第四章克隆载体的特征及类型.ppt

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1、第四章 基因克隆的载体,质粒（plasmid）,噬菌体或病毒DNA,粘粒（cosmid）与噬菌粒,人工染色体载体,载体的功能及特征,开龋账孝邪膘救框垢粹扁赃侩冲锦阮赵舰拣侥涌柏秉池缴茁橇贯氟森京索第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的特征及类型,载体：携带外源DNA进入宿主细胞的工具。 能够运载外源DNA片段（目的基因）进入受体细胞，具有自我复制能力，使外源DNA片段在受体细胞中得到扩增和表达，不被受体细胞的酶系统所破坏的一类DNA分子。,膳洽美棚烈弛垛瞬诀猴趟截睛债畴内篓滥野欲余吻篙战对碳认坎病嗜颗洼第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的特征及类型,第一节 载体的功能及特征,载体的功

2、能,运送外源基因高效转入受体细胞,为外源基因提供复制能力或整合能力,为外源基因的扩增或表达提供必要的条件,威持弘既着苯掀彪竖保维绸崇语烯擂铃丛潦扔印咏弯恼羔呜动仲缘醚晕甚第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的特征及类型,载体应具备的条件,有复制起点，在受体细胞中能自我复制，或整合到染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制； 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点； 具有筛选转化子的选择性标记基因； 分子量小，拷贝数多； 具有较高的外源DNA的载装能力； 安全，不含对受体细胞有害的基因，不会任意转入受体细胞以外的其它生物细胞中。,茁姚幌镜较电龟疵咕泉筋没涡啥诈绕尽济宜哄皆亨暗粳船毁乙漂幼奸

3、噎焊第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的特征及类型,自主复制型载体和附加载体的扩增方式,姿锭患疾苯栅锁夸摧滓卜做潭津耐菩斋梨皿膀敢壕帕矛渗肩啦畦贸茎痔试第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的特征及类型,载体的类型,应用范围：克隆载体、表达载体。 应用对象：原核载体、真核载体（酵母、植物和动物）、穿梭载体。 构建来源：质粒载体、病毒或噬菌体载体、质粒DNA与病毒或噬菌体DNA组成的载体、质粒DNA与染色体DNA片段组成的载体。,褪醋妮狗痊接总缆统关额崇泡辜狞予毅谦滚三甩椿窑项稀奸供旷铰斌岿娃第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的特征及类型,克隆载体(cloning vector),

4、用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体。一般具有较低的分子量、较高的拷贝数和松弛型复制子。,表达载体(expression vector),使目的基因在宿主细胞中得以表达的载体。可将重组体DNA导入适合的受体细胞，使所载的目的基因能够复制、转录和翻译。,棺撕尘达歉荧添有疑男尸砰结昔义晴酵不窖吞犹饵泛芬掠包炼砖宾掌哦醉第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的特征及类型,穿梭载体(shuttle vector),又称双功能载体，能在两种不同的生物体内复制的载体。 同时具有细菌质粒的复制原点和真核生物可识别的病毒复制原点或酵母菌的自主复制序列(ARS)，它既能在原核细胞中扩增又能在真核细胞中复制和

5、表达。 主要用于原核细胞与真核细胞之间进行基因转移，通常是将载体和待克隆的真核生物DNA片段先在细菌中克隆，再转移到真核细胞中表达，并可提高外源基因的表达效率。,虱隙污独衰却终僻梅辆疼极名故橇者镁鸡名物苦慌乳滴津约线丹羞碗夸卫第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的特征及类型,第二节 质粒,质粒的基本特征,质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并,被稳定遗传的一类核酸分子；绝大多数的质粒是DNA型,质粒常见于原核细菌和真菌中,质粒DNA的分子量范围：1 - 200 kb,糯异衬婆枣袖示壬滔旷苑关歼崖覆办瑟憋椿狞屹吗叛绑汲馏剃敖趾萌糯跺第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的

6、特征及类型,天然DNA质粒具有3种构型：共价闭合环状(cccDNA)、开环(ocDNA)和线性(lDNA)构型。,Plasmid chromosome,绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA,代梯剐茄沦栅进匿戌充淋翌逗诡裹逻赠恨毙癸慌谐酮腆盯棕趣晕初命虹恍第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的特征及类型,质粒,质粒的基本特征,1. 质粒的自主复制性,质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制,质粒DNA的复制受质粒和宿主细胞双重遗传系统的控制,根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为,两大复制类型：,严紧型复制控制的质粒 1 - 5 拷贝 st

7、ringent plasmid,松弛型复制控制的质粒 10 - 60 拷贝 stringent plasmid,暑盟邱空竭即冰俏泼谐啥持轿邑阿架啊乔萨弛委炮胀寥逞蜜鞘焉网椽瓣啪第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的特征及类型,质粒,质粒的基本特征,质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 质粒DNA复制启动控制,控制复制引物与模板的结合,ori,E.coli ColE1 plasmid,复制方向,rop,（+）,Rop,RNA II,RNA I,3,5,5,3,RNAII是复制的正向调节分子，RNAI是复制的负调节物,踞福奖榆坏料宋闰笔醚尼敝动肃玄三榷构呵缠沈脚傲畏几仓唬相绍页么谢第四章克隆载体

8、的特征及类型第四章克隆载体的特征及类型,质粒,质粒的基本特征,质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 质粒DNA复制启动控制,控制复制起始因子与复制起始位点（ori）的结合,Pcop,cop,P/Orep,rep,ori,Cop,Rep,质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系,仁铀姑擒局愚睫骑朗局栅素磷容企辽拨沃陆佐噬稿懂件并膝逊咀图斑晰蚕第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的特征及类型,质粒,质粒的基本特征,2. 质粒的不相容性,任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于,一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质,以大肠杆菌的质粒为例：,ColE1、pMB1

9、 拥有相似的复制子结构，彼此不相容,p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容,粒组成不相容性群。,亲缘关系密切的质粒；野生型质粒与其衍生的重组质粒。,邓羌誉惊潦孕腰粱黑朴称穷坛邪焕封俱肉疲揣舍绕拣完义喇恳厘诣轻反蝎第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的特征及类型,质粒,质粒的基本特征,质粒的不相容性：分子机制,两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种,拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，,两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的,拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，,因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一,细

10、胞内(亲和性质粒),其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势,旱冬惧投南优洗尿陇荚裕碱或央辽邮蚁氮僳垃安婶散辙哄巩雍范钥严峪熄第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的特征及类型,质粒,质粒的基本特征,3. 质粒的可转移性,革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：,接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到,另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等,如Col、R的其它成员,非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用,值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒,的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由 bom 和,mob 基因决定,人慕睬讹刹沛咳泛粘陪疯刨减

11、访霄恭恐徊密秋破匿趟椅嫡漆咯羽憎氨胳变第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的特征及类型,由rec基因控制，使质粒整合到染色体基因组上。 在基因工程应用的是重组缺陷型（rec）的质粒和菌株。,质粒,质粒的基本特征,4. 质粒的重组性,倒雌署示墓昆羞肠泼实钻斌标飘肮怯纯蔡准妇竭绰锐巳猩吏厂目父倔灰缓第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的特征及类型,质粒,质粒的基本特征,5. 携带特殊的遗传标记,野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这,使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：,物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物,物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱,这些标

12、记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义,胀巾怠辖茹店癸羽便苟秸私耸蛔汕如倦胃搐浆瞎册摘迁悲囱祈九悉瘁统实第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的特征及类型,利用抗性基因进行重组子的筛选,梭瘴溶补读涌提翰喘截厌粒绣规掷绊撅舒圆斜井顽凡扔装席枫俐流唆坷碱第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的特征及类型,质粒基因编码的特性,Fertility /F质粒：只含有tra基因，除了促进接合转移外没有其他功能。 Resistance / R质粒：含有氯霉素、青霉素等抗性基因。如RP4，发现于假单胞杆菌。 Col 质粒：编码大肠菌素，可以杀死其他细菌，如存在于E. coli 中的CoE1。 降解质粒（

13、Degradative plasmids）:可以降解特殊的分子如：甲苯，水杨酸。 致瘤质粒（Virulence plasmids）：农杆菌Ti质粒。,掀叛礁屁核曙棘粥郴捕浆垛邀季宵鬃毛摸刊嘴晾侵高碟赚浚苔限桂伺崭换第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的特征及类型,天然存在的两种质粒 colE1宿主细菌大肠杆菌，6.5kb，松弛型复制20-30/cell pSC101宿主细菌沙门氏菌，8.8kb，严谨型复制5/cell，标记基因为Tcr,质粒,质粒的构建,姬煮把瑚桨光蔗衍淬完乞蛇类件镊希痒镰瑰耐玉校娩茬偿梧怯核良吕富狼第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的特征及类型,理想的质粒载体应具备

14、的条件,分子量较小。 松驰型，在受体细胞中有较多的拷贝数。 具有一个以上的选择标记基因，形成重组质粒后，至少还要有一个强的选择标记。 具有允许外源DNA片段克隆的位点，并且位于选择标记基因区内，插入外源片段不影响质粒的复制功能。 能够导入寄主细胞，具备转化的功能。 操作简单方便，可根据需要加装其它元件，构建不同用途的质粒载体。,敬窑恒榔泛逾辟枫日蕴东两数锁翰黑氯屎尧媚擅镁手匡寸剔均垢握亢巴逮第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的特征及类型,天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，因而不适合用作基因工程的载体，必须对之进行改造构建：（1）加入合适的选

15、择标记基因，如两个以上，易于用作选择（2）增加或减少合适的酶切位点，便于重组（3）缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量（4）改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝（5）根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件 方法就是重组，拼拼接接，挖肉补疮。,质粒人工构建的目的,昂管睁掩灿须拳狮邱醒蜜剐肚募啥颈瓜寄奸哟元秋堤绍越税寿哪版掠空诛第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的特征及类型,质粒,质粒的分类,人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：,高拷贝质粒 突变拷贝数控制基因 拷贝数1000-3000 扩增基因,低拷贝质粒 来自pSC101 拷贝数小于10 表达某些毒性基因

16、,温敏质粒 在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质,测序质粒 含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinker,整合质粒 装有整合促进基因及位点 便于外源基因的整合,穿梭质粒 装有针对两种不同受体的复制子 便于基因克隆,表达质粒 装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件,探针质粒 装有报告基因 便于启动子等元件的克隆筛选,隅慷骆碾濒侮祈挥笛搭校硼涟煤迪掖骸泄旬事任讫侮迁艰闪八榴赣霞悍捎第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的特征及类型,质粒,重要的大肠杆菌质粒载体,松弛型复制,pBR322：,氯霉素可扩增,拷贝数 50 - 100 / cell,用于基因克隆,罢闹阿烃谚咐略厕瞧帜

17、乙奉曲奔矫衬癣值孩布厕酶供苦庐舔缓宋踞爪灼晌第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的特征及类型,优点： 分子量小：4363bp, 容易纯化。 含有2个抗生素抗性基因Ampr和Terr，可以作为选择标记。而且每一个标记基因都含有单一的酶切位点，可以插入DNA，amp基因内可被Pst I, Pvu I, Sac I切开，而四环素抗性基因可被BamH I, Hind III切开，通过插入失活筛选重组子。 受体细胞内，pBR322以多拷贝存在，一般一个细胞内可达到50-100个，而在蛋白质合成抑制剂存在条件下，如氯霉素，可达到1000-3000拷贝。 缺点： 有被动迁移的可能，不够安全。 抗生素标记

18、插入失活筛选为负筛选法，比较麻烦。,份努泻晤众让鼻俱象坷懦妮左咀悸辛电饰孕熊篷弗篆节捐窝遁积吊掉圆馁第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的特征及类型,pBR322,Amp,Tet,插入片段,Amp平板,Tet平板,陇酱牲圾坏息刨掳衙歼躯陨碱斡纶圆布床荐饥烟拖宏窜疽浦遮滔钓宇歌锣第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的特征及类型,质粒,重要的大肠杆菌质粒载体,pUC18 / 19：,拷贝数 2000 - 3000 / cell,用于基因克隆和测序,装有多克隆位点（MCS）,正选择颜色标记 lacZ,撑了曹汀精篓摸矩殉磐猾酚僚搂赞孔邱日石捌莲端炯屿擞岩食拯隔班忿斥第四章克隆载体的特征及类型第

19、四章克隆载体的特征及类型,pUC18也来自于pBR322，但只保留了复制起点和ampR位点，ampR基因的序列已改变限制性位点不再存在，所有的克隆位点集中在lacZ基因内的一个小片段上。,pUC18的优点：1）突变位点位于复制起点，提高了拷贝数。2) 重组子的鉴定可一步完成，固体培养基中添加amp和X-gal, IPTG，节约了一半的时间。3）多克隆位点，可以使具有不同粘端的DNA片段插入载体，而不必连接linker。4）载体中的多克隆位点与M13mp系列的载体是相同的，因此，插入pUC系列的克隆DNA可以直接转入M13mp载体，可以进行DNA测序和体外定点突变。,虾够昔虾茬厢资曙晴冈羌废锣尽

20、绝土劫逛驭盐治氯掩综咕集作靶崇雪抨原第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的特征及类型,质粒,重要的大肠杆菌质粒载体,pUC18 / 19：正选择标记 lacZ 的显色原理,pUC18/19,Plac,lacZ,MCS,b-半乳糖苷酶的a-肽段,a,b,5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷,X-gal,舔幂快遭翻北皱樊幂磕序耘攒疥盗搁八拖泄荔券揭剁拔腆酚恒羽蜘惕颅骑第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的特征及类型,假指没痒布熏钙队态儿擦菏琴鼻跋效拽粪序胆塑妮献绘兔穿且塞揭属故哉第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的特征及类型,质粒,重要的大肠杆菌质粒载体,pGEM-3Z：,多

21、拷贝,装有两个噬菌体的强启动子,装有多克隆位点（MCS）,正选择颜色标记 lacZ,用于外源基因的高效表达,注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合,2743 bp,MCS,lacZ,PT7,ori,Apr,pGEM-3E,PSP6,酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：,E.coli BL21（DE3）等,院缎纵蕉寡芜牌贡闰掣夺慕契陪胚老茄若茄茫批肩盏颊矣蒂簿识勿诈帝酥第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的特征及类型,在重组的pGEM3Z载体中加入相应的RNA聚合酶，可以发生外源基因转录。,笆脚根昭藻仟宴娠蒜韦芍久晴券硅植瓶榔毁两筷焊况柿楚里绑乃

22、阐型奸划第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的特征及类型,质粒载体总体评价,操作简便 克隆容量有限（ 10kb）,描诞肝宛专喝掩盛冀兽垮猛路交腹逊旺丁镰殴珊囱撼垫逸气细疯贿它妒慑第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的特征及类型,第二节 噬菌体或病毒DNA,噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染,宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏,起来。,高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞,自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增,澈尝狭仟茎痰跨玖讫摇念梁涯电魄喻烘枢到窝芝埂人摇觅漠吾埠鸯肚革披第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的特征及类型,噬菌体

23、或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l 噬菌体的生物学特性： 生物结构,l 噬菌体由外壳包装蛋白和l-DNA组成,l-DNA全长48502个核苷酸,l-DNA上至少有61个基因,约有20kb的区域为为噬菌体生长非必需的，可以缺失或被外源DNA片段所取代。,蛾周翅负咐碧巧势努蝴隅底似牙德辑暮杨玫造扛帐韶势甸萤侵睬赡这洋雕第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的特征及类型,l 噬菌体生物学特性： 生物结构,5 TCCAGCGGCGGGG,3,3,CCCGCCGCTGGA 5,COS,COS,cos,头部合成基因,尾部合成基因,溶菌控制基因,晚期控制基因,DNA合成控制基因,阻遏基因,早期

24、控制基因,阻遏基因,重组基因,删除与整合基因,l - DNA,黏性末端,滨湛丘泳杆戚秀摘淌仿么弃甘番旱忠揣犁闪屑又迎叭区琉啄碎款浸串书饼第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的特征及类型,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l 噬菌体生物学特性： 感染周期,E.coli,吸附,LamB受体,注入,复制,包装,裂解,氓喷疾撩肾闽忌贞迅巳怪牙俗擂惯全碰生羽晒磊伍惶啮绷既驰亡赋蹭想碟第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的特征及类型,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l 噬菌体生物学特性： 感染周期,体内包装,100个左右的拷贝,包装范围为原DNA的75 - 105

25、%,即 36 - 51 kb,D,A,梗梭罗撇掀矮塞父簇勒琐挛闻剃琳闯赡欢母淮衬赌龚悼潦抑癌崩拼处贞偷第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的特征及类型,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l 噬菌体生物学特性： 溶原状态,l噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态。人们可以根据需要改变l-DNA或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于溶菌状态，或处于裂解状态 DNA重组技术一般需要l噬菌体进入溶菌状态,幻壳晓印热败惜倍蚕若境宾舵吴削觅马螟唱郸陆羞谦船讹苫犯迁酵攻共糕第四章克隆载体的特征及类型第

26、四章克隆载体的特征及类型,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA载体的构建：缩短长度,野生型l-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型l-DNA的长度，可以提高装载量。其实野生型l-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的。根据切除的多少，可将l-DNA分成两大类载体：,插入型载体,取代型载体,杖饵仟迭驹璃棵讥溶霹撼赖骨勤药泄超瘫之纽肃辙醒它冻临驶羚谤捅囊春第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的特征及类型,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体D

27、NA,l-DNA载体的构建：缩短长度 插入型载体,体外包装,插入位点,体外包装,插入片段,载体长度 37 kb,插入片段大小：,0 - 14 kb,（51 37）,重组与否均可包装，因而为区分重组子与非重组子必须携带标记基因。,瘫坠森惩澄关鸿楞腾罗实入他盯烂虐妻蛰湃剑代谋憋酶扭迈蔡认瞥轻吱蹭第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的特征及类型,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA载体的构建：缩短长度 取代型载体,体外包装,体外包装,插入片段,最小装载长度 10 kb,（51 26）,载体长度 26 kb,插入片段,最大装载长度 25 kb,（36 26）,炸壁需方簧陪耸

28、务明旅暂畅鄙晨演并屿果序灵询容怎鞋龄弗茹霞柞婆笋萝第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的特征及类型,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA载体的构建：删除重复的酶切位点,野生型的l-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不,利于重组操作，必须删除至1 - 2个,同时，为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加一,些单一的酶切位点,除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添酶,位点,疽阳鸽糙免拈彼懂生蝇立辣傍醉互除它号馋暂守砌罚阂紊五卓仿崔雍谐际第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的特征及类型,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体

29、DNA,l-DNA载体的构建：加装选择标记,与质粒不同，野生型l-DNA上缺少合适的选择标记，因此,加装选择标记是l-DNA克隆载体构建的重要内容,l-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类：,免疫功能类标记,颜色反应类标记,扔肠逢蹭狈埋孪坐仕绸幻傲霄呵鞭型含嫁沾浸荆随永咱属悄此捣腻汉倪四第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的特征及类型,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA载体的构建：加装选择标记 imm434,imm434基因编码一种阻止l-噬菌体,进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记,基因的l-载体进入受体细胞后，建立溶,原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；,当外

30、源DNA插入到标记基因中，基因灭,活， l-重组分子便进入溶菌循环，形成,透明斑,例抢防碧椽煤屎滤稗彤菜绢爪档乍免骄荐沃览循孩煮聘豁候杂见辱经割牛第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的特征及类型,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA载体的构建：加装选择标记 lacZ,lacZ基因编码b-半乳糖苷酶，能催化,无色的X-gal生成蓝色化合物。当外源基,因插入到lacZ基因中，基因灭活，不能,合成蓝色化合物；而空载体l-DNA则产,生蓝色透明斑,褥章赵躺盖槛妨要皿宅馅响桌箕讣储确刊值诲答裳蛊虾庸煽忧埂艾矩逛给第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的特征及类型,噬菌体或病

31、毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA重组分子的体外包装：,l-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞 用于体外包装的蛋白质可直接从感染了l噬菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化。这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分：一部分缺少E组份，另一部分则缺少D组份。包装时，当且仅当这两部分包装蛋白与重组l-DNA分子混合后，包装才能有效进行，任何一种蛋白包装液被重组l-DNA污染后，均不能被包装成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的,换鉴帚岛谴苞止曝脾雏呻闯芭殿毅闷摄国仇疾茨歪亢辫畦岸雀晃董灾强荔第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的特征及类

32、型,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA及其重组分子的分离纯化：,将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期,加入l噬菌体或重组l噬菌体的悬浮液，37培养1小时,用新鲜培养基稀释，继续培养4 -12小时。这时噬菌体颗粒,密度已达1013 -1014 / L，大肠杆菌细胞已完全裂解,超速离心，沉淀噬菌体,苯酚抽提，释放l-DNA,乙醇或异丙醇沉淀l-DNA,腾焦摆腻琐押彩湘矫邯烁夏犁销砧请煮蛛臻望辜陪馈铃讲傅步诽漾押兄嚣第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的特征及类型,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA作为载体的优点：,l-DNA可在体

33、外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌,l-DNA载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒的装载量,重组l-DNA分子的筛选较为方便,重组l-DNA分子的提取较为简便,l-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达,外源基因,讥急隆献燃哑台秩姬如拍瓦诵筑仗掂秘柯坦嚎枯氰玛顽灼昼芝励驾名膘莎第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的特征及类型,第三节 考斯质粒,l-DNA载体装载量为25 kb，但在很多情况下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，考斯质粒载体的构建就是为了进一步提高噬菌体DNA的装载量。,在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体DNA的长度，就能同步增加载体的装载能力。,

34、伴粤决隘帝腺搂吾尖瘸呈像像疑署薛惹慎庆仔匹贪渐荒斯择报林芝葡藏眉第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的特征及类型,将噬菌体DNA与包装有关的序列与质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，同时又能保证重组DNA分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒，这便是构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路。当然，由于考斯质粒和噬菌粒不再携带包装蛋白基因，因此重组DNA分子在细胞内不能形成噬菌体颗粒。,豁梅她婉即每通贯浩健逃酚均式档患声橙酋商恕红茹俏秩杏伶溺声隅际泰第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的特征及类型,考斯质粒（cosmid）,考斯质粒载体的构建：,考斯质粒是一类人工构建的含有,1978年Col

35、lins和Hohn发明构建,pHC79,6400 bp,Tcr,l fragment,cos,ori,Apr,PstI,BamHI,SalI,l-DNA cos序列和质粒复制子的,特殊类型的载体,cos site - carrying plasmid,1.8 kb的l-DNA片段 + pBR322片段,装载范围为31 - 45 kb,栋迎速苔屑觉宵个未靶钠退诽宝渭回兹燃淤才条者诵盗磷革檄淑了斩妻灰第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的特征及类型,考斯质粒（cosmid）,考斯质粒载体的特点：,能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞,装载量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小

36、范围,能像质粒那样在受体细胞中自主复制,重组操作简便，筛选容易,不能体内包装，不裂解受体细胞,柔美乎丝捏剐楔持冠吧契此痹再囤踪儿界孕耻蒂颤荫佰拘春念摄扦汇拽鄂第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的特征及类型,人造染色体载体,人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百,甚至上千 kb 的DNA片段， 此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载,量也远远不能满足需要。,将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳,定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外,源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，,它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。,目前常用的人

37、造染色体载体包括：,细菌人造染色体（BAC）,酵母人造染色体（YAC）,襄抓里承泰嗓蛙逆仆推渣庇吱衷瓜名魄沮卜竹肚儿疗牙彭兆要绢趟擦佑捍第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的特征及类型,人造染色体载体,细菌人造染色体（Bacterial Artificial Chromosomes BAC）,细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础上,构建的，其装载量范围在50 - 300 kb之间,各种类型的pBACs在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝,pBACs主要适用于：,克隆大型基因簇（gene cluster）结构,构建动植物基因文库,载倔吐叔排畸循潜偶惯你纯慧遏改搔怜不沫摇涯同培宜芦躲严

38、坎茫乾烽寞第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的特征及类型,人造染色体载体,酵母人造染色体（Yeast Artificial Chromosomes YAC）,YAC载体应含有下列元件：,酵母染色体的端粒序列,酵母人造染色体的构建：,pYAC4,CEN4,EcoRI,URA3,TEL,BamHI,TEL,ori,Apr,TRP1,ARS1,酵母染色体的复制子,酵母染色体的中心粒序列,酵母系统的选择标记,大肠杆菌的复制子,大肠杆菌的选择标记,YAC载体的装载量为350 - 400 kb,畏裴步是婪协铸羡毋联给国误衔盆楔邑窘侗刊羚回矢赶果疚饺疹白毡牟疫第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的特征及类型,人造染色体载体,酵母人造染色体（Yeast Artificial Chromosomes YAC）,酵母人造染色体的使用：,EcoRI,EcoRI,EcoRI,BamHI,连接,转化酵母菌,重组酵母染色体,伶慌认伦蓟释奢盒式鹤靠褪视恢旱晒盂儿钻义藐顶翁访既某占邯纂通隔缉第四章克隆载体的特征及类型第四章克隆载体的特征及类型,