第06讲第二章第四节核酸类药物的生产.ppt

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1、第二章 天然生物材料的提取制药 p 生化药物概述 p 氨基酸类药物的生产 p 多肽和蛋白质类药物的生产 p 核酸类药物的生产 p 酶类药物的生产 p 糖类药物的生产 p 脂类药物的生产 p 维生素和辅酶类药物的生产 守 狸 滴 址 梢 害 咽 鸿 屡 斡 速 兑 弗 去 磺 著 退 您 佬 唉 贵 贺 柒 帕 箕 启 耀 艇 刘 譬 姻 盏 第 0 6 讲 第 二 章 第 四 节 核 酸 类 药 物 的 生 产 第 0 6 讲 第 二 章 第 四 节 核 酸 类 药 物 的 生 产 核酸类药物的生产 核酸知识复习 核酸药物的分类 核酸类药物的生产方法 核酸类药物的生产实例 核酸类药物的检测 思

2、考题 评 寂 越 禁 句 活 街 忠 暮 谓 咬 耻 趟 乓 狰 防 榨 钡 井 俐 守 漠 绪 婉 预 曝 盾 鞠 横 释 戊 笔 第 0 6 讲 第 二 章 第 四 节 核 酸 类 药 物 的 生 产 第 0 6 讲 第 二 章 第 四 节 核 酸 类 药 物 的 生 产 核酸知识复习 核糖（核糖脱氧核糖）核糖（核糖脱氧核糖） 核苷核苷 嘌呤（腺嘌呤、鸟嘌呤）嘌呤（腺嘌呤、鸟嘌呤） 碱基碱基 核酸核酸核苷酸核苷酸 嘧啶（胞、尿、胸腺嘧啶）嘧啶（胞、尿、胸腺嘧啶） （DNADNA、RNARNA） 磷酸磷酸 DNADNA和和RNARNA是存在于细胞中的正常成分。是存在于细胞中的正常成分。 DN

3、ADNA主要存在于细胞核中，少量（主要存在于细胞核中，少量（2%2%）存在于线粒体和叶绿体中；）存在于线粒体和叶绿体中； RNARNA主要存在于细胞质中，少量（主要存在于细胞质中，少量（10%10%）存在于核仁、核浆和染色体）存在于核仁、核浆和染色体 中。中。 核酸的含量与细胞大小无关，以生长旺盛的组织细胞中含量较多，如核酸的含量与细胞大小无关，以生长旺盛的组织细胞中含量较多，如 动物胰脏、脾脏、胸腺，植物的茎尖、根尖及各种分生组织等。动物胰脏、脾脏、胸腺，植物的茎尖、根尖及各种分生组织等。 柠 蛹 喷 睹 宴 珊 迄 须 瓦 弱 举 方 擞 轴 铭 葛 屁 锐 鄙 急 映 纹 专 站 殷 酮

4、 翻 橱 县 取 咸 郁 第 0 6 讲 第 二 章 第 四 节 核 酸 类 药 物 的 生 产 第 0 6 讲 第 二 章 第 四 节 核 酸 类 药 物 的 生 产 核酸药物的分类 一、具有天然结构的核酸类物质 如：DNA、RNA、肌苷、ATP、辅酶A、脱氧 核苷酸、肌苷酸等。 获得： 微生物发酵或从生物资源中提取生产。 药理功能： 有助于改善机体的物质代谢和能量代谢平衡， 加速受损组织的修复，促使机体恢复正常生理功 能。 著名企业：珍奥集团、GENTA公司 澎 掏 贱 渭 臼 鞍 谊 稼 寝 匈 脯 缮 走 呈 芯 咳 获 也 就 昨 词 舞 调 病 湖 拉 始 饲 痘 蜜 涌 陇 第

5、0 6 讲 第 二 章 第 四 节 核 酸 类 药 物 的 生 产 第 0 6 讲 第 二 章 第 四 节 核 酸 类 药 物 的 生 产 核酸药物的分类 二、天然碱基、核苷、核苷酸的类似物或聚合物 如：三氟代胸苷、叠氮胸苷、拉米夫定（嘧啶 类）、阿德福韦（嘌呤类）、恩替卡韦（第三代 核苷类抗乙肝病毒药物）等。 获得： 由自然结构的核酸类物质通过半合成生产。 药理功能： 治疗病毒病如乙肝、肿瘤、爱滋病的重要药物 ，也是产生干扰素、免疫抑制剂的临床药物。 沧 引 原 公 术 描 爵 绩 扫 额 痈 巍 诽 豹 茁 标 咒 淘 波 抄 谓 苗 霄 焙 制 阻 掇 奠 旭 兴 抄 椿 第 0 6 讲

6、 第 二 章 第 四 节 核 酸 类 药 物 的 生 产 第 0 6 讲 第 二 章 第 四 节 核 酸 类 药 物 的 生 产 核酸类药物的生产方法 （一）核酸类药物的原材料（一）核酸类药物的原材料 除病毒外，所有的动植物组织中都含有除病毒外，所有的动植物组织中都含有 核酸类物质，包括大分子核酸类物质，包括大分子DNADNA和和RNARNA、小、小 分子的核苷酸、核苷、碱基等成分，但不同分子的核苷酸、核苷、碱基等成分，但不同 的组织中含量有所不同。的组织中含量有所不同。 动物动物胸腺胸腺中中DNADNA含量较多，是提取含量较多，是提取DNADNA 的原料；的原料；酵母酵母细胞中细胞中RNAR

7、NA含量最多，是提含量最多，是提 取生产取生产RNARNA的主要原料。的主要原料。 忆 限 疯 罢 祝 藏 危 负 篱 地 糠 瓤 契 统 狠 避 反 莹 磁 炒 可 鞋 窃 标 视 崩 耙 盂 惩 澈 邦 焕 第 0 6 讲 第 二 章 第 四 节 核 酸 类 药 物 的 生 产 第 0 6 讲 第 二 章 第 四 节 核 酸 类 药 物 的 生 产 核酸类药物的生产方法 （二）（二）DNADNA和和RNARNA的生产方法的生产方法 1 1、分离提取、分离提取 核酸的生产一般采用提取法，即从粉碎、破裂的生物组核酸的生产一般采用提取法，即从粉碎、破裂的生物组 织细胞中通过一定的方法获取总织细胞

8、中通过一定的方法获取总DNADNA或总或总RNARNA。 如需进一步的纯化，常用纯化方法如柱层析、凝胶电泳 和密度梯度超离心。 、人工合成 获取大分子核酸的另一方法是人工合成，即利用化学的 方法按照设定的核苷酸顺序逐一加入形成核酸。现已有核 酸合成仪，但合成长度还有一定限制，并且该仪器价格昂 贵。因此这种方法一般用于研究，不适合生产。 陌 方 蔫 珐 酱 宪 境 燕 凋 赁 妹 世 铱 宵 鲤 锗 扣 沏 符 篓 笼 未 力 拯 卒 戚 戍 串 酿 脸 执 饰 第 0 6 讲 第 二 章 第 四 节 核 酸 类 药 物 的 生 产 第 0 6 讲 第 二 章 第 四 节 核 酸 类 药 物 的

9、 生 产 核酸类药物的生产方法 （三）核苷酸、核苷及碱基类似物的生产方法 酶解法、半合成法、发酵法 1、酶解法 生产酵母，从酵母中提取RNA，RNA经青霉菌 属或链霉菌属等微生物产生的酶进行酶解，制成 各种核苷酸。 2、半合成法 微生物发酵与化学合成并用。 3、直接发酵法 采用营养缺陷型菌株或营养缺陷型兼结构类似 物抗性菌株来发酵大量生产目的核苷或核苷酸。 扩 遵 粘 免 藩 耍 劫 彪 掐 与 忻 润 煽 吩 昆 种 锯 字 仓 缕 账 羚 砸 阶 磨 弥 叛 挨 芦 毁 谤 滑 第 0 6 讲 第 二 章 第 四 节 核 酸 类 药 物 的 生 产 第 0 6 讲 第 二 章 第 四 节

10、核 酸 类 药 物 的 生 产 核酸类药物的生产实例 （一）（一）DNADNA的生产技术的生产技术 提取原理提取原理 在细胞内的核酸通常是与蛋白质形成复合物在细胞内的核酸通常是与蛋白质形成复合物核糖核蛋白（核糖核蛋白（RNPRNP ）和脱氧核糖核蛋白（）和脱氧核糖核蛋白（DNPDNP），这两种复合物在不同电解质溶液中的），这两种复合物在不同电解质溶液中的 溶解度有较大差异。溶解度有较大差异。 RNARNApro.RNPpro.RNP（核糖核蛋白）（核糖核蛋白） DNADNApro.DNPpro.DNP（脱氧核糖核蛋白）（脱氧核糖核蛋白） 00.14M NaCl00.14M NaCl溶液溶液 D

11、NP DNP溶解度逐渐降低，溶解度逐渐降低，RNPRNP的溶解度很大；的溶解度很大； 0.14M0.5M NaCl0.14M0.5M NaCl溶液溶液 DNP DNP溶解度逐渐增加。溶解度逐渐增加。 在制备在制备DNADNA时，可利用时，可利用0.14M 0.14M NaClNaCl溶液使溶液使DNPDNP与与RNPRNP分开。由于分开。由于 DNPDNP在浓盐溶液中的溶解度比稀溶液大得多，所以，首先采用浓盐溶在浓盐溶液中的溶解度比稀溶液大得多，所以，首先采用浓盐溶 液（液（1 12M2M）尽量抽提）尽量抽提DNPDNP，然后再去除杂蛋白。，然后再去除杂蛋白。 浊 勒 惮 叮 琐 更 老 停

12、寅 沛 茹 容 己 宗 柬 吩 滴 蛋 滴 室 俊 湿 槛 肛 挺 捆 辉 图 虚 柜 敌 恬 第 0 6 讲 第 二 章 第 四 节 核 酸 类 药 物 的 生 产 第 0 6 讲 第 二 章 第 四 节 核 酸 类 药 物 的 生 产 核酸类药物的生产实例 工艺路线 抽提 猪脾脏 预处理 冷冻，绞碎 组织浆液 预处理 0.1M NaCl-0.5M 柠檬酸混合液， 离心 沉淀 1.71M NaCl 上清液 （DNP） 沉淀 （DNP） 溶解液 0.14M NaCl 沉淀物 白色纤维状 DNA 10% NaCl 上清液 （DNA） 氯仿-异戊醇95%乙醇 真空干燥 惮 受 壬 妄 磐 衣 则

13、肢 字 泵 婆 别 塌 代 火 魁 毒 汝 毅 支 嘉 抱 蛇 蹿 当 热 喻 奇 稠 者 奸 蒜 第 0 6 讲 第 二 章 第 四 节 核 酸 类 药 物 的 生 产 第 0 6 讲 第 二 章 第 四 节 核 酸 类 药 物 的 生 产 核酸类药物的生产实例 （二）（二）RNARNA的生产的生产 1 1、来源：微生物、来源：微生物酵母酵母 通常在细菌中通常在细菌中RNARNA占占5 52525，在啤酒酵母中，在啤酒酵母中 占占2.72.71515，在霉菌中占，在霉菌中占0.728%0.728%，面包酵母含，面包酵母含 RNA 4.1RNA 4.17.27.2。 酵母菌体提取优点：酵母菌体

14、提取优点： （1 1）收率高；）收率高； （2 2）提取容易。）提取容易。 丑 焚 翰 够 牲 报 钧 发 蜒 鞋 果 彻 悟 衰 谓 卧 侠 珠 眯 钧 绽 削 彝 凯 萨 央 种 颅 削 雅 么 爬 第 0 6 讲 第 二 章 第 四 节 核 酸 类 药 物 的 生 产 第 0 6 讲 第 二 章 第 四 节 核 酸 类 药 物 的 生 产 核酸类药物的生产实例 、RNA的提取等电沉淀法 酵母菌体 提取液抽提清液 RNA粗品RNA精品 稀NaOH，提取中和，分离 洗涤、干燥 pH2.5 3 3、工艺过程、工艺过程 （1 1）预处理：压榨、除水；（）预处理：压榨、除水；（2 2）提取：）提取

15、：0.13%NaOH0.13%NaOH，使细胞壁变性，使核酸从细，使细胞壁变性，使核酸从细 胞内释放出来；（胞内释放出来；（3 3）中和、除菌体；（）中和、除菌体；（4 4）分离：等电点法，调）分离：等电点法，调pH2.5pH2.5，使，使RNARNA沉淀沉淀 下来；（下来；（5 5）洗涤、干燥）洗涤、干燥 赶 护 灼 趴 恶 孵 栋 炕 谜 李 曼 堑 绎 滓 庶 落 兴 棠 防 冻 啃 色 恐 舟 耪 峪 香 曳 鸳 懂 咙 什 第 0 6 讲 第 二 章 第 四 节 核 酸 类 药 物 的 生 产 第 0 6 讲 第 二 章 第 四 节 核 酸 类 药 物 的 生 产 核酸类药物的生产实

16、例 （三）（三）ATPATP制备制备 腺嘌呤前体 腺苷 AMP ATP 枯草杆菌160 （Smr +Try+Pur） 微生物或化学转化 微生物 枯草杆菌枯草杆菌160160（SmSm +tyr +tyr +pur+pur ）菌株，在添加腺嘌呤 ）菌株，在添加腺嘌呤 （由丙二氰化学合成）的培养（由丙二氰化学合成）的培养 基上培养，可以大量累积腺苷基上培养，可以大量累积腺苷 。 也可使用发酵法直接生产也可使用发酵法直接生产 ATPATP，所用菌种是产氨短杆菌，所用菌种是产氨短杆菌 ATCC6872ATCC6872。 客 充 隆 朝 蓝 聋 酵 鸭 用 蔼 秤 摘 峭 卢 丁 吻 咽 亡 梅 对 骆

17、 恼 忽 允 阁 酣 种 答 琵 迭 琵 啄 第 0 6 讲 第 二 章 第 四 节 核 酸 类 药 物 的 生 产 第 0 6 讲 第 二 章 第 四 节 核 酸 类 药 物 的 生 产 核酸类药物的生产实例 （四）辅酶A的生产 TCA，除蛋白 新鲜猪肝 【绞碎】 肝浆 【水，提取】 提取液 滤液 GAM树脂 GAM-CoACoA浓集液LD-601-CoA CoA粉 HCl-NaCl CoA酸化液 HCl，酸化LD-601，再吸附 酸化 浓缩液 浓缩 上清液沉淀物 丙酮沉淀脱水干燥 拢 呆 往 熊 吠 衫 澳 燕 疲 蛹 袜 梁 紧 鞠 床 拔 维 掣 稀 袒 曹 酉 贞 询 短 佬 翅 熟

18、 岂 起 凭 拧 第 0 6 讲 第 二 章 第 四 节 核 酸 类 药 物 的 生 产 第 0 6 讲 第 二 章 第 四 节 核 酸 类 药 物 的 生 产 核酸类药物的检测 1、DNA含量测定 DNA是磷酸和戊糖通过磷酸二酯键形成的长链， 所以磷酸或戊糖的量正比例于DNA的量，可通过 测定磷酸或戊糖的量来测定DNA的量，前者称为 定磷法，后者称为定糖法。 （1）定磷法 磷酸与钼酸反应生成磷钼酸，再转变为钼蓝，吸 收峰在660nm。 （2）定糖法二苯胺法 酸性条件下，DNA与二苯胺共热，生成蓝色化合 物，吸收峰595nm。 踢 轩 菊 用 饥 举 毖 狡 才 怨 凯 嘿 物 久 闺 矿 浑

19、 哭 澈 覆 顶 魏 番 辜 溜 湘 人 仑 蓝 酚 秆 葱 第 0 6 讲 第 二 章 第 四 节 核 酸 类 药 物 的 生 产 第 0 6 讲 第 二 章 第 四 节 核 酸 类 药 物 的 生 产 核酸类药物的检测 2 2、RNARNA含量测定含量测定 （1 1）定磷法）定磷法660nm660nm； （2 2）定糖法）定糖法地衣二酚（苔黑酚）法。地衣二酚（苔黑酚）法。 盐酸水解盐酸水解RNARNA，使核糖游离出来，并生成糠醛，使核糖游离出来，并生成糠醛 ，与地衣二酚反应呈蓝绿色，在，与地衣二酚反应呈蓝绿色，在670nm670nm处有最大处有最大 吸收峰。吸收峰。 3 3、核苷酸、核苷含

20、量的测定、核苷酸、核苷含量的测定紫外分光光度法紫外分光光度法 它们都有特殊的紫外吸收曲线，选取合适的波它们都有特殊的紫外吸收曲线，选取合适的波 长，可以根据其吸收值测定核苷、核苷酸的含量长，可以根据其吸收值测定核苷、核苷酸的含量 。 炉 启 回 又 稼 公 销 皆 捕 捷 闲 卡 禄 束 榴 替 大 遍 根 抑 骑 吠 猎 佰 摹 侠 尊 跟 蜗 愧 喳 刺 第 0 6 讲 第 二 章 第 四 节 核 酸 类 药 物 的 生 产 第 0 6 讲 第 二 章 第 四 节 核 酸 类 药 物 的 生 产 思考题 核酸类药物的种类和药理功能是什么？ DNA、RNA、ATP及HS-CoA的生产方法。

21、如何检测核酸类药物？ 韧 几 掂 茧 朵 沉 君 累 铅 涨 宗 火 诫 跪 翅 综 崭 叔 玄 剁 摹 囚 精 溉 姓 债 倾 狞 匪 月 了 涛 第 0 6 讲 第 二 章 第 四 节 核 酸 类 药 物 的 生 产 第 0 6 讲 第 二 章 第 四 节 核 酸 类 药 物 的 生 产 核苷酸组分 腺嘌呤腺嘌呤鸟嘌呤胞嘧啶尿嘧啶胸腺嘧啶 华 哄 森 帽 柯 秆 人 皂 宽 综 换 吧 娜 噶 藕 捶 蓟 钥 械 今 号 咕 唾 钮 遮 邪 埂 浮 稠 复 援 涩 第 0 6 讲 第 二 章 第 四 节 核 酸 类 药 物 的 生 产 第 0 6 讲 第 二 章 第 四 节 核 酸 类 药

22、 物 的 生 产 珍奥核酸 蜕 连 洁 胸 员 育 才 枚 骑 币 惋 驳 歪 琶 踌 绩 缉 而 霜 钞 温 蛊 幸 屿 轴 腺 辣 亡 敬 枯 瞪 墨 第 0 6 讲 第 二 章 第 四 节 核 酸 类 药 物 的 生 产 第 0 6 讲 第 二 章 第 四 节 核 酸 类 药 物 的 生 产 DNA药物 翼 她 乖 磐 汪 闻 青 康 襄 颗 颁 尸 痉 仆 趟 翱 熏 泞 痒 粕 到 已 缆 坚 邪 亚 爆 抄 嫡 绳 支 渭 第 0 6 讲 第 二 章 第 四 节 核 酸 类 药 物 的 生 产 第 0 6 讲 第 二 章 第 四 节 核 酸 类 药 物 的 生 产 核苷类药物 恩替

23、卡韦 铀 盘 的 矿 尔 逛 爷 烃 蒸 收 蓉 讳 鼻 一 徽 篓 胖 甥 叙 剖 宵 龚 用 湖 衍 博 来 私 讹 龄 莫 勤 第 0 6 讲 第 二 章 第 四 节 核 酸 类 药 物 的 生 产 第 0 6 讲 第 二 章 第 四 节 核 酸 类 药 物 的 生 产 胸腺 果 缚 抛 隘 卢 矿 便 琐 影 厉 六 敖 橱 过 爱 宅 维 碴 康 牧 揉 酞 瓤 峙 唇 艰 弯 式 睁 冠 荆 悼 第 0 6 讲 第 二 章 第 四 节 核 酸 类 药 物 的 生 产 第 0 6 讲 第 二 章 第 四 节 核 酸 类 药 物 的 生 产 酵母酵母 泛 钓 肾 泥 搔 缄 滚 髓 逐

24、 毅 斜 郡 妈 盐 瞩 渍 拍 粤 乏 痛 陷 脆 栗 菠 赶 市 妒 芒 营 麦 长 嚏 第 0 6 讲 第 二 章 第 四 节 核 酸 类 药 物 的 生 产 第 0 6 讲 第 二 章 第 四 节 核 酸 类 药 物 的 生 产 ABI3948 核酸合成纯化仪 可自动完成DNA的合 成，切割，脱保护，OPC 纯化和定量等过程。在三 个模块中同时进行合成、 切割脱保护和纯化收集， 24小时内可完成48个寡核 苷酸片段的合成和纯化。 插 候 卓 启 侈 员 层 烧 天 和 瓜 俩 吁 漏 球 电 彰 揉 刹 斌 臻 佬 木 植 脉 坊 味 闹 话 砖 油 欢 第 0 6 讲 第 二 章 第 四 节 核 酸 类 药 物 的 生 产 第 0 6 讲 第 二 章 第 四 节 核 酸 类 药 物 的 生 产 密度梯度离心机 陌 光 躇 匝 闻 盘 橱 浦 趾 肉 损 奏 靴 课 根 咨 帽 琢 彻 骋 总 呐 甩 媚 热 帝 奄 胚 芬 绚 迫 柬 第 0 6 讲 第 二 章 第 四 节 核 酸 类 药 物 的 生 产 第 0 6 讲 第 二 章 第 四 节 核 酸 类 药 物 的 生 产