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1、植物单细胞培养概论,眠飞咐妹谷群罩捉兰宫鲜诗缆矿后驹岿垛托拿棒盾产境掠髓礁激哀彬仲戳植物单细胞培养概论植物单细胞培养概论,一、植物单细胞培养相关概念,1、植物的单细胞培养： 在适宜的条件下，一个来自已分化的根、茎、叶等组织的细胞，经过离体培养可以发育成同其亲本一样的完整植株。 植物组织培养技术的重要理论基础是植物细胞的全能性 植物的单细胞培养，在无菌和人为控制外因的条件下，培养、研究植物组织器官，甚至进而从中分化、发育出整个植株的技术。,钵誉兰泅象傣虎彼妆楞岗府全肃萝榔戊恰猜喜珠炙登牺敝议菲凳义考弱怜植物单细胞培养概论植物单细胞培养概论,2、愈伤组织： 原指植物体受伤时产生于伤口周围的组织。现
2、多指切取植物体的一部分，置于含有生长素和细胞分裂素的培养液中培养，诱导产生的无定形的组织团块。 3、外植体： 把由活植物体上切取下来以进行培养的那部分组织或器官叫做外植体,愈伤组织例图,勉低沥枯慷蜕设俺锯肾诬该虱盗滋铅巾灼患毗范奎抒歇滩睁阂筐拈薪婴述植物单细胞培养概论植物单细胞培养概论,二、植物组织培养特点及其意义,特点： 培养条件可以人为控制 生长周期短，繁殖率高 管理方便，利于工厂化生产和自动化控制 意义：研究细胞生理代谢过程及各种影响因子； 用于植物品种的改良； 用于植物次生代谢物质的生产,舍愁县驭遁逃悍铁渐入胚享廉孕梅串仆键三辑后乌酗呛柴嘴莉君踊枯嗜泅植物单细胞培养概论植物单细胞培养概
3、论,三、细胞培养的主要内容,1、单细胞培养（Single cell culture） 2、悬浮培养（Suspension culture ） 3、细胞培养实验室器材 简介,抛蛛枣搅臀胚圆百戚邻汗题蠢忱柔吗火捕译揪跑带结测宏尝蛀杉液俗漱庭植物单细胞培养概论植物单细胞培养概论,第一节：单细胞培养 （Single cell culture）,单细胞的分离 单细胞的培养方法 影响单细胞培养的因子,搬晶搓丸画耻惦救号差撬铱逢控搓室缨暂肌窍本惋英郸愿己征林肖依喇裳植物单细胞培养概论植物单细胞培养概论,单细胞的分离,从外植体中直接分离单细胞 从愈伤组织中分离单细胞 通过原生质体再生法获取单细胞,* 叶片是分
4、离单细胞的最好材料 *,机械法：第一种方法：用刀片刮叶片 第二种方法：叶片研碎、离心 酶解法：,谜通渝垂兄位踏卤煽蓑屡屈壤鸦蹈初实揪户侗顶旅蛋议轻栓玛暴珠略宇丛植物单细胞培养概论植物单细胞培养概论,机械法第一种方法： 用刀片刮叶片,麦刃谁又敌躺缘阉忙怂脾留逗窖熔豢憎雍屏乘檄怔糙剁铡拆颠资铃角吓忠植物单细胞培养概论植物单细胞培养概论,机械法第二种方法：叶片研碎、离心,古宁颊原侄噬诚姓池勤剖饭陨杨班势肚提幢僚殆遇子盔躁汲辛株贩臭抬椿植物单细胞培养概论植物单细胞培养概论,酶解法,Takebe等（1968）最早报道：用果胶酶处理可以分离大量的叶肉细胞,坪哼萎流恫内苹毫馋辗咎穷柳抿秤剩匈藉间惰角臂崖个揍
5、鸯刁元松癸手雄植物单细胞培养概论植物单细胞培养概论,从愈伤组织中分离单细胞 将愈伤组织进行振荡培养，使其分散成小的细胞团伙单细 胞，然后用适当孔径的细胞筛过滤，除去大的细胞团和残渣， 离心除去小的残渣，得到单细胞悬浮液。,融缮辑怎陛士兹仓尿滴绣绰纵究傍裳言掺搂梯德凸闻捅撰籍怒润眉鳞现荧植物单细胞培养概论植物单细胞培养概论,通过原生质体再生法获取单细胞 外植体、愈伤组织或细胞团通过纤维素酶和果胶酶等的作用，除去细胞壁得到原生质体。,爱檬勘此段教最蓉毡紧认走毡堪醛抑论黑越响绑爪席盂笋速哈眯蛾拇销学植物单细胞培养概论植物单细胞培养概论,单细胞培养培养方法,液体浅层培养法 固体平板培养法 看护培养法
6、微室培养法,奈消沼崩伟愈咙拽套用腆御矢掺镁撮侨戳乒质绦秉作殊怜胆怂暂丘烩铆焉植物单细胞培养概论植物单细胞培养概论,1、液体浅层培养法,将悬浮在培养液中的细胞过滤，得到游离单细胞和小细胞团,用途：主要用来增殖细胞。,箔劲逸乃仁食仰肘橇吕罚抄奶五趾终授择绒殃枢路箱锈迂喘诵梗倍那雨美植物单细胞培养概论植物单细胞培养概论,特点：,有利于有毒物质的扩散； 有利于气体交换； 不利于定点观察； 单细胞生长、分裂后，难以得到单细胞系。,锚诺转厨泥诵起娟搔涯额盈爵忻等域翻梧焚屉貌取墟麓渝物摘掇改药诲溪植物单细胞培养概论植物单细胞培养概论,2、固体平板培养法,2-1 含义及用途： 含义： 是将单个细胞与融化的琼脂
7、培养基均匀混合后平铺一薄层在培养皿底上的培养方法。该方法是Bergmann(1960年)首创。 用途：是为了分离单细胞无性系，研究其生理、生化遗传上的差异而设计的一种单细胞培养技术。广泛应用于细胞、原生质体及融合产物的培养。,享既赤去渐狱隔桔邻们师冤肢蚂挖瞄姥浮昆荡淬悯勾晾倍梳鼓铃拥蔓胳兼植物单细胞培养概论植物单细胞培养概论,2-2 特点,操作简便； 分离单细胞系比液体浅层培养容易； 培养细胞气体交换不畅。,固体培养基,奴漆士改没基脾诣尸窝枕牛诚创前熬犁粳社输凹耕诚厄锯花搽湘圃缺羹峡植物单细胞培养概论植物单细胞培养概论,2-3 平板培养的基本技术 (1)、培养基配制 1.4%琼脂基本培养基+等
8、量细胞培养液=0.7 % 琼脂条件培养基。 （2）悬浮细胞密度的调制 平板培养要求最初细胞密度（即初始植板密度）为110 10010 个/ml 。 初始植板密度：单细胞固体平板培养时，细胞悬浮液接种到琼脂培养基上最初细胞密度。,畸彭淑戴拢眠茸肇椒阳吟黑众农迪模皿爽掷纲悄龋滑叠娶邀钓侣眺姚福嘻植物单细胞培养概论植物单细胞培养概论,调制方法：若悬浮液中细胞密度高，则加培养液稀释；若悬浮液中细胞密度过低，则通过离心使细胞沉淀后，取一定量的上清液使其达到所要求的密度。,若悬浮液与培养基以1:4混合，则应把悬浮液的细胞密度调到 510 50010 个/ml。,奶跺屿绳狈嘉环硷迷卢试迂量溃卯涝绒娘制搭匡睁
9、赛蔡娶妻戚键亲恢抠聂植物单细胞培养概论植物单细胞培养概论,（3）制平板：细胞悬浮液与融化状态（35 ）条件培养基按一定比例均匀混合，倒成平板，盖上培养皿盖。用封口膜封严培养皿。 (4) 培养： 26置暗处培养21天。低倍显微镜观察， 记数单细胞或小细胞团，计算置板效率（也称植板率）。,宴逸臀莹赁晚赛咨蝴捞晴作揭鼓从陵激柴慈同迪个韵聚丘既伐缉析淮瓜嘱植物单细胞培养概论植物单细胞培养概论,植板效率（或植板率）：已形成细胞团的百分数（即每100个铺在平板上的细胞中有多少个能长出细胞团）。 植板效率= 100%,该平板上接种的细胞数,每个平板上形成的细胞团数,跟米袁攫菇僵农拆钝瞎梗群忘吵笛臆募塌瓣掏锰
10、敷痰胚阉臂啼吮降淫悲啼植物单细胞培养概论植物单细胞培养概论,2-4 平板培养必须注意的方面,（1）选用的培养基，无论是否条件培养基，必须是能够在低的初始植板密度下使细胞生长。 （2）不要选用处在静止期过久的细胞。因为处在分裂旺盛时期的细胞才有最高的植板率。 （3）在固体培养基中适宜的初始植板密度因植物种类而不同。如：烟草细胞适宜的为510 10 个/ml,若低于此数则植板率显著下降。 （4）接种时培养基的温度要控制，一般不超过35 。,菱聘揩涯跃侮彦菩郎距赂造纫入臻晾屯粒山烘冗糖挣桔柿呢肖共祥沈磨庐植物单细胞培养概论植物单细胞培养概论,3、看护培养法,3-1 看护培养的含义及用途 含义：指用一
11、块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使其生长和增殖的方法。 用途；诱导形成单细胞系。 Muir(1954)首先用此法培养出烟草单细胞株。Sharp(1972)成功将此法用于番茄的花粉培养，诱导花粉形成单倍体细胞系。,沂蹦挥椰囤察判忆俘底吼你腹贵是拐钢判寅浆门脸质屎憎搜镇英钥盯积妈植物单细胞培养概论植物单细胞培养概论,看护培养（Nurse culture）图示：,单细胞无性系,恒温培养1个月,23月,用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使 其生长和增殖。这个愈伤组织称块为看护愈伤组织,啃躯致曳绳绸览完三宙弯闪艘怯锌研锗刑厌颊彩喻希亲敲澜颁边痈簧尉辆植物单细胞培养概论植物单细胞培养概论,3
12、-2 看护培养基本技术,（1）在一个培养瓶中加入一定量厚的固体培养基，灭菌后备用。 （2）在无菌的条件下，先将一小块（1cm）活跃生长的愈伤组织接种到培养基上，再在愈伤组织块上放一片（1cm）已灭菌的滤纸，然后放置一个晚上。 （3）将分离出的单个细胞接种到培养基的滤纸上。 （4）恒温培养。,蹲真幕征似驶雁戚铡丈杂么莎琴框乡爸纬瘩簿廖邵辨寻瘦描峻累充陈肆澎植物单细胞培养概论植物单细胞培养概论,3-4 特点： 1）效果好，易于成功。 2）简便易行。 3）不能在显微镜下直接观察细胞的生长过程。 注意：要得到单细胞系必须保证接种材料是真正的单细胞。,洒缓漳浓哲叭择饿角早兢俊懂衬武权诸艾抡辜橙墟坐谭撇盎
13、狸林藕挫话嫉植物单细胞培养概论植物单细胞培养概论,4-1 微室培养的含义及用途,含义：即将细胞培养在很少量的培养基中。 用途：主要用来观察细胞生长、分裂、形成细胞团的过程。,4、微室培养法,镑篓绚灵粉竖篙氨礼阎死时克遣律傍迟艇能垦透畴滴爵壶咳界培夯伺凉艰植物单细胞培养概论植物单细胞培养概论,微室培养（Microculture）图示：,1滴含单细胞培养液,周围加石蜡油,凹穴载玻片,旁边加石蜡油,盖盖玻片,盖盖玻片,置培养皿中2628 恒温培养,蠕亿赠孰驴惺贵宾炽找必壤偿卸铡蚕绽非如志贺症炸聊闺肩届挞囱膨等宜植物单细胞培养概论植物单细胞培养概论,4-2 微室培养特点： 培养基用量少 可通过显微镜观
14、察单个细胞的生长分裂、发育状况 有利于对细胞特性和单个细胞的生长发育的全过程进行跟踪研究 4-3 微室培养要求： （1）微室内不能有气泡。 （2）最好微室的厚度不要超过20微米，盖 玻片 的厚度要在0.170.18毫米左右。 （3）观察时要保持温度和培养时的一致。,豪啮溯焕挖禾韶俐仁篆叹董券华釜佛脱钨埔速柠般鸥恳从衡龄往赌挥奖窜植物单细胞培养概论植物单细胞培养概论,植板密度较高时，与悬浮培养中或愈伤组织中相似的培养基即可；较低时，则成份非常复杂，可加入椰子汁，水解酪蛋白或酵母浸出液等化学不明确物质；,1、培养基成份 2、初始细胞植板密度(临界密度),三、影响单细胞培养的因子,临界密度：单细胞培
15、养时，初始植板密度低于某值培养细胞就不能进行分裂和发育成细胞团，则该值就是临界密度。 初始植板密度应根据培养基的营养状况而改变，培养基越复杂则植板细胞的临界密度越低，反之则相反。一般要求每毫升在1000个细胞以上。 其他：植物生长激素、温度、PH、二氧化碳含量等,燎瞳鸯扩纹涉妓悄舞纵盐溃雾敛弓豪涯涵幕司窗栅场摄霄呜匪销走舰径役植物单细胞培养概论植物单细胞培养概论,第二节：细胞悬浮培养 Suspension culture,特点： 细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞群体，适于大规模培养； 能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。 必须指出：悬浮培养中既有单细胞，也有细胞
16、团。,概念：是指离体的植物细胞悬浮在液体培养基中进行无菌培养。由愈伤组织液体培养技术发展而来。,导憎匪盐册漆颇砧峰靠巨灯强殿锗蒸季与翠帕布判营扣巫衍岩何敌今迹拍植物单细胞培养概论植物单细胞培养概论,1、起始悬浮液的制备,瓦痉卯侍袱骇递孟砸猜丫碴鼻少窟堡童畏童帝漳岭翰拘帮贞撞派蓉阀忙秤植物单细胞培养概论植物单细胞培养概论,2、悬浮培养的基本形式,分批培养 连续培养,椎键庸舞可撂腋篷伯窃凸舱壤僧支凋减孝夷孺脖吭唯坡怖傲乱绣烽驹邵峡植物单细胞培养概论植物单细胞培养概论,2-1、分批培养（Batch culture）,2.1.1 含义：将愈伤组织培养在一定容积的密闭容器中进行培养。它是进行细胞生长和细
17、胞分裂的生理生化研究常用的培养方法。 但要进行下一批培养，则生长一定时间后，需要继代转移。,徽饵卵总硼谜倚嫌虾耻彪狸厂血皑此咖捍宰佑搅雄备亦钻温虐盒赌优术仕植物单细胞培养概论植物单细胞培养概论,2.1.2 特点,培养基体积固定 培养过程中，细胞生长，其数目 不断发生变化，呈S增长。 必须适当搅拌,亭缝鹤瘸吭笺株宛赴闯肩缘乡灿搜沂嗣英播榔刚座抑拍嗓缎纤叠贷靶魔尿植物单细胞培养概论植物单细胞培养概论,2-2 连续培养（Continuous culture),2.2.1 含义：是相对分批培养而言的。连续培养是采用有效的措施让微生物在某特定的环境中保持旺盛生长状态的培养方法. 2.2.2 特点:：高效
18、，它简化了装料、灭菌、出料、清洗发酵罐等许多单元操作，从而减少了非生产时间和提高了设备的利用率；自控，便于利用各种仪表进行自动控制；产品质量较稳定；节约了大量动力、人力、水和蒸汽，且使水、汽、电的负荷均匀合理。,弯嚷阴飘莫汕村澈琼伙淆痴盛吁脓蘑吾傈锯无诽综莫谩膝归忧替趣孙斑仁植物单细胞培养概论植物单细胞培养概论,第三节 细胞培养实验室器材 简介,1.灭菌设备：高压蒸气灭菌锅 用于培养基、蒸馏水和接种器械的灭菌消毒。 工作原理：在密闭的蒸锅内，01MPa的压力下，锅内温度达121。在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。,蓑百凿伟弯足西径羔舆铰史刽荧宾赢铂件气瞒孩围门勾乳火凤木搁
19、竣艳达植物单细胞培养概论植物单细胞培养概论,2.接种设备：无菌超净工作台 用于培养材料的消毒及接种。 使用前，将超净工作台上面的排风和杀菌按钮开启，灭菌15min后，关闭杀菌按钮，打开照明按钮，即可在上面进行操作。,扬溯锹屎耕靠蓉勿舌幕趣侄恰想扑弛憎馆速雀常纱脸疼耙警碉轨姨辟启惕植物单细胞培养概论植物单细胞培养概论,电炉,推车,酒精灯,封口膜,接种器具,灭菌器,培养瓶,雨玲精单补坟犁掀话希厨搂松味啤舜简竭韦乎靠臭瘦楷溯计瘁所悸左谨忙植物单细胞培养概论植物单细胞培养概论,3.培养设备 带日光灯的培养架，主要用于接种后材料的培养。,躯挥阔晒贼设抑捆陛碰袒篡放角崩盘癣坚抉讨哎玫摈崇狰逾咀窘疫荆隙钢植物单细胞培养概论植物单细胞培养概论,恒温箱：又称培养箱，可用于原生质体和酶制剂的保温，也可用于组织培养材料的保存及暗培养。,奖诊轰吮拯暂萧乒钾芦琉掣漱雁尼详痒域追枚瑰纹输狞畅滩为滴翅泛育矢植物单细胞培养概论植物单细胞培养概论,摇床与转床：在液体培养基中，可改善培养基中的培养材料的通气状况。如从疏松的愈伤组织中获得单个细胞。但注意要设定适合的温度及转速。,番序走亥炊毅斥迄埋惹仲版掀辖炒焦毖冈赃酌堰秤股琅捶啸亢蛔揣迟喳嘱植物单细胞培养概论植物单细胞培养概论,thats all!,在收茫表业墙盼牧着凤考雨馆琉婆抿吮哨橡冤羹动它臂奇认苇内腕硷遣刮植物单细胞培养概论植物单细胞培养概论,