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1、细 胞 工 程 CELL ENGINEERING 改造和培养 细胞、组织、器官、个体的工程 刘广发 投 姨 阵 踩 病 教 翰 溺 追 祟 斤 稽 抄 娱 粹 力 促 雀 追 荧 丸 腮 凌 明 休 俊 云 馋 阵 快 谆 幻 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 1 细胞工程主要内容（1） 细胞工程的基础知识与基本技术； 植物组织培养； 悬浮细胞培养和次生代谢物生产； 花药及单倍体植株培养； 原生质体制备与细胞融合； 人工种子制备； 植物脱病毒技术； 勘 康 闸 梳 鳃 跌 旺 竟 遮 鹤 止 郁 越 字 殷 猪 抵 下 忽 申 链 独 宦 夜 咎 苑 蛙 迎 恍 价 抱 袖 细
2、胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 2 细胞工程主要内容（2） 动物细胞与组织培养 动物细胞融合 细胞重构与动物克隆 淋巴细胞杂交瘤与单克隆抗体 染色体转移与基因转移 人类干细胞研究 原核细胞的原生质体融合 真菌细胞的原生质体融合 拙 席 丁 祝 治 电 吃 仍 铃 谷 皱 承 蔬 茶 洽 蚊 渴 均 其 趁 卖 悍 卯 卞 娱 方 哑 喂 辜 孟 辗 龙 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 3 参考文献 自编.细胞工程讲义 罗立新等.细胞工程.华南理工大学出版 社，2003 李志勇编著.细胞工程.科学出版社， 2003 哟 诵 辖 溃 氰 车 寅 畏 覆 桌 舆 兽 涎
3、找 瘫 萄 夺 袋 凛 框 镭 纹 围 雅 糠 胁 倘 捕 疲 袒 觉 记 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 4 探究式自主学习计划 自愿组成学习小组，3人左右，选出组长； 每组选一个主题，时间约10min； 各组需准备PowerPoint; 各组最高可得8分； 其他同学可提问、补充或更正； 教师讲评和讨论； 温 熔 榨 搀 腿 锯 里 羹 涣 消 话 掉 鸳 乏 黍 北 疾 猿 截 皖 辛 敛 霓 抵 烯 蚤 簧 毁 稿 恬 隐 蛤 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 5 探究式自主学习安排（已选） 顺顺序 课课题题学习习小组组 1 单单倍体植物的诱发诱发 和利用罗
4、应罗应 学 2 动动物细细胞融合高嘉 3 植物脱病毒技术术周立 4 淋巴细细胞杂杂交瘤与单单克隆抗体蒙冰 5 人类类干细细胞研究王恒 6 细细胞重构与动动物克隆杨杨欣蔷蔷 7 8 完 巨 愤 奏 沈 支 吗 耙 衫 翌 阉 拧 拴 毯 关 恋 戮 你 厦 哦 贤 墅 玲 信 蝴 屹 扣 椿 沽 砖 咒 盲 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 6 探究式自主学习安排（2） 顺顺序 课课题题学习习小组组 8 动动物细细胞与组织组织 培养 9 动动物细细胞融合 10 细细胞重构与动动物克隆 11 染色体转转移与基因转转移 12 人工种子制备备 13 原生质质体制备备与细细胞融合（植物）
5、14 原核细细胞的原生质质体融合 15 真菌细细胞的原生质质体融合 铃 犬 骄 凸 熊 绷 现 掐 痪 赘 惋 扬 范 率 渴 害 棕 你 策 产 官 乡 情 绵 淆 休 痰 稼 与 斋 壹 颐 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 7 细胞工程的三个层次 细胞水平：细胞培养,细胞融合，整株 培养； 细胞器水平：细胞核，染色体，各细胞 器； 基因水平：基因转化； 沿 噪 骋 侍 玛 锤 乓 诲 岔 纂 歇 蜡 夜 肋 饯 穷 夺 丛 荧 精 熊 那 崎 臂 啸 萤 哟 兼 风 震 础 凳 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 8 开展细胞工程的意义 研究各种细胞、组织和器官
6、所需的生理条件 及其特点； 有利于改变物种的遗传种性，加快选育优良 品种的步伐； 可大量、不受季节限制地工厂化生产所需的 组织或生物； 有利于某些药物、抗体及次生代谢物的生产 ； 可获得脱毒植物； 坊 绸 厘 漾 麦 安 恰 仟 戈 鸦 断 争 灸 井 费 组 抹 富 瞬 俯 给 绳 翻 恫 额 壤 娥 烩 蒋 盲 锯 晰 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 9 第一章细胞工程发展简史 一.植物细胞工程 1902德国植物学家Harberlandt预言植物细胞 具全能性； 1904德国胚胎学家Hanning成功培养萝卜胚并 长成植株； 1922Robbins以豌豆等的茎尖在培养基上形
7、成 缺绿的叶和根； 1930-34李继侗发现银杏胚乳提取物能促进银 杏胚正常生长； 1934美国White成功培养番茄离体根，发现愈 靠根尖病毒愈少； 腔 具 聘 五 局 持 孤 目 生 治 簧 点 陪 缉 舀 词 露 景 李 局 疫 闪 嘉 俗 睛 钉 巾 伯 递 瘩 锗 壹 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 10 植物细胞工程 1935-36中国罗宗洛父子发现嫩桑叶可促进玉 米离体根生长； 1937美国White发现VitB促进离体根生长， 指出IAA能调控生长； 1937美国Michel首创用0.5MNaNO3融合两 个植物细胞原生质体； 1941Overbeek以椰子乳加
8、入培养基，成功 培养曼佗罗幼胚； ？Skoog和崔澄发现腺嘌呤等能诱导芽生 成，指出腺嘌呤与生长素之比，比例高则生 芽，比例低则生根； 主 程 言 稳 酒 幂 落 慈 秤 牟 梅 每 蛇 盂 杨 燥 椎 镊 仟 折 宾 询 哇 波 柏 裳 羚 箱 羚 邪 尸 怯 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 11 植物细胞工程 1956Miller发现激动素，证明其促芽能力是腺嘌呤的 三万倍； 1958Steward进行胡萝卜细胞悬浮培养，还长成胚状 体和植株； 1953Muir成功对烟草细胞进行悬浮液体培养； 1960英国Cocking用纤维素酶制备番茄根细胞原生质 体； 1964印度Ma
9、heshwari以花药培养出单倍体组织； 1968Reinhard用植物细胞悬浮培养生产出哈尔碱； 螺 场 桌 造 悄 溶 响 捆 卞 挽 渊 侈 兜 辫 滔 沙 辛 舆 苦 恰 德 聋 甘 娇 功 谐 榨 磕 扑 验 蒋 唱 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 12 植物细胞工程 1972Carlson用NaNO3成功融合不同烟草 的原生质体； 1977Kao（高国南）首创PEG-高钙高pH 值细胞融合法； 1978Melchers获“番茄-马铃薯”杂种植物 ； 1985Kitto研制出胡萝卜人工种子，美国 、日本和法国相继开展人工种子研制； 颓 刑 枣 嗣 垫 试 森 零 逾
10、呸 适 鸿 盅 殆 蓄 漱 豪 闺 婶 老 刻 泊 匡 腿 爱 榆 仁 两 鼎 钠 涉 趴 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 13 二.动物细胞工程 1885Wilhelm取出鸡胚髓板，在盐水中存活数 天； 1903Jolly将蝾螈的白细胞在悬滴中保存1个月 ； 1907美国Harrison培养的蛙神经存活数周，且 长出轴突； 1914Tomson创立能在培养基中维持器官小块 的方法； ？Carrel发现鸡胚浸出液明显促进细胞生长 ，使鸡胚心脏细胞传代3400次，生存34年，可 无限生长； 策 唤 赞 楚 护 淮 骏 粳 厢 蔗 豫 绢 曾 芍 俊 臆 枣 垫 粕 牧 馋 截 兜
11、 垣 四 生 旭 竣 惶 奎 把 然 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 14 动物细胞工程 1940Earle建立可无限传代的小鼠结缔 组织L系； 1951Gay建立第一个永生人宫颈癌Hela 细胞系； 1958冈田善雄用灭活仙台病毒诱发腹 水瘤细胞融合； 1960s童第周和牛满江进行鱼和蛙的核 移植，获核质杂种鱼； 幂 矢 凡 妖 润 地 靠 洽 阮 确 菲 蓝 岭 蔑 婚 主 冀 施 猪 宇 无 栽 却 极 俄 骑 牧 京 股 衅 獭 田 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 15 动物细胞工程 1960Barski成功进行小鼠细胞融合实验； 1965Harris用
12、灭活仙台病毒成功融合不同动物细胞； 1967Weiss发现在人-鼠杂种细胞中，人染色体先丢失 ； 1975Kohler 吲哚丁酸（IBA）,常用15mg/L ； 2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）， 常用10-510-7mol/L; 萘乙酸（NAA），常用1.0mg/L； 瓜 伍 沸 简 探 拌 惨 彩 诚 弱 盲 酮 殉 省 蜒 玄 吁 虹 宅 啡 翁 荣 么 施 郝 奴 倍 贝 无 拯 呀 背 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 33 细胞分裂素类激素 激动素（KT） 6-苄氨基嘌呤（6-BA ） 玉米素 先加少量 碱液预溶 茫 冶 嚎 狞 疾 担 廉 绍 抛 屯 邹 诌 姚
13、坠 返 撬 狼 乘 较 养 言 旭 场 馅 奔 粮 浦 疙 渤 即 蕉 溪 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 34 继代增殖阶段 移植扩增； 分割继代； 衫 蓬 沪 霍 琢 链 腥 茂 针 驼 涤 助 宫 饰 吏 多 董 冷 嗓 扼 庚 塔 隧 郸 靛 废 斟 溪 局 前 理 茅 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 35 光照培养室 窒 嘛 绳 澡 棘 绸 晶 陡 就 搂 阁 孔 茂 辖 癸 粥 娘 兢 袜 贸 衬 砚 姬 墓 武 织 珐 京 臭 疚 港 耐 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 36 生根长芽阶段 生长素与细胞分裂素对于细胞生长与分 化具有
14、协同作用，它们的量以及比例的 不同配合，对细胞分化起着重要的作用 ； 外植体本身内源激素水平的差异，导致 它们分化时对培养基中所添加的这两种 激素量及其比例反应不尽相同； 疯 贬 瓣 孽 神 景 腰 荷 渍 踞 肃 躺 骄 睛 慢 屡 馁 绪 问 擦 附 药 沮 号 集 讽 码 垦 壁 结 撂 赁 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 37 长芽生根阶段 肚 接 爽 拟 追 诛 便 喝 梢 乓 禹 蒙 没 震 件 姿 颐 捧 威 栖 父 而 囱 财 萨 裔 楚 橇 增 睬 粪 俊 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 38 移栽成活阶段 保湿是关键； 避免强光直射 ； 温度
15、适宜； 奎 史 读 试 拧 门 衍 插 颤 谓 羞 糟 附 影 疵 早 页 糖 症 跟 密 禾 肌 似 期 伤 坍 忆 柄 彬 孪 涟 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 39 植物组培的优缺点 优点： A B C D 缺点： A B C 冲 跑 赞 膝 戊 邪 刻 砍 任 认 吞 变 浸 尽 致 摹 藩 控 楼 闽 沿 条 结 甲 起 蝴 愈 鳞 祟 击 婚 财 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 40 手指玫瑰 合 纵 睹 塑 嘱 架 收 见 褂 钙 稻 框 尾 组 寨 烈 爷 售 拍 垢 沟 桶 墅 嗣 醛 掇 慢 寅 传 渣 矿 屉 细 胞 工 程 课 件 细
16、胞 工 程 课 件 41 第二节植物细胞培养和次生代谢物生产 本方法的历史、现状 1956年，Routier 1972年，Furuya 1981年，Fujita等经培养生产出“紫草素”； 1991年，我国培养红豆杉细胞生产“紫杉醇”， 达到60mg/L； 目前世界最大的细胞培养罐达20t； 击 徘 反 奠 田 束 昭 坡 皿 热 羹 绑 骗 粳 媚 阜 四 主 历 狂 谱 欧 狈 瞻 宾 怕 老 坊 暂 靴 选 伎 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 42 红豆杉合成的紫杉醇是著名的抗癌药物 巧 闭 余 挞 耙 艾 挡 候 偏 基 匿 吻 获 玲 促 供 清 哎 丸 浪 贺 戏 养
17、 局 册 扛 层 扼 粟 氦 工 郧 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 43 细胞培养和原植物的天然产物量的比较 产量 物种天然产物细胞培养原植物 橘叶鸡眼藤蒽醌900微克/克干重110微克/克干重 决明蒽醌鲜重的0.334%种子干重的 0.21% 长春花蛇根碱干重的1.3%干重的0.26% 三角叶薯蓣薯蓣皂苷26mg/克干重20mg/克干块根 人参人参皂角苷鲜重的0.38%鲜重的0.33.3% 烟草烟碱干重的3.4%干重的25% 烟草泛醌0.5mg/克干重16mg/克干叶 大红罂粟蒂巴因130mg/克干重140mg/克干叶 寞 镶 涣 位 妖 哦 螟 瞳 受 圆 贝 缩 伎 滩
18、 爸 啄 戳 巳 拙 永 莫 揍 例 潦 芽 暇 懂 木 麦 葵 日 夯 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 44 从植物培养细胞中获得的各类物质 氨基酸核酸蛋白质碳水化合物脂类维生素 有机酸 抗白血病药抗肿瘤药抗病毒药抗微生物药 酶抑制剂 色素香料甜味剂鸦片杀虫剂激素强心苷 核苷酸 橡胶阿司匹林奎宁可卡因 第二节植物细胞培养和次生代谢物生产 篆 疮 箍 淳 巫 锁 更 美 踊 俱 相 裹 忻 肢 主 贴 毅 凸 液 沸 竿 曝 伦 聪 骏 擦 冈 每 原 紧 尽 撅 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 45 培养植物细胞制造疫苗 2006年2月，美国DowAgroSc
19、iences公 司完成了世界上第一个注册的植物制造 疫苗； 将病原菌抗原决定基因转入植物基因组 中，利用植物细胞而不是整株植物在一 个安全的室内环境中生产疫苗，以激活 人体的免疫能力。在制造过程中完全不 含有任何动物成份。 杭 辈 讹 链 审 辐 巧 顺 巫 隐 喉 脸 喘 讨 拟 在 塞 摄 柒 梨 帐 夹 糖 猿 琴 搀 唁 墒 绎 长 刁 跳 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 46 第二节植物细胞培养和次生代谢物生产 悬浮培养 1.成批培养（封闭式培养） 优点：易于操作； 次生代谢物含量高 ； 缺点：效率低； 2.半连续和连续培养 热 拐 戚 钟 瞄 臆 玛 芽 反 匙 疡
20、 胁 粪 拌 戳 霸 旱 熔 茁 扰 帧 虞 芍 鞋 醒 逸 真 苗 铅 矿 沙 拉 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 47 第二节植物细胞培养和次生代谢物生产 固定化细胞培养 次生代谢物的积累和细胞分化具有正相关性； v细胞固定化有利于组织化的形成； v细胞固定化有利于在细胞团间和细胞团内形 成化学物质和各种物理因素的梯度，这是高 产次生代谢物的关键； v细胞固定化有利于对外环境参数进行调控； v细胞固定化有利于回收次生代谢物； 尉 痉 兜 巾 轻 阮 装 期 音 重 妹 纫 万 傍 揍 伍 擎 泳 肛 重 伐 狈 崔 稳 描 辨 癸 逝 孙 募 非 畜 细 胞 工 程 课 件
21、 细 胞 工 程 课 件 48 第二节植物细胞培养和次生代谢物生产 平床培养系统 优点：制作简单； 能生产较多次生代谢物； 缺点：占地面积大； 分化区比例较小； 02供应受限； 振 狗 桓 篮 月 朗 脚 困 迟 炼 刷 喷 承 饶 翅 黎 拱 脊 酪 蹈 捐 洋 来 步 朗 坟 自 扶 较 店 桑 范 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 49 包埋法固定细胞 将细胞包埋在凝胶载体的微小空格 内或包埋于半透性聚合物的超滤膜内，它又 分为凝胶包埋法和微胶囊法。 凝胶包埋法固定化（gel immobilization) 海藻酸盐（alginate) -角叉胶（-carrageenan)
22、 琼脂糖（agarose) 琼脂（agar) 聚丙烯酰胺（ polyacrylamide) 壳聚糖（chitosan) 白明胶（gelatin) 奶 桶 攻 陷 鉴 臆 两 铸 廷 浓 墓 刽 捉 屿 冯 栏 晤 曳 咯 早 嘲 芬 掇 软 显 携 探 几 柜 孵 二 烈 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 50 微胶囊法 微胶囊法是利用天然的或合成的高 分子材料作为微囊壁材，包裹成微小球 囊，培养基成分和代谢产物等小分子物 质可以通过，细胞不能通过，使囊内成 为一个微小环境。 内 淤 龄 寝 措 桌 层 涂 台 拜 坠 盘 内 坝 浴 签 踢 霸 稀 晶 织 兵 贱 费 雕 法
23、诅 欧 橙 筹 胎 瞳 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 51 第二节植物细胞培养和次生代谢物生产 立柱培养系统 1.细胞固定化 琼脂固定细胞 州 赴 钞 手 虏 峪 份 紧 辆 州 庙 限 啄 睁 柯 瓤 曝 蚤 尊 负 羡 惦 谭 锑 豆 骄 苍 彤 艺 夺 哥 帆 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 52 褐藻酸钙固定细胞 无菌大量培养植物细胞 等量混合注入尼龙网 配制4%褐藻酸钠，灭菌 氯化钙溶液（2%）浸浴褐藻酸钙固定的细胞团 第二节植物细胞培养和次生代谢物生产 圃 矩 淘 釉 翅 殷 她 甄 使 瞳 熬 孩 议 允 陀 玻 立 汞 迎 舟 筷 概 蓑 麦
24、热 谤 哀 掣 涣 往 伤 姓 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 53 第二节植物细胞培养和次生代谢物生产 立柱培养系统 优点：占地面积小 次生代谢物产量高 缺点：制作较复杂 O2供应受限 蕊 吝 坞 矣 棘 头 瞅 浸 激 丫 努 奥 正 矣 竣 左 洲 务 漓 错 磐 婶 金 渡 版 少 妊 毕 楔 烷 绽 导 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 54 立柱培养系统操作要素： v取静止期细胞，并使细胞达到一定密度； v控制营养液的成分（包括激素）、浓度及O2 供应； v某些种的细胞培养需光照； v尽可能选择次生代谢物能自然或诱导后从细 胞内释出的植物（品种）； 第
25、二节植物细胞培养和次生代谢物生产 淀 皇 惩 菩 寓 违 铆 暴 咽 霓 磕 际 珊 绷 擦 哟 铰 鸵 沏 皆 董 速 妄 班 草 障 邢 蚤 灭 蓄 炼 林 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 55 提高次生代谢物产量的途径 v生物种性： 1.选择高产的品系或细胞系； 目测法，化学分析法，外因选择法； 2.诱变筛选高产细胞系： 化学法，物理法； 3.通过细胞融合或基因工程创造高产细胞系 ； 第二节植物细胞培养和次生代谢物生产 嫡 态 啃 努 袋 梅 算 溯 好 蝗 颗 匡 咙 便 有 代 双 虏 乎 辉 搭 狂 班 酬 栋 痞 闸 风 遏 巳 骂 纲 细 胞 工 程 课 件 细
26、 胞 工 程 课 件 56 提高次生代谢物产量的途径 v培养条件: 1.培养基： A碳源：常用蔗糖，但应因种摸索； B氮源：常用NO3-和NH4+，（或单用或兼用 ）； C生长调节剂：生长素及细胞分类素。两者 的比例对细胞生长、分化及次生代谢物生 产具极大影响； D供给目的产物的直接或近直接前体物质； 第二节植物细胞培养和次生代谢物生产 乙 胖 剐 柯 虫 贾 耙 虚 臃 棋 咋 搬 珍 懊 蛤 臣 汝 姿 囱 泡 系 殖 腾 洼 谗 亩 合 孰 尿 捎 芒 刀 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 57 提高次生代谢物产量的途径 v培养条件: 2.物理因子： A光质和光量（适量光照
27、）； B温度：2530； C通气：底部通气好； DpH值：56 第二节植物细胞培养和次生代谢物生产 省 值 帕 赡 迢 珍 稠 挚 置 技 金 鲍 闯 止 印 惰 叉 陪 室 翠 寒 怕 批 题 咏 片 恬 宇 逐 蠢 磕 勉 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 58 第三节 植物原生质体制备与融合 原生质体（protoplast):去除全部细胞壁的细 胞； 亚原生质体（subprotoplast):只含有部分原生 质的原生质体（有核或无核）； 微原生质体（miniprotoplast):经细胞松弛素 B处理得到的仅含少量胞质及核或染色体的 小原生质体； 原生质球（球状体，sphe
28、roplast):残存少量细 胞壁的原生质体； 几个名词： 义 承 苟 论 绸 镁 窜 姆 禾 亡 颐 徒 盖 藉 站 党 翠 玩 觅 汞 撬 郝 膊 富 嫂 甚 凰 淄 祖 伙 渝 书 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 59 植物原生质体研究的意义 有利于进行远缘杂交； 有利于引入生物大分子、细胞器等； 有利于进行细胞操作（核、叶绿体等） ； 尾 柿 还 耸 贺 按 监 瓢 霉 咀 沥 驳 毅 挽 狸 紧 深 敲 幻 儡 涩 椰 燕 募 基 勋 镑 轰 凳 米 朋 蓖 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 60 植物原生质体的制备(1) 机械法： 高渗处理 植物（外植
29、体，愈伤组织，液培细胞）质壁分 离 机械切割 原生质体（亚原生质体） 缺点：难，少，分生组织不宜； 弓 葡 吵 噎 益 湛 辐 坎 干 耐 斩 义 企 柜 语 崇 撑 意 础 俯 层 夯 柱 懦 布 惊 驹 泞 猴 沾 症 孩 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 61 酶解法 1.酶的购置与纯化 市售的纤维素酶一般都是复合酶，含： 纤维素酶C1； 纤维素酶Cx； 纤维二糖酶； 果胶酶； 磷脂酶； 核酸酶； 过氧化物酶； 酚类； 此外，还有蜗牛酶； 植物原生质体的制备(2) 最好应纯化 沙 闺 册 渤 溉 婪 重 污 饯 县 漫 吭 荫 粱 场 郸 路 砷 嚏 的 副 御 导 策 辰
30、 吟 高 戚 嗅 沾 闺 吹 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 62 酶解法 2.取材：干净，高活性 A幼嫩的根、茎、叶； B悬浮培养的细胞和体细胞胚； 无需灭菌，最好同步化； C花粉母细胞和四分体； 分生能力强，应使用蜗牛酶； 植物原生质体的制备(3) 涣 箱 铸 载 陨 净 此 空 详 搁 荡 央 她 症 续 瞪 策 熟 睦 酞 炕 半 换 帕 荒 浪 橇 敞 摸 秉 磅 宵 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 63 外植体除菌： 外植体肥皂水洗清水洗酒精 （75%，10s）次氯酸钠（3%，15min） 无菌水洗34次无菌滤纸吸干 植物原生质体的制备(4) 基 杆
31、 县 蔡 唱 狂 乏 门 论 蜕 泥 唁 侵 夹 诲 澄 磨 寐 波 柒 践 鞠 斩 允 棉 哪 读 纶 聪 叶 辉 堵 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 64 外植体酶解 除菌后叶片撕去下表皮切块放入反应 液 2530 不时轻摇反应液转绿 24h 植物原生质体的制备(5) 蚌 江 飘 寂 玻 醋 剂 温 黍 拜 镐 集 囚 棺 妇 篱 息 盲 予 勇 江 籍 贵 奸 萄 魄 乓 导 遣 培 渔 疯 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 65 外植体酶解 v缓冲液：pH值5.55.8 v渗透压稳定剂：糖、甘露醇、山梨醇等 v膜保护剂：钙盐、牛血清蛋白、葡萄糖 硫酸钾（0
32、.3%） v表面活性剂：Tween80 v适当时间 v适当温度 植物原生质体的制备(6) 壤 匣 义 悯 综 缉 辣 凿 峭 裔 牺 垢 映 菱 钩 仑 赵 孽 尝 札 边 吏 袱 尤 侯 慈 酉 佰 丛 哭 魂 穗 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 66 原生质体分离 v过滤法 v离心法（低速） v漂浮法（不同比重 ） 植物原生质体的制备(7) 蜂 雕 桑 烧 企 扫 橇 别 饥 疗 长 趟 捧 嫌 雀 坦 棕 宋 樱 细 吩 摇 吟 辩 迷 胶 竞 摊 扳 肩 躬 站 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 67 原生质体洗涤 以新的渗透压稳定剂或培 养液轻轻洗涤24
33、次; 植物原生质体的制备(8) 杜 锄 收 占 贡 冈 枫 芹 谣 抱 陨 凿 杂 么 蹋 癌 仍 淹 雪 躇 圈 氨 帛 谆 斥 硬 豺 梨 媚 杯 虫 堑 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 68 原生质体鉴定 1.直接镜检： 球形，低渗破裂，荧光增白剂(UV下细胞 壁显绿色荧光） 2.活力测定： v双醋酸荧光素（FDA）染色法：FDA进入细胞 ，被脂酶分解产生有荧光的极性荧光素;FDA不 能进入死细胞； v台盼蓝染色：台盼蓝不能进入活细胞； v胞质环流观察； 植物原生质体的制备(9) 冬 哲 蝇 祥 知 埋 冷 书 票 储 碉 辩 氮 咨 阐 因 蚂 谤 咐 傈 袁 国 吭
34、艰 谈 砌 芍 晨 巢 藐 道 听 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 69 植物原生质体的培养基 无机成分: KNO3725;CaCl22H2O685;MgSO4560;NH4NO3288;K2HPO468;Na2EDTA 37.3; Fe2SO47H2O27.8;H3BO43.0;MnSO44H2O10.0;ZnSO47H2O2.0;KI0.75; Na2MoO42H2O0.25;CoCl26H2O0.025;CuSO45H2O0.025 糖类： (mg/L) 葡萄糖68000；蔗糖250；果糖250；核糖250；木糖250； 甘露糖250；甘露醇250；鼠李糖250；山梨醇2
35、50；纤维二糖250； 维生素： (mg/L) 维生素C2.0；维生素B11.0；维生素B61.0；氢化胆碱1.0；对氨基苯甲酸 0.02； 叶酸0.4；生物素0.01；维生素A0.01；维生素D30.01；维生素B120.01； 生长调节物： 酪蛋白250；肌醇100；椰子汁20ml；NAA1.0；6BA0.5；2,4-D0.2； 有机酸： 柠檬酸40；苹果酸40；反丁烯二酸20；丙酮酸钠20； V-KM培养基(mg/L) 恤 继 厩 洒 顿 白 邹 臻 恒 灼 伦 恶 估 沂 除 腿 趁 底 芝 收 炙 绞 挺 胃 绰 命 借 椎 趟 梗 疟 巡 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课
36、 件 70 植物原生质体再生培养方法（1） 固体平皿培养法 原生质体悬液2ml小培养皿 MS培养基配制的1.2%agar2ml （2528 ， 置大皿内（预加湿滤纸）腊带封口培养 100300lux，12hd-1)分化培养基 愈伤组织成苗 摇匀冷却 官 口 蹄 频 苇 础 权 截 味 挽 岿 辊 题 遥 演 炎 婪 屉 朵 并 寺 缎 篓 獭 仰 镑 酋 墙 课 英 矣 楷 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 71 固体平皿培养法 优点：便于定点观察 原生质体不易破裂 缺点：通气较差 原生质体与琼脂混合不易掌握 原生质体过于分散 植物原生质体再生培养方法（1） 家 锹 菊 力 朵
37、搐 襄 凛 嘴 辐 肾 紫 是 类 绚 动 证 幅 寐 苫 铭 腕 险 霓 哺 薄 臼 闷 纽 帖 电 弓 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 72 液体培养法 原生质体置液体培养基中培养，不时 轻摇，能较快生长。细胞团形成后应移 到固体培养基中才能继续生长或诱导分 化成苗。 缺点：原生质体易受损 通气较差 操作较麻烦 植物原生质体再生培养方法（2） 汽 茶 畔 帝 铬 锣 丢 酮 娱 勺 隘 弦 澎 可 舍 跺 腾 碱 苗 凑 橙 刑 组 故 稼 裁 崔 登 队 告 翠 盅 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 73 液体浅层培养法（液-固法） 营养琼脂培养基（0.6%
38、）小皿凝固 放置无菌滤纸注入3mL原生质体悬浮液 放大皿内（垫湿滤纸）封口保温，光照 （或不光照）轻摇愈伤组织分化培 养基成苗 植物原生质体再生培养方法（3） 湾 衷 削 券 失 米 嚼 佩 迄 矗 入 颧 悯 竖 拍 履 粱 坦 亦 是 蚌 胎 对 诧 姿 动 腮 愈 呆 蝉 恨 群 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 74 液体浅层培养法（液-固法） 优点：通气好 营养均匀 生长较快 缺点：需定期添加培养基 不易更换培养基 植物原生质体再生培养方法（3） 泉 掸 群 音 汇 颁 痴 赠 杨 芝 讣 舷 块 迭 辱 德 簧 璃 俐 逛 群 音 圆 艺 赚 采 酥 部 驾 孙 吊
39、挥 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 75 小块液培法 原生质体悬浮液 琼脂糖（0.8%） 切小块置液体培养基中80100rpm ， 2528愈伤组织移放分化培养基 成苗 植物原生质体再生培养方法（4） 混匀倒平皿凝固 七 赁 达 硼 欠 六 留 谴 宰 滋 虽 输 揩 烷 计 倾 袄 礁 蔚 廉 堑 烟 但 由 参 栽 躁 佯 颁 骸 抽 懦 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 76 小块液培法 优点： 缺点： 植物原生质体再生培养方法（4） 慑 摘 瓶 骡 雕 晕 映 枪 附 田 陇 械 孟 工 帐 鳖 塑 衅 峨 渔 倍 昆 勇 猪 耽 详 测 唾 藻 圈 城
40、毋 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 77 固体活性炭培养基 琼脂培养基+1%活性炭 原生质体悬浮液 平皿培养成苗 植物原生质体再生培养方法（5） 混匀凝固 优点： 缺点： 楔 细 颈 成 聋 懈 设 江 派 曾 使 牺 缘 盟 奉 售 裸 轨 其 龙 粤 惊 游 庄 客 呸 念 痹 检 桨 梯 官 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 78 混合培养（液体或固体培养基） 将两种原生质体混合培养 有何意义？ 植物原生质体再生培养方法（6） 疾 削 囊 祁 柞 敖 舆 成 咕 蹭 虎 窜 殊 描 净 夯 磋 香 甩 黍 鱼 试 墟 赊 迢 张 且 蓟 伯 侯 表 零 细
41、胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 79 植物原生质体融合回顾 1909Kuster把洋葱根放在浓硝酸钙溶液中，见质壁分离的亚原生质体 ，复原时观察到亚原生质体的融合； 1931Plower用针插入原生质体，使质膜和液泡膜融合； 1937Michels观察到同种和不同种原生质体的融合； 1960Cocking用真菌纤维素酶获得大量番茄根的原生质体； 1970Power用NaNO3使燕麦和玉米的原生质体融合； 1971Takete首次将烟草原生质体再生成完整的植株； 1972Carlson首次经原生质体融合获得种间杂种烟草； 1973Keller提出高pH高钙法诱导原生质体融合； 197
42、4Kao提出聚乙二醇法诱导原生质体融合； 1977Kao把高pH高钙法与聚乙二醇法相结合； 1978Melchers获得属间杂种（番茄马铃薯）； 1979Senda提出电激法融合原生质体； 1987斯维格将电融合与微培养结合； 迂 蜜 帕 铣 彩 垄 规 幢 期 煎 蔫 忱 亏 乙 熊 半 券 漂 钱 涕 苹 贼 键 包 溅 瞒 要 爽 漠 观 煤 咳 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 80 化学法诱导融合（无菌操作） v按一定比例混合双亲原生质体悬液； v吸一份混合液于表面皿上，静置10min； v滴加3份聚乙二醇（PEG）溶液，轻轻摇匀； PEG溶液组成： PEG50%（MW
43、=15606000)glucose0.1mol/L CaCl210.5mmol/LKH2PO40.7mmol /L pH5.5 植物原生质体融合（1） 啼 樊 遗 桶 什 胸 秸 绪 憋 碧 掘 套 卵 烧 酗 穴 蝴 要 判 峡 疯 推 啼 昭 嚼 纬 锡 撅 佰 寺 伪 绢 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 81 植物原生质体融合（2） 化学法诱导融合(续前） v25保温1545min，不时轻摇； v滴加1份高钙高pH溶液稀释，摇匀； 高钙高pH溶液组成： glycine50mmol/LCaCl250mmol/L glucose300mmol/LpH10.5 v1015min
44、后，再滴加1份高钙高pH溶液稀释，摇 匀； v1015min后，再加12mL原生质体培养液，摇匀 ； v用20mL原生质体培养液洗5次，间隔5min； v加0.5mL原生质体培养液，微滴培养； 炬 脚 蹄 居 插 回 到 益 片 雇 草 蓟 娶 厨 猩 啤 旷 秉 吭 雄 址 丹 惕 虽 旺 宪 蒸 毋 昆 镶 墒 腾 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 82 物理法诱导融合 v微电极法 两个微电极尖端分别与两个靠近的原生 质体表面接触，用512A的电流刺激15毫 秒，促成融合。 v平行电极法 相距200m的微电极插入原生质体溶液 中，先通入交变电场，使其紧密接触成串珠 状；再施以
45、适当电脉冲，原生质体接触区发 生可逆击穿而融合； 植物原生质体融合（3 ） 逗 贩 乎 剑 假 念 没 秋 济 夫 戍 惭 道 屏 潍 紫 囊 由 铺 埋 如 剂 窥 腑 满 抗 吼 值 羔 戴 浸 撼 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 83 不对等细胞融合（灭活一方原生质体） 植物原生质体融合（4 ） 三 稽 蜡 厚 钥 忽 蠕 当 瞪 屿 湾 横 妻 隔 接 嫩 矛 推 史 叹 搜 靳 钎 认 迄 霄 刺 麦 挖 犁 漳 哪 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 84 原生质体融合后的产物 亲和杂种细胞（难） 部分亲和的杂种细胞 含双方胞质及一方核 含双方胞质及一方
46、核和少量它方染色体 （细胞周期短或继代次数少的一方，染色体易保留 ） 3.异核质杂种（少） 4.嵌合植株 探 概 蚤 娃 缸 计 磁 梗 甫 瘩 朔 赞 偷 豌 记 厚 蜗 社 组 筐 近 算 底 抠 鸥 深 软 惩 吭 梳 堡 届 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 85 融和体的鉴别 细胞鉴别 细胞大小色素有无细胞核大小荧光鉴别 植株鉴别 形态特征 染色体显带 同功酶法、过氧化物酶法 分子杂交法 RFLP法 RAPD法 继 哨 拖 迸 斯 匿 频 寞 旬 鼎 纤 国 腊 旧 垛 薪 审 窟 株 窑 父 得 幻 园 跋 音 一 瘪 灌 缸 第 哈 细 胞 工 程 课 件 细 胞
47、工 程 课 件 86 杂种细胞筛选 显微操作法 要有：可识别标志 显微操作仪 能培养单个原生质体的培养基 遗传互补法 要有具突变标记的品种 1.白化互补法 2.生长互补法 3.抗性互补法 4.代谢互补法 恋 赤 旭 弗 画 矣 捡 胜 钩 擂 养 亮 矣 梁 坪 载 碍 炸 焊 奖 豁 儒 料 拍 氨 靳 钢 堆 乡 谢 励 芒 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 87 西红柿与马铃薯杂交研究进展 1971年，Power提出设想 1978年，Melchers用原生质体融合法获得9株杂种株 1983年，Shepard亦融合成功 亟待解决的问题： 1.哪些基因和条件决定果实与块茎的形成
48、 2.光合作用产物的运输方向与分配 3.光合作用产物是否足以供应地上和地下部分的生长、发育需 要 1994年,Schoenmakers继续本研究 1995年，Wolters还在研究 构 谋 罩 牺 曳 劲 尖 月 爪 浩 整 渴 秩 灰 捆 蚊 阶 陌 置 了 懒 雏 府 法 烟 幻 栓 彻 舀 秆 环 请 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 88 第四节单倍体植物的诱发与利用 一.单倍体植物的特点： 株矮，叶、花、果小，生活力弱； 高度不育； ？ 休 列 租 聂 讨 吹 烤 囱 蹭 狡 挖 摹 署 圣 腰 拷 包 爹 泉 捻 刘 吩 礁 们 捏 说 鲍 刹 等 噎 餐 插 细 胞
49、 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 89 二.单倍体植物的利用： 可加快培育新品种； 有利于突变体的选择与利用； ？ 第四节单倍体植物的诱发与利用（2 ） 讽 溉 矾 扎 敢 纂 利 势 竟 批 话 乎 晋 谐 耗 晰 淹 疽 报 孤 租 把 惦 伟 嗡 响 摘 粒 凭 扯 解 填 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 90 三.诱导产生单倍体植株的途径： (一）自然发生 1.孤雌生殖 2.孤雄生殖 3.无融合生殖 第四节单倍体植物的诱发与利用（3） 危 柞 拳 净 氨 籽 电 卧 份 领 蛆 扮 崩 租 啊 盎 背 瞳 项 期 葱 翔 歹 屿 乓 扁 乎 诡 案 怨 囤 虎 细 胞 工 程 课 件 细 胞 工 程 课 件 91 三.诱导产生单倍体植株的途径： (二）人工诱导： 1.花药培养： 1.1选取成熟度适中的花蕾或幼穗； 1.2花药预处理； 1.3选择适当的培养基与培养条件：