，供容量）中，供GCGCMSMSMSMS测定。测定。结果：结果：本方法不仅适用于尿中氯胺酮原药的检验，同时满本方法不仅适用于尿中氯胺

22、酮原药的检验，同时满足尿中去甲氯胺酮、脱氢去甲氯胺酮的检验，回收率达足尿中去甲氯胺酮、脱氢去甲氯胺酮的检验，回收率达9090以上，最低检出浓度为：以上，最低检出浓度为：5 51010-8-8g gL L-1-1；GC-MSGC-MSMSMS的最低检出限为的最低检出限为0.05 0.05 ngng。结论：结论：本方法可满足确证本方法可满足确证48 h48 h以内是否吸食过氯胺酮。以内是否吸食过氯胺酮。（三）、应用（三）、应用GC-GC-双质谱法快速测定尿液双质谱法快速测定尿液中氯胺酮及其代谢物中氯胺酮及其代谢物应用应用GC-GC-双质谱法快速测定尿液中氯胺酮双质谱法快速测定尿液中氯胺酮及其代谢物

23、及其代谢物目的：目的：建立了一种简单、灵敏、快速地同时测定人体尿液建立了一种简单、灵敏、快速地同时测定人体尿液中中3 3类类(刺激剂、麻醉剂和抗雌激素刺激剂、麻醉剂和抗雌激素)5)5种兴奋剂的气相色种兴奋剂的气相色谱谱-氮磷检测氮磷检测(GC-NPD)(GC-NPD)方法。方法。方法：方法：尿样采用非衍生法液尿样采用非衍生法液-液萃取预处理技术液萃取预处理技术,选用叔丁选用叔丁基甲醚作为萃取溶剂基甲醚作为萃取溶剂,二苯胺作为内标进行定量检测。二苯胺作为内标进行定量检测。结果：结果：混合标准品中各组分不受干扰物质峰的影响，尿样混合标准品中各组分不受干扰物质峰的影响，尿样中基体成分与混合标准品中的

24、各组分得到较好的分离。中基体成分与混合标准品中的各组分得到较好的分离。结论：结论：此方法适合于尿样中刺激剂、麻醉剂和抗雌激素类此方法适合于尿样中刺激剂、麻醉剂和抗雌激素类兴奋剂的同时检测。兴奋剂的同时检测。（四）、气相色谱（四）、气相色谱-氮磷检测方法同时检氮磷检测方法同时检测尿样中刺激剂、麻醉剂和抗雌激素类五测尿样中刺激剂、麻醉剂和抗雌激素类五种兴奋剂种兴奋剂气相色谱气相色谱-氮磷检测方法同时检测尿样中氮磷检测方法同时检测尿样中刺激剂、麻醉剂和抗雌激素类五种兴奋剂刺激剂、麻醉剂和抗雌激素类五种兴奋剂测定海洛因的新方法：测定海洛因的新方法：研究了海洛因对研究了海洛因对BelousovBelou

25、sovZhabotinskyZhabotinsky（B-ZB-Z）振荡）振荡反应的影响，结果表明：海洛因的加入明显地改变了振反应的影响，结果表明：海洛因的加入明显地改变了振荡体系的周期和振幅，即对振荡体系产生扰动，扰动的荡体系的周期和振幅，即对振荡体系产生扰动，扰动的浓度范围为浓度范围为l.8l.81010-8-82.12.11010-3-3molmolL L，且海洛因的，且海洛因的浓度分别在浓度分别在3.83.81010-6-62.82.81010-5-5molmolL L和和0.90.91010-6-62.92.91010-5-5molmolL L范围内与振荡周期改变值范围内与振荡周期改变

26、值TT和振幅改和振幅改变值变值AA均呈现良好的线性关系，相关系数分别为均呈现良好的线性关系，相关系数分别为0.99310.9931和和0.97460.9746。结果表明：加入海洛因的浓度越大，。结果表明：加入海洛因的浓度越大，电极电位变化值电极电位变化值AA和振荡周期变化值和振荡周期变化值TT越大。越大。（五）、应用别洛索夫扎鲍京斯基振荡（五）、应用别洛索夫扎鲍京斯基振荡化学反应的分析化学反应的分析应用别洛索夫扎鲍京斯基振荡化学反应应用别洛索夫扎鲍京斯基振荡化学反应的分析的分析目的：目的：建立新的检测促红细胞生成素的判别函数，建立新的检测促红细胞生成素的判别函数，提高提高EPOEPO血液检测方

27、法的灵敏度和特异性。血液检测方法的灵敏度和特异性。方法：方法：人体实验采用随机双盲对照设计，将人体实验采用随机双盲对照设计，将2424名名受试者分为实验组和对照组，分别注射重组受试者分为实验组和对照组，分别注射重组EPOEPO和安慰剂。和安慰剂。用用Advia120Advia120血液分析仪检测红细胞压积血液分析仪检测红细胞压积(HCT%)(HCT%)、网织红细胞压积、网织红细胞压积(RetHCTRetHCT)、巨红细胞百分数、巨红细胞百分数(Macro%)(Macro%)；血清血清EPOEPO浓度的测定采用免疫化学发光法；浓度的测定采用免疫化学发光法；可溶性转铁蛋白受体可溶性转铁蛋白受体(s

28、TfRsTfR)的测定采用酶联免的测定采用酶联免疫吸附分析法。疫吸附分析法。（六）、促红细胞生成素检测的判别分析（六）、促红细胞生成素检测的判别分析研究研究结果：结果：采用采用Z_onZ_on判定男性和女性各有判定男性和女性各有1 1例假阴性，例假阴性，而采用而采用On_ModelOn_Model则男性有则男性有3 3例假阴性，女性有例假阴性，女性有8 8例假阴性。在使用例假阴性。在使用1 1次和次和2 2次次EPOEPO后用后用Z_onZ_on能全部能全部进行正确判别，但使用进行正确判别，但使用On_ModelOn_Model均有假阴性发均有假阴性发生。生。结论：结论：新的判别函数新的判别函数Z_onZ_on对使用对使用EPOEPO的误判率低的误判率低于第一代判别函数于第一代判别函数On_ModelOn_Model，并对短期注射，并对短期注射EPOEPO的判别效果高于的判别效果高于On_ModelOn_Model。促红细胞生成素检测的判别分析研究促红细胞生成素检测的判别分析研究促红细胞生成素检测的判别分析研究促红细胞生成素检测的判别分析研究促红细胞生成素检测的判别分析研究促红细胞生成素检测的判别分析研究